一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法

摘要

本发明公开了一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法，本发明中的CDs荧光信号稳定、尺寸小，较其他的荧光量子点具有水溶性好和生物毒性低等优势，不仅能够克服同位素示踪、电子自旋共振，色谱分析等技术的缺陷，且具检测线性范围广、精密度高、检测限低等优势。

说明书

技术领域

本发明属于活性氧检测技术领域，具体涉及一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法。

背景技术

活性氧对生物体十分重要，但过量会对生物体产生氧化损伤导致细胞死亡。由于活性氧寿命短、反应活性高，且大部分都存在于体内很难被捕获，因此活体中ROS的直接检测对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义。目前能够用于解决该问题的方法比较有限，已报道的电子顺磁共振技术(electron paramagnetic resonance，EPR)是一种检测自由基的波谱学方法，可以直接检测·O₂^-、·OH等活性氧自由基及参与其形成的过渡金属离子的化学变化。电子自旋共振，色谱分析等技术已被广泛应用在活性氧的研究中。这些检测技术精度高，但存在需要昂贵的实验设备，且实验过程复杂，检测工作量大，受限因素多等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法，包括如下步骤：

(1)取近海典型浮游植物于f/2培养基中进行培养，该f/2培养基中含有用以标记近海典型浮游植物的SA-CDs，获得SA-CDs标记培养液，具体培养条件如下：f/2培养基中含有14～16mg/L CDs，置于光照强度为130～150μmol photons(m²s)^-1，光暗比为12～15h：8～10h，温度为18～20℃生化培养箱中培养，以80～120rpm搅拌海藻悬浮液模拟海水流动，同时减少CDs在容器壁上吸附；

(2)以H₂O₂溶液作为活性氧标准液，根据上述SA-CDs在不同浓度的活性氧标准液的荧光强度变化的情况，获得第一线性工作曲线：y＝0.2599x+2.404，其线性范围：6-9.6×10⁵ng/L，其中x表示H₂O₂浓度，y表示荧光强度；根据上述SA-CDs在不同浓度的活性氧标准液的显色吸光度变化情况，获得第二线性工作曲线：y＝-0.0002x+0.1941，其线性范围：3-2400ng/L，其中x表示H₂O₂浓度，y表示吸光强度；

(3)步骤(1)获得的SA-CDs标记培养液中的藻细胞悬浮于适量海水中，于17～19℃同时在高压汞灯持续照射下，以80～100rpm的速度持续搅拌0.8～1.2h，然后取适量进行超声波破碎，得破碎液，在破碎液中加入适量FeCl₃溶液后于激发波长343nm，发射波长440nm下扫描其荧光光谱Slit>0和F₁，计算荧光强度变化值ΔF＝F₀-F₁，最后将该荧光强度变化值ΔF作为y代入步骤(2)所得的第一线性工作曲线，所得x即为藻细胞内活性氧浓度检测结果；

(4)步骤(1)获得的SA-CDs标记培养液中的藻细胞悬浮于适量海水中，于17～19℃同时在高压汞灯持续照射下，以80～100rpm的速度持续搅拌0.8～1.2h，得细胞悬浮液，在该细胞悬浮液中加入适量FeCl₃溶液后于波长λ525检测吸光强度，最后将该吸光强度作为y代入步骤(2)所得的第二线性工作曲线，所得x即为藻细胞外活性氧浓度检测结果。

在本发明的一个优选实施方案中，所述近海典型浮游植物包括威氏海链藻CCMA-102和小球藻CCMA-410。

在本发明的一个优选实施方案中，所述SA-CDs的制备方法如下：取1.0mL CDs储备液于100mL容量瓶中，再称取0.0138g水杨酸加入其中溶解后定容至刻度线，避光搅拌24h后置暗处2-8℃保存备用。

进一步优选的，所述CDs储备液的中CDs的粒径为2-5nm，浓度为3g/L，量子产率量子产率≥60％，表面基团含氨基、羟基和羰基，其激发波长为343nm，发射波长为440nm。

在本发明的一个优选实施方案中，所述f/2培养基由浓度为75.0g/L硝酸钠母液、浓度为5.0g/L的磷酸钠母液、浓度为30.0g/L的硅酸钠母液、微量元素母液、维生素母液和海水组成，且硝酸钠母液、磷酸钠母液、硅酸钠母液、微量金属母液、维生素母液和海水的体积比为2∶2∶2∶2∶1∶2000，其中微量元素母液中含有氯化铁3.15g/L、硫酸铜9.8g/L、钼酸钠6.3g/L、硫酸锌22.0g/L、氯化钴10.0g/L、氯化锰180.0g/L，维生素母液含有维生素B121.0g/L、生物素0.1g/L和盐酸硫胺0.2g/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述FeCl₃溶液的浓度为10mmol/L。

本发明的有益效果：本发明应用水杨酸表面修饰的碳量子点(SA-CDs)，通过膜孔导入浮游植物细胞质中，水杨酸与胞内活性氧结合产生2，3-二羟基苯甲酸，其与FeCl₃反应，诱发荧光猝灭，据荧光信号变化值间接测定胞内活性氧含量。SA-CDs表面酚羟基可与Fe³⁺快速反应生成紫色络合物[Fe(C₇H₆O₃)₆]^3-，该络合物可被胞外活性氧诱导分解，颜色逐渐恢复至黄色，用比色法于波长λ₅₂₅检测胞外活性氧含量，本发明的CDs荧光信号稳定、尺寸小，较其他的荧光量子点具有水溶性好和生物毒性低等优势，不仅能够克服同位素示踪、电子自旋共振，色谱分析等技术的缺陷，且具检测线性范围广、精密度高、检测限低等优势。

附图说明

图1为本发明实施例1中水杨酸修饰碳量子点(SA-CDs)前后的紫外图谱。

图2为本发明实施例1中水杨酸修饰碳量子点标记浮游植物图(左：小球藻；右：威氏海链藻)。

图3为本发明实施例1中水杨酸修饰碳量子点标记浮游植物稳定性信号图。

图4为本发明实施例1中水杨酸修饰的碳量子点与胞内活性氧反应前(左)后(右)的荧光图谱。

图5为本发明实施例1中第一线性工作曲线。

图6为本发明实施例1中第二线性工作曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：

(1)取近海典型浮游植物(威氏海链藻CCMA-102和小球藻CCMA-410)于f/2培养基(由浓度为75.0g/L硝酸钠母液、浓度为5.0g/L的磷酸钠母液、浓度为30.0g/L的硅酸钠母液、微量元素母液、维生素母液和海水组成，且硝酸钠母液、磷酸钠母液、硅酸钠母液、微量金属母液、维生素母液和海水的体积比为2∶2∶2∶2∶1∶2000，其中微量元素母液中含有氯化铁3.15g/L、硫酸铜9.8g/L、钼酸钠6.3g/L、硫酸锌22.0g/L、氯化钴10.0g/L、氯化锰180.0g/L，维生素母液含有维生素B121.0g/L、生物素0.1g/L和盐酸硫胺0.2g/L)中进行培养6d，该f/2培养基中含有用以标记近海典型浮游植物的SA-CDs，获得SA-CDs标记培养液(如图2和3所示)，具体培养条件如下：f/2培养基中含有15mg/L CDs，置于光照强度为140μmolphotons(m²s)^-1，光暗比为14h：10h，温度为19℃生化培养箱中培养，以100rpm搅拌海藻悬浮液模拟海水流动，同时减少CDs在容器壁上吸附；

上述CDs储备液购于北京北达聚邦科技有限公司，其中的CDs的粒径为2-5nm，浓度为3g/L，量子产率≥60％，表面基团含氨基、羟基和羰基，其激发波长为343nm，发射波长为440nm。SA-CDs的制备方法如下：取1.0mL上述CDs储备液于100mL容量瓶中，再称取0.0138g水杨酸加入其中溶解后定容至刻度线，避光搅拌24h后置暗处2～8℃保存备用，水杨酸修饰前后的碳量子点的紫外图谱如图1所示；

(2)以H₂O₂溶液作为活性氧标准液，根据上述SA-CDs在不同浓度的活性氧标准液的荧光强度变化的情况(图4)，获得如图5所示的第一线性工作曲线：y＝0.2599x+2.404，其线性范围：6-9.6×10⁵ng/L，其中x表示H₂O₂浓度，y表示荧光强度；根据上述SA-CDs在不同浓度的活性氧标准液的显色吸光度变化情况，获得如图6所示的第二线性工作曲线：y＝-0.0002x+0.1941，其线性范围：3-2400ng/L，其中x表示H₂O₂浓度，y表示吸光强度

(3)步骤(1)获得的SA-CDs标记培养液中的藻细胞经PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗三遍去除细胞表面吸附的剩余CDs后，悬浮于500mL海水中，于18±0.5℃同时在高压汞灯持续照射下，以100rpm的速度持续搅拌1h，然后取2mL进行超声波破碎，得破碎液，在破碎液中加入20μL10mmol/L FeCl₃溶液后于激发波长343nm，发射波长440nm下扫描其荧光光谱Slit2.5/5，记录试剂空白和试液的荧光强度F₀和F₁，计算荧光强度变化值ΔF＝F₀-F₁，最后将该荧光强度变化值ΔF作为y代入步骤(2)所得的第一线性工作曲线，所得x即为藻细胞内活性氧浓度检测结果；

(4)步骤(1)获得的SA-CDs标记培养液中的藻细胞经PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗三遍去除细胞表面吸附的剩余CDs后，悬浮于适量海水中，于18±0.5℃同时在高压汞灯持续照射下，以100rpm的速度持续搅拌h，得细胞悬浮液，在该细胞悬浮液中加入100μL10mmol/LFeCl₃溶液后于波长λ525检测吸光强度，最后将该吸光强度作为y代入步骤(2)所得的第二线性工作曲线，所得x即为藻细胞外活性氧浓度检测结果。

为了验证本实施例方法中的碳量子点的生物低毒性，通过探讨CDs对威氏海链藻和小球藻细胞的光合活性、叶绿素a含量和存活率的影响来鉴定它在浮游植物细胞中的生物毒性。实验结果显示两种浮游植物细胞光合活性和叶绿素a含量与对照组比较均不存在显著性差异，存活率分别高达89.7％和94.5％，说明CDs对浮游植物细胞几乎无毒，见表1：

表1 CDs在浮游植物中毒性分析指标

为了验证本实施例方法中的水杨酸修饰的碳量子点对胞内外活性氧含量检测的适用性，按传统的生物体内过氧化物检测方法PeroxiDetect^TM>

表2 分析实际藻体样品中的活性氧含量

综上，本发明方法能够克服同位素示踪、电子自旋共振，色谱分析等技术的缺陷。碳量子点以粒径小的优势直接通过浮游植物细胞膜且可在细胞质或液中稳定存在。胞内和胞外检测法均具线性范围广(6-9.6×10⁵>5倍。胞外检测法与PeroxiDetect^TM>

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。