一种GATA2蛋白可结合DNA片段及在GATA2活性检测中的应用

摘要

本发明涉及一种GATA2蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个GATA2蛋白结合框；还涉及该DNA片段的应用；还涉及一种用于检测细胞内GATA2转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内GATA2的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析GATA2作为转录因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种GATA2蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内GATA2转录调控活性中的应用。

背景技术

GATA结合蛋白2(GATA2)由GATA2基因编码，是转录因子GATA家族成员之一。目前研究发现：GATA2对参与造血及内分泌系统肿瘤细胞的增殖与分化的基因起到重要的转录调控作用。GATA2通过其C端锌指结构，结合位于靶基因启动子、转录起始位点的上游或接近启动子区域从而发挥其生物学功能。

GATA2蛋白作为转录调节因子一直备受关注。研究表明：在实体肿瘤中，GATA2高表达与前列腺癌的预后不良及复发密切相关。除此之外，GATA2在人类乳腺癌细胞中高表达，通过抑制PTEN基因转录，促进肿瘤细胞增殖。然而，也有报道在肝细胞肝癌中，GATA2表达降低，且与肝细胞肝癌的不良预后相关。因而，GATA2可能作为不同类型肿瘤预后判断的新型预测因子。

然而，目前检测内源性GATA2仍然依靠的是Western Blot技术，这类方法虽然特异度高，但灵敏度低，而且操作复杂，检测到的只是GATA2蛋白含量的差异，并不能直接体现其活性的改变，而GATA2的活性与肿瘤的发生发展有着密切的关系，我们需要检测的不仅是GATA2的转录本或蛋白质含量，而是需要检测GATA2结合至有效位点以影响转录的活性。因此，找到一种简单可靠的检测内源性GATA2活性的方法对于GATA2的研究显得极为重要。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内GATA2转录调控活性的方法。

发明内容

发明人通过研究发现，GATA2蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性，其结合的DNA核心序列为T/A(GATA)A/G。

基于以上研究，本发明提供了一种GATA2蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个GATA2蛋白结合框，所述GATA2蛋白结合框的序列为5’-T/A(GATA)A/G-3’。

优选地，当包含多个GATA2蛋白结合框时，每两个相邻的GATA2蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的GATA2蛋白结合框之间的间隔序列为所述间隔序列为AG、AC或AA。用多个结合框可提高GATA2蛋白的识别和结合效率，提高灵敏度。

优选地，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示。在研究过程中，我们试验了多种组合，结果发现该序列的DNA片段比其他组合方式对GATA2蛋白的结合效率更高。

本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内GATA2转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内GATA2转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

S1：将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内GATA2转录调控活性。可将报告基因的表达强度作为指示GATA2转录调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所述荧光素酶I与所述荧光素酶II激发产生的荧光波长不同。将GATA2转录调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。

优选地，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与HindIII位点之间得到。

优选地，所述对照质粒为phRL-TK。

优选地，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

优选地，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量GATA2转录调控活性的指标。

通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内GATA2的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析GATA2作为转录因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

附图说明

图1为Kpn I与Hind III对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染有pGL3.0-Basic和pGL3.0-GATA2-Luc的人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa和人胚肾细胞系HEK-293T细胞中的相对GATA2活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图；

图3为分别转染有pEGFP-N1(即，空载体)和pcEGFP-N1-GATA2的人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa和人胚肾细胞系HEK-293T细胞中的相对GATA2活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建GATA2蛋白可结合的DNA片段

发明人对GATA2进行研究分析，发现GATA2蛋白结合的DNA序列为5’-T/A(GATA)A/G-3’，合成该DNA核心序列时，将这段DNA核心序列重复四次，以AG、AC或AA碱基进行间隔，并连接至携带萤火虫荧光素酶的表达载体(pGL3.0-Basic)中，构建成功后，该荧光素酶报告基因表达载体即包含四个重复的GATA2蛋白结合的DNA核心序列，以AG、AC或AA碱基进行间隔，其序列如SEQ ID NO:1所示。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入Kpn I酶切位点的粘性末端(CATGG)，在3’端加入Hind III酶切位点的粘性末端(TTCGA)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如SEQ IDNO:2和3所示，这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含Kpn I酶切位点粘性末端和Hind III酶切位点粘性末端的双链DNA片段。100μl退火体系如下：Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl，余下为ddH₂O。

充分混匀后，设置PCR仪程序进行退火反应，具体程序为：95℃退火2分钟(目的是让DNA oligo充分变性)；每90秒下降1℃，降至25℃后结束反应。DNA退火产物用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定(由于DNA片段较小，电泳鉴定无法看到单一、特异的条带)，测浓度后置冰上备用。

2.将GATA2蛋白可结合的DNA片段插入荧光素酶表达载体

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述pGL3.0-Basic空载体进行双酶切，20μl酶切体系如下：10x QuickCut Greenbuffer 2μl，Kpn I 1μl，Hind III 1μl，pGL3.0-Basic空载体1μg，余下为ddH₂O。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链DNA连接至pGL3.0-Basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下：DNA连接酶(购自TAKARA公司，货号为6022)5μl，双链DNA片段与经双酶切的pGL3-Basic载体共5μl。为促进酶连成功率，将DNA片段与载体的摩尔比控制在8:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于PCR仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有GATA2蛋白结合的DNA片段的pGL3.0-Basic表达载体)转化至大肠杆菌。具体方法如下：取解冻后的感受态大肠杆菌DH5α，加入上述连接好的重组质粒，轻柔吹打，冰上孵育20分钟，42℃热休克60秒，冰上静置3分钟，然后加入450μl不含抗生素的LB液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时(37℃，200rpm)。取复苏后的菌液至铺有固体培养基(含氨苄青霉素)培养皿上，用玻璃铺菌器将菌液均匀地铺满整个平皿，放置10分钟后，倒置于37℃孵箱过夜后，观察细菌生长情况。挑取菌落至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基，摇菌(37℃，200rpm)繁殖12 小时后提取质粒，1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker，泳道2和3显示为阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认DNA片段已整合至pGL3-Basic载体上.至此，含有GATA2蛋白结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体(以下均表示为pGL3.0-GATA2-Luc)构建成功。

3.pGL3.0-GATA2-Luc转染细胞

本发明实施例采用人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa、人胚肾细胞系HEK-293T进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为TF20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，Neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pGL3.0-Basic空报告基因质粒、pGL3.0-GATA2-Luc(含有GATA2蛋白的核心DNA结合位点序列的pGL3.0-Basic报告基因质粒)、phRL-TK(带有海肾荧光素酶基因的质粒)、pcEGFP-N1-GATA2(GATA2过表达质粒)。

4.计算GATA2的活性

以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算GATA2活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xPBS清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为GN201-01)进行检测。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性，将pGL3.0-GATA2-Luc重组质粒转染至细胞中，检测GATA2报告基因系统的活性，测定结果如图2所示，处理组(转染pGL3.0-GATA2-Luc)荧光活性明显高于对照组(转染pGL3.0-Basic空载体)。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测GATA2活性，将pEGFP-N1-GATA2转染至细胞，结果如图3所示，外源导入GATA2后，阳性处理组(转染pEGFP-N1-GATA2)荧光活性明显高于对照组(转染pEGFP-N1空载体)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种GATA2蛋白可结合DNA片段及在GATA2活性检测中的应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagataaga actgataaca aaagatagga agtgatagca 40

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagagataag aactgataac aaaagatagg aagtgatagc aa 42

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctttgcta tcacttccta tcttttgtta tcagttctta tctctggtac 50