一种分离的水稻白叶枯病菌噬菌体及其应用

摘要

本发明公开了一种分离的水稻白叶枯病菌噬菌体及其应用，本发明公开的噬菌体保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015727。本发明中的噬菌体分离物是从自然界土壤中分离的烈性噬菌体，并利用噬菌体Xoo_sp15对黄单胞菌所引起的植物病害进行防治，且具有很好的防治效果。该噬菌体经过高度纯化有望开发成生物农药避免植物间黄单胞菌的传播以及植物中黄单胞菌的生长繁殖，有效防治黄单胞菌引起的植物病害。

说明书

技术领域

本发明属于生物防控领域，具体涉及到能够特异性裂解水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)菌株的噬菌体分离物和其作为生物农药在植物病害防治中的应用。

技术背景

噬菌体(bacteriophage，phage)是一种在细胞内生长繁殖的病毒，早在1896年，Hankin通过研究发现，在印度的恒河和亚穆纳河的河水中，存在一种可以通过磁性滤器的物质，其对霍乱有明显的抗菌作用。随后，Edward Twort和Felixd Herele分别在1915年和1917年各自独立发现一种物质，他们发现这一物质能够特异性裂解宿主细菌，并在双层平板上形成空斑，因此将其命名为噬菌体(何觅之.大肠杆菌K88、K99光谱噬菌体的分离与生物学特性鉴定.2012)。自生物进化至今，环境中的噬菌体数量已达到10¹¹(艾振江.小单孢菌40027菌株的分离及其特性的研究.2009)，其广泛分布于苏竹君的周围，并以不同的形态和生活方式存在。目前，海洋是噬菌体含量最高的地方，平均每毫升海水中的噬菌体的含量可高达9×10⁸个，并且海洋中的70％的细菌都能被噬菌体感染(Brtissow,2005)。

噬菌体是一种细菌病毒，无法独立繁殖，通过利用宿主细胞中的各类生长因子，包括核糖体、氨基酸、能量产生系统，来实现其自身生长繁殖，同时特异性裂解一种减少或至少几种细菌。噬菌体有严格的宿主特异性，只侵染敏感菌，对动植物细胞和其他细菌没有感染性。噬菌体的繁殖过程，有烈性循环和溶源性循环两种途径。烈性循环即噬菌体侵染宿主菌后立即展开复制增值过程，在短时间内连续完成吸附、侵染、复制、装配、释放五个步骤，最终使宿主细胞裂解释放出子代噬菌体；溶源性循环即噬菌体侵染宿主菌后，并不立即使宿主细胞裂解，而是直接将自身的基因组整合到宿主菌基因组上，当出现生物或化学因素刺激时，已经整合的前噬菌体进入复制阶段，从而裂解宿主菌，释放子代噬菌体。根据其增值方式的不同，将经历烈性循环的噬菌体称为烈性噬菌体，经历溶源性循环的噬菌体称为温和噬菌体。其中，烈性噬菌体在杀菌效果上有着广泛的应用，作为生物农药制剂具有极大的应用价值与应用前景。

早在1921年，黄单胞菌被认为是胡椒和番茄的细菌性疮痂病的病原菌(Doidge EM.Atomato canker.Amm Appl Biol.1921,7:407-430.)。随后，Dowson重新将该细菌命名为野油菜黄单胞菌(Dowson D W.On the systematic position and genetic names of the Gram negativebacterial plant pathogens.Zen fur Bak,Para und Inf.1939,100:177-193.)，并提出了黄单胞菌属的概念(Young J M,Dye D W,Bradbury J F,et al.A proposed nomenclature and classification forplant pathogenic bacteria.N Z J Agri Res.1978,21(1):153-177.)。黄单胞菌会引发细菌性病点斑，以及使多种植物的叶片、茎、果实的枯萎(Boch J,Bonas U.Xanthomonas AvrBs3family-typeIII effectors:discovery and func.Annu Rev Phytopathol.2010,48:419-436.)。这些致病菌表现出了较高的特异性，根据其宿主的不同，这些致病菌也分成了很多治病变种，并用其宿主的名字进行命名，如由柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri subsp.citri)引起的柑橘溃疡病，是一种在柑橘品种种植区(包括酸橙、柠檬、橘子等)能引起重大经济损失的植物疾病(Rodriguez-RL M,Grajales A,Arrieta＝Ortiz M L,et al..Genomes-based phylogeny of the genus Xanthomonas.BMC Microbiol.2012,12(1):43.)。黄单胞菌易于在水中或种子和植物繁殖过程中传播，当接触到易感植株时，该细菌就会经由由植物的伤口或天然开后侵染植物(Radeaker J L W,LouwsF J,Schultz M H,et al..A comprehensive species to strain taxonomic framework for Xanthomonas.Phytopathology,2005,95(9):1098-1111.)，入侵后，黄单胞菌的分泌系统将分泌大量的效应蛋白，从而引起植物的细菌性疾病。

在黄单胞菌属中，有一类细菌能引起水稻相关疾病，因而命名为水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)。这种黄单胞菌中有两个致病变种，分别为引起水稻白叶枯病的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)及引起水稻条斑病的水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,简称Xoc)。水稻白叶枯病菌菌体呈杆状，菌体被粘质的胞外多糖包围。在自然条件下，该病菌不仅可以侵染栽培稻、野生稻等水稻，也使李氏禾和茭白等禾本科植物致病。水稻的叶部存在水孔，其根、茎部也可能存在伤口。白叶枯病菌从这些部位侵入植物体，从而使水稻患病。被侵染的水稻植株的叶片两侧会出现不规则水渍状坏死斑。由白叶枯病菌引起的细菌性叶疫病是全球水稻种植区最严重的一种细菌性疾病(Hopkins C M,White F F,Choi S H,et al..Identification of a family of avirulence genes fromXanthomonas oryzae pv.Oryzae.Mol olant Microbe Interact,1992,5(6):451-459.)，尤其是亚洲的高产水稻种植区，如果发病较早，很可能80％的水稻都会受损，即使发病时间较晚，该病也会严重影响水稻的产量和质量。在亚洲，白叶枯病极其常见，仅在日本平均每年水稻损失约为22000～110111吨。在菲律宾雨季，白叶枯病会对易感水稻造成22.5％的损失，即使是旱季也有7.5％的易感水稻患病，对于抗性水稻，其损失在雨季和旱季也分别有9.5％和1.8％(Mathys G,Fao R P P P D,AGP,etal..European and Mediterranean Plant Protein Organization.Fao Plant Protect B.1990,20(3):509-511.)。

目前，预防水稻白叶枯病的主要方法是种植抗性品种，如2011年最新研发的品种Macassane，其对白叶枯病表现出了较高的抗性，且已经在非洲的莫桑比亚尝试种植(JeungJ U,Heu S G,Shin M S,et al..Dynamics of Xanthomonas oryzae pv.oryzae populations in Koreaand their relationship to know bacterial blight resistance genes.Phytopathlogy,2006,96(8):867-875.)。虽然抗病品种的推广对病害的控制起到了明显的作用，但由于病原菌的变异使抗病性丧失的现象仍屡屡发生。除了种植抗病品种，另一种广泛使用的防治方法就是使用化学农药。然而，化学药剂只能减缓病菌的传播，并不能治愈患病的植物，且长期使用农药极易引发细菌的耐药性，从而影响防治效果，农药对环境的破坏也不容忽视。虽然农药和抗性品种可以帮助减少致病率的发生，但其产生的副作用以及公众对健康的关注都鼓励着可替代性防控药剂的研究尤其引人注目。早在之前，噬菌体就被看做是一种植物疾病的防控药剂，但由于噬菌体具有宿主特异性、多变的细菌敏感性、快速出现的细菌耐药性，以及与紫外光之间的相互作用等影响因素。，所以并未受到重视。然而，现如今，在噬菌体的帮助下，减少农药的使用并防止细菌耐药性产生的生物防治再次引起了人们的注意，通过噬菌体侵染并裂解病菌的方法，将有效且安全地防止疾病发生，减少经济损失。

早在1960年，人们已经展开了对白叶枯病菌噬菌体的研究，基于这些噬菌体不同的形态学和血清学的性质，日本科学家Wakimoto初步将侵染白叶枯病菌的噬菌体分为OP1和OP2两类(Wakimoto S.Classification of strains of Xantho-monas oryzae on the basis of theirsusceptibility against bacteriophages.Ann Phytopathol Soc Jpn.1960,25:193-198.)。1965年，Goto和Okabe将他们从菲律宾获得的7中白叶枯病菌噬菌体与OP噬菌体进行了比较，并根据其血清学性质将其分为3类，第一、二类即OP1和OP2，而第三类是一种新的噬菌体，其宿主范围及血清学性质与前两种噬菌体均不同。随后，Xp10，Xp12，Xp20等不同类型的白叶枯病菌噬菌体相继被发现。此外，1968年人们又发现了一种纤维状白叶枯病菌噬菌体Xf(KuoT T,Huang T C,Wu R Y,et al..Phage Xp12of Xanthomonas oryzae(Uyeda et Ishiyama)Dowson.Can J Microbiol.1968,14(10):1139-1142.)。目前，已经对Xp10、OP1和OP2的DNA进行了测序分析，结果表明这些噬菌体都是双链DNA，其大小分别是44373、43785和46643bp(Yuzenkova J,Nechaev S,Berlin J,et al..Genome of Xanthomonas oryzae bacteriophage Xp10:an odd T-odd phage.J Mol Biol.2003,330(4):735-748.；Inoue Y,Matsuura T,Ohara T,et al.Sequence analysis of the genome of OP2,a lytic bacteriophage of Xanthomonas oryzae pv.Oryzae.J Gen Plant Pathol,2006,72(2):104-110.)，最近，科学家们发现了一种名为Xop411的白叶枯病菌噬菌体，经过比较，发现该噬菌体在组织结构、基因组大小、噬菌体形态甚至基因组序列上与OP1、Xp10都相同，但和OP2完全不同(Lee C N,Hu R M,Chow T Y,etal.Comparison of genomes of three Xanthomonas oryzae bacteriophages.BMC Genomics,2007,8(1):442.)。在侵染白叶枯病菌的噬菌体中，大多数属于肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科。较早的关于白叶枯病菌噬菌体的研究表明，OP1、OP2、Xp10、Xp12、Xp411均属于长尾噬菌体科。而较为罕见的，属于丝状噬菌体科的纤维状白叶枯病菌噬菌体Xf和phiXo也同样被研究和报道(Kuo T T,Huang T C,Wu R Y,et al..Phage Xp12ofXanthomonas oryzae(Uyeda et Ishiyama)Dowson.Can J Microbiol.1968,14(10):1139-1142.)。虽然，利用噬菌体疗法防控细菌性疾病这一思路在水产养殖中已经被用于防控细菌性血型腹水和加氏乳球菌感染等疾病，而在植物疾病中，也被用于控制青枯病菌从而治理青枯病。然而，迄今为止，对于白叶枯病噬菌体，人们都着重于研究其基本特征，以及其与宿主间的相互作用。最近，韩国科学家利用噬菌体裂解的性质来控制水稻白叶枯病的发病率，进行了一系列的理论研究及盆栽试验，结果表明，噬菌体对白叶枯病的防治具有一定的作用(Chae J C,YuS M,Lee Y H.Diversity of bacteriophages Infecting Xanthomonas oryzae pv.oryzae in PaddyFields and Its Potential to Control Bacterial Leaf Blight of Rice.J Microbiol Biotechnol.2014,24(6):740-747.)。

目前，噬菌体在水稻白叶枯病的防治上在国内还未见报道。国际上已报道的能够防治水稻白叶枯病的噬菌体资源匮乏，仅有韩国Chae J C等人进行了相关报道，但是在种属上与国内常见的水稻白叶枯病致病菌的种属不同，该报道中的噬菌体对国内水稻白叶枯病的防治没有指导意义。本发明在较大程度上弥补了国内水稻白叶枯病噬菌体防治的空缺，并且在实验室水平上取得了较好的防治效果，为国内水稻白叶枯病的噬菌体防治提供了坚实可靠的理论基础，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种对水稻白叶枯病菌具有强烈裂解作用的噬菌体单体。所述的噬菌体已于2015年12月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：黄单胞菌噬菌体(Xanthomonas oryzae pv.oryzae bacteriophage)Xoo_sp15，保藏编号：CCTCC NO：M2015727，地址，中国，武汉，武汉大学。

本发明的另外一个目的在于提供了水稻白叶枯病菌噬菌体Xoo_sp15在制备黄单胞菌生物杀菌剂的应用。该噬菌体可以单独或混合使用，可以特异性地部分或完全地灭活黄单胞菌，为工业化生产噬菌体生物杀菌剂提供噬菌体来源。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人从自然界土壤中分离得到一种噬菌体分离物，该噬菌体分离物包括一种或多种对水稻白叶枯病菌具有裂解作用的噬菌体，经纯化后获得了一株对水稻白叶枯病菌具有烈性裂解作用的噬菌体单体，该噬菌体对水稻白叶枯病菌均有广谱的杀菌能力。所述的噬菌体已于2015年12月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：黄单胞菌噬菌体(Xanthomonas oryzae pv.oryzae bacteriophage)Xoo_sp15，保藏编号：CCTCC NO：M2015727，地址，中国，武汉，武汉大学。

将噬菌体Xoo_sp15加入水稻白叶枯病菌菌悬液中，于28℃，190r/min摇床过夜培养，将共培养物12000rpm离心，取上清液，用0.22μm硝酸纤维素膜过滤除菌，得到噬菌体悬液。

从电镜观察图像判断，噬菌体Xoo_sp15属于有尾噬菌体科，尾部呈注射器状，头部为正六面体的衣壳蛋白，其内部包裹着的核糖核酸是噬菌体的遗传物质。

水稻白叶枯病菌噬菌体Xoo_sp15在制备生物杀菌剂的应用，包括以水稻白叶枯病菌噬菌体为有效成分，或以其为唯一有效成分在用于制备水稻白叶枯病菌生物杀菌剂。

本发明中的噬菌体Xoo_sp15可以单独或混合使用，可以作为杀菌剂喷洒于植物表面，可特异性、大幅度地缓解植物体中黄单胞菌的生存和繁殖，防止植物的进一步病变。

本发明中的噬菌体Xoo_sp15可以单独或混合使用，可作为一种潜在农药防治由水稻白叶枯病菌引起的植物病害。

本发明中的噬菌体可以和其他噬菌体联合使用，以获得较宽的噬菌范围。

本发明中噬菌体可以和其他的抗菌剂混合使用，在获得抗菌广谱性的同时，对水稻白叶枯病菌特异性杀灭，能与该发明中噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。

本发明中噬菌体可应用于工业生产，可由宿主菌水稻白叶枯病菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，作为植物抗菌剂防止植物中水稻白叶枯病菌侵染。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明中的噬菌体分离物是从自然界土壤中分离的烈性噬菌体，并利用噬菌体Xoo_sp15对黄单胞菌所引起的植物病害进行防治，且具有很好的防治效果。该噬菌体经过高度纯化有望开发成生物农药避免植物间黄单胞菌的传播以及植物中黄单胞菌的生长繁殖，有效防治黄单胞菌引起的植物病害。本发明的噬菌体对温度及pH的适用范围广，非常适用于实际生产需要。

附图说明

图1为本发明实施例1中纯化混合噬菌体时形成的单斑。

图2为本发明实施例2中Xoo_sp15噬菌体在10⁸PFU/ml浓度下的噬菌斑。

图3为本发明实施例2中Xoo_sp15噬菌体电镜图。

图4为本发明实施例3中培养基中PXO99A与噬菌体共培养及无噬菌体时的生长状态。

图5为本发明实施例4中培养基中PXO99A与不同温度处理后的噬菌体共培养及无噬菌体时的生长状态。

图6为本发明实施例4中培养基中PXO99A与不同pH处理后的噬菌体共培养及无噬菌体时的生长状态。

图7为本发明实施例5中不同处理后活体水稻叶片中PXO99A菌落数(CFU)的差异。

图8为本发明实施例5中不同处理后活体水稻叶片上病斑长度(cm)的差异。

具体实施方案

实施例1：

噬菌体的筛选和纯化

1.土壤样品的采集

本发明中土壤样品采自江苏省无锡市，为农田中的土壤(表1)。采用五点取样法采集，即每个取样点至少取5处，先将表层土铲去1～2厘米，再取深度5～10厘米的土壤，放入袋中，置于4℃冰箱里保存。

2.土壤样品中针对水稻白叶枯病菌的噬菌体的分离

预先扩增好水稻白叶枯病菌PXO99A(OD₆₀₀：0.2～0.6)(表1)，将此10种菌悬液各取5mL于锥形瓶内混合，称取5g土样于该锥形瓶内，置于28℃,190r/min的摇床中过夜培养。将摇过夜的土壤悬液离心去土壤颗粒及菌体，取上清，用孔径为0.22μm的无菌硝酸纤维素滤膜过滤除菌，得到无菌混合噬菌体悬液。

表1土壤、菌种信息

3.噬菌斑实验测定噬菌体的有无

水稻白叶枯病菌双层平板的制备：高温灭菌1.5％NB固体培养基，室温放置50℃，倾倒至培养皿内，均匀铺于皿底，室温放置20min，使其凝固。将高温灭菌的0.8％NB半固体培养基，室温放置约50℃，取5ml与1ml对数期PXO99A悬液(OD₆₀₀：0.4～0.8)混匀，倒入上述培养皿内，室温放置凝固。

取上述分离得到的噬菌体悬液的样品3μl点于双层平板上，28℃培养三天，观察有无噬菌斑，有噬菌斑则证明该悬液中存在混合噬菌体样品。

4.混合噬菌体样品的纯化

将上述混合噬菌体样品经过连续性的10倍稀释，取100μl稀释后噬菌体悬液，与900μl对数期PXO99A悬液混合侵染8min以上，再加入5ml 0.8％NB半固体培养基，混合均匀后倾倒至备好的NB平板上，使其平铺，室温放置凝固，28℃温箱培养3天。选取合适的平板，挑取单个噬菌斑(图1)。将挑取出来的噬菌体单克隆，加入10ml对数期PXO99A悬液中，28℃，190r/min摇床过夜培养，离心、滤膜除菌后获得第一次纯化后噬菌体悬液。重复此纯化步骤3次，得到噬菌体单克隆样品，并将其命名为Xoo_sp15。该噬菌体已于2015年12月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：黄单胞菌噬菌体(Xanthomonasoryzae pv.oryzae bacteriophage)Xoo_sp15，保藏编号：CCTCC NO：M 2015727，地址，中国，武汉，武汉大学。

实施例2：

高浓度噬菌体的制备及电镜观察

1.噬菌体的制备

将噬菌体Xoo_sp15加入提前制备好的PXO99A菌悬液中(OD：0.3)，于28℃，190r/min摇床过夜培养，将共培养物12000rpm离心5min，取上清液，用0.22μm硝酸纤维素膜过滤除菌，得到噬菌体悬液，待进一步浓缩。

2.噬菌体计数方法(效价)

将所得到的噬菌体样品按10倍比例稀释，取其中一定稀释比例的样品100μl，铺双层平板，取合适比例计算噬菌斑个数。稀释计数如图2。

3.噬菌体的浓缩

制备30ml Xoo_sp15噬菌体悬液(10¹⁰PFU/ml)，将得到的噬菌体悬液进行超速离心，110000g，离心2h，弃上清，用100μl>

3.噬菌体的电镜观察

噬菌体在显微镜下的形态结构特征，是目前噬菌体分类的重要依据，根据其形态特点，可将噬菌体分为有尾噬菌体、无尾噬菌体、纤维状噬菌体。

对Xoo_sp15噬菌体采用负染电镜观察噬菌体粒子的形态结构，该噬菌体头部为六边体，尾部为注射器形状，具有可收缩的尾部，头部与尾部之间具有颈部结构，在尾部末端可见类似基板的膨大结构或长尾丝。通过电镜形态结构观察，该噬菌体属于有尾噬菌体目的长尾噬菌体科。电镜形态如图3。

实施例3：

培养基中噬菌体对水稻白叶枯病菌生长的影响

制备Xoo_sp15噬菌体悬液(10¹⁰PFU/ml)：准备两组试管，在每支试管中装入5mlNB液体培养基，将备好的水稻白叶枯病菌PXO99A转接入试管中，28℃，190r/min摇床中培养至一定浑浊度(OD：0.6～0.8)。第一组试管中不加入任何噬菌体，第二组试管加入300μlXoo_sp15噬菌体悬液。将此两组试管置于28℃，190r/min摇床中共培养12h，每间隔3h检测一次OD值，观察不同处理后水稻白叶枯病菌PXO99A生长的差异。

结果显示，当无任何噬菌体添加时，PXO99A生长状态正常，未受到任何抑制。当添加噬菌体Xoo_sp15悬液后，PXO99A生长状态受到了一定抑制，生长较为缓慢，几乎没有生长，PXO99A出现了一定量的裂解死亡(图4)。

此结果表明，在培养基中，噬菌体Xoo_sp15对PXO99A具有一定的抑制效果，加入噬菌体Xoo_sp15的水稻白叶枯病菌PXO99A在液体培养基中生长12小时之后的OD值比不加噬菌体低0.3，加了噬菌体12小时后的OD值为0.705。

实施例4：

培养基中不同温度和PH处理后噬菌体对水稻白叶枯病菌的抑制效果

1.培养基中不同温度处理后的噬菌体对水稻白叶枯病菌生长的影响

制备Xoo_sp15噬菌体悬液(10¹⁰PFU/ml)，,将噬菌体悬液经过4℃、25℃、37℃、50℃、70℃处理2h后，按照实施例3的所述方法，立即加入试管中，进行PXO99A生长状态的检测。

结果显示，经过4℃、25℃、37℃处理后的噬菌体对PXO99A生长状态的抑制效果大致相近，均与实施例3中结果相近，说明4℃、25℃、37℃(图5)对噬菌体效价的影响不大，未加噬菌体的PXO99A生长12h后的OD值为1.013，4℃处理后噬菌体与PXO99A共培养12h后的OD值为0.665，25℃,处理后的OD值为0.731，37℃处理后的OD值为0.705。

这些温度下的噬菌体均能保持良好的生命活性并处于高效价状态，在培养基中能够对PXO99A的生长起到一定的抑制作用并且的抑制效果仍然最佳。而50℃(图5)处理后，无论有无噬菌体，PXO99A的生长状态相近，即50℃对噬菌体的活性是有较大影响的，有噬菌体的情况下培养12h后的OD值为0.866，说明噬菌体在此温度下对PXO99A的生长抑制都是非常微弱。经过70℃(图5)处理后，噬菌体基本灭活，有噬菌体的情况下培养12h后的OD值为1.007，说明该温度下处理的噬菌体对水稻白叶枯病菌PXO99A的生长无任何影响，即噬菌体几乎被灭活。

2.培养基中不同PH处理后的噬菌体对水稻白叶枯病菌生长的影响

制备Xoo_sp15噬菌体悬液(10¹⁰PFU/ml)，将噬菌体悬液经过PH3、PH5、PH7、PH9处理2h后，按照实施例3所述方法立即加入试管中，进行水稻白叶枯病菌PXO99A生长状态的检测。

结果显示，经过pH5、pH7、pH9处理后的噬菌体对PXO99A生长状态的抑制效果大致相近，均与实施例3中规律相近，未加噬菌体PXO99A培养12h后的OD值为1.089，以上PH处理后培养12h后的OD值分别,0.771,0.765,0.725，说明pH5、pH7、pH9(图6)对噬菌体效价的影响不大，这些PH处理后的噬菌体均能保持良好的生命活性并处于高效价状态，在培养基中能够对PXO99A的生长起到一定的抑制作用。而pH3(图6)处理后，PXO99A的生长受到了一定的抑制，但这种抑制弱于前述三个pH，pH3处理后培养12h的OD值为0.876。

实施例5：

噬菌体对Xoo_sp15对活体水稻的白叶枯病的防治效果检测

1.水稻白叶枯病菌计数方法

采用标准平板计数法。

2.喷洒噬菌体后活体水稻中水稻白叶枯病菌PXO99A的菌落数量(CFU)变化

水稻种子于水中室温浸泡1天，37℃浸泡1天，28℃浸泡至发芽，将发芽后的种子种植于盆栽用容器中(已装好搅拌均匀的营养土与普通土的混合物，按比例混合，适宜水稻生长)，每盆5株水稻便于五次CFU计数，于37℃温室中生长一个月以上，待生长状态良好时即可实验使用。

制备Xoo_sp15噬菌体悬液(10¹⁰PFU/mL),作为生物农药用于喷洒感染了白叶枯病菌PXO99A的活体水稻，检测活体水稻中PXO99A的菌落数量(CFU)随时间的变化。

制备白叶枯病菌PXO99A菌悬液(OD：0.8)，用于感染活体盆栽水稻，感染方法为通常所用的方法，即选取单株水稻中心位置生长状态较好且处于垂直竖立状态的两片叶子，用剪刀蘸取菌悬液后，于水稻叶片距叶片顶端1～2cm处剪断叶片，使白叶枯病菌通过伤口处侵入水稻叶片，然后凭借叶片维管束感染至其他其他部位。。

盆栽水稻共分为三组，第一组为只感染了白叶枯病菌PXO99A的盆栽水稻，无任何液体喷洒；第二组为感染了白叶枯病菌PXO99A的盆栽水稻，从感染白叶枯病菌PXO99A当天开始，第一天及往后每隔三天喷洒一次噬菌体悬液(为了利于噬菌体悬液附着于水稻叶片表面，添加脱脂奶粉增加附着力，脱脂奶浓度0.007g/ml)，喷洒量为10ml每盆(每盆5株水稻)；第三组为感染了白叶枯病菌PXO99A的盆栽水稻，喷洒无噬菌体的脱脂奶溶液(0.007g/ml)，喷洒量与喷洒时间和噬菌体悬液喷洒方式相同，此处理是为了排除脱脂奶的影响。每一组均有三个平行重复实验。

上述三组水稻盆栽从感染白叶枯病菌当天开始(记为第0天)于37℃温室中培养、处理，持续生长12天，从第0天起，每三天对水稻叶片内白叶枯病菌进行菌落计数。取每株水稻中间感染了白叶枯病菌的两片叶子，剪成较小叶片后进行后续计数处理，后续操作均在超净工作台中完成。将叶片于75％乙醇中消毒处理1分钟，再用无菌水进行三次漂洗，将漂洗后的叶片置于研钵中(加石英砂利于研磨)并加入1ml无菌水后进行研磨，研磨完全后，取100μl研磨液做连续性的10倍稀释，选取合适的稀释梯度涂平板计数。计数结果即为每两片水稻叶子中白叶枯病菌菌落数，观察其时间梯度变化。

结果显示，只喷洒了脱脂奶和未喷洒任何液体的水稻叶片中的白叶枯病菌菌落数在不同时间没有明显的差异，而喷洒了噬菌体悬液与上述水稻叶片中的白叶枯病菌菌落数在不同时间均存在显著差异，且随着时间的流逝菌落数渐渐拉开差距，第12天时，未作任何处理及脱脂奶处理的水稻叶片中的菌落数(CFU)接近10⁹，而噬菌体悬液处理后水稻叶片中菌落数(CFU)为10⁷(图7)。该结果说明，噬菌体悬液对水稻白叶枯病在菌落数水平上具有显著的防治效果，这种效果不是脱脂奶影响的结果。

3.喷洒噬菌体后活体水稻叶片上病斑长度的变化

水稻种植，混合噬菌体悬液及PXO99A的制备，盆栽水稻的处理方法均如上所述。三组水稻培养生长14天，分别测量不同时间病斑长度，每组五个平行。

结果显示，只喷洒了脱脂奶和未喷洒任何液体的水稻叶片上的病斑长度随时间变化趋势相同。喷洒了噬菌体悬液与前两种处理方式水稻叶片上的病斑长度变化趋势明显不同，脱脂奶处理和未处理的水稻叶片上第6天开始出现病斑，直到第14天病斑长度达到了平均20cm；而噬菌体悬液处理的水稻叶片上第9天才开始出现病斑，到第14天时病斑长度控制在了10cm左右(图8)。该结果说明，噬菌体悬液的喷洒对水稻白叶枯病在病斑长度水平上具有显著的防治效果，这种效果不是脱脂奶影响的结果。

本发明中噬菌体Xoo_sp15可以单独或混合使用，对感染水稻白叶枯病菌的水稻，每隔3天喷洒10¹⁰pfu/ml数量级的噬菌体，每2天对水稻叶片内水稻白叶枯病菌进行CFU计数，且在这14天内对水稻病斑进行长度测量，无论是CFU水平还是病斑长度水平上都表明具有显著效果。