公开/公告号CN106939045A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-07-11
原文格式PDF
申请/专利权人 深圳市国创纳米抗体技术有限公司;
申请/专利号CN201710299581.7
发明设计人 宋海鹏;
申请日2017-05-01
分类号C07K16/00;C07K1/14;
代理机构北京市众天律师事务所;
代理人李新军
地址 518057 广东省深圳市南山区粤海街道科丰路2号特发信息港大厦D栋一楼东侧二号
入库时间 2023-06-19 02:48:20
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-03-31
授权
授权
2017-08-04
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K16/00 申请日:20170501
实质审查的生效
2017-07-11
公开
公开
技术领域
本发明公开了一种单克隆抗体蛋白细胞培养液澄清的预处理方法,属于蛋白质纯化制备领域。
背景技术
单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)是一类重要的生物技术药物,在现代生物检测领域和医疗领域起着越来越重要的作用。现有技术中,单克隆抗体通常由中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)表达产生,随着上游高表达细胞株的构建、基因改造、发酵条件的不断优化,CHO细胞的单克隆抗体表达量已经达到30g/L以上,培养规模也逐步扩大,伴随着生物量以及杂质量的显著提高,上游产能的提升给下游分离纯化过程带来极大的压力。而高效的细胞回收液澄清预处理将大大减轻后续抗体纯化的压力,对于缩短工艺流程、提高经济性具有决定性的作用。由此可见,评价细胞回收液澄清效果的主要标准已经逐渐转变为不单单能有效地去除哺乳动物细胞、细胞碎片,更重要是在保证最终抗体蛋白回收率的同时,尽可能多地去除宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、宿主残留DNA、高分子量蛋白聚集体等污染物。
传统单克隆抗体分离纯化通常包括蛋白A亲和层析纯化、阴阳离子交换树脂纯化、疏水性作用树脂纯化等3-4步单元操作,工艺流程长、产品产率较低,导致单克隆抗体产品成本居高不下。因此如何缩短工艺流程、降低生产成本直接决定了在当前上游产能大大提升状况下,下游抗体分离纯化的主要研究方向。离心和切向流过滤常被应用于工业中去除细胞,最近几年深层过滤的应用也越来越广泛。絮凝剂用来增强细胞、杂质的去除和离心的效果也越来越受到广泛的关注。沉淀法因具有操作简单、省时省力、回收率高等特点在抗体分离纯化中应用广泛。沉淀技术的原理是利用不同蛋白疏水性的差异,通过调节盐浓度沉淀相应的蛋白,达到分离纯化的目的。辛酸是一种饱和脂肪酸,促进酸性蛋白发生沉淀,等电点较高的单克隆抗体因具有足够的电荷以中和辛酸的疏水作用,得以保留在上清液中,但是该方法会增加浊度和黏度,不利于分离上清液。所以本领域亟需一种更为简单有效的沉淀法用于单克隆抗体细胞培养液的澄清以增加后续分离纯化的效率。因此,本发明的目的就是提供一种操作便捷、快速高效地基于脂肪酸沉淀的单克隆抗体细胞培养液澄清的预处理方法。
发明内容
为实现上述发明目的,本发明提供了一种使细胞培养液澄清的预处理方法,以去除各种宿主细胞杂质,所述方法包括以下步骤:
(1)在所述细胞培养回收液中添加9或10碳脂肪酸;
(2)调节并保持pH为5.0-5.5的反应环境使脂肪酸与培养液反应;反应进行20-40分钟后加入精胺,所述精胺在酸性条件下呈现多阳离子多胺类特性,与DNA结合以辅助并促进抗体污染物的进一步凝聚;
(3)降低反应温度至25℃以下并静置,以使脂肪酸呈固态析出;
(4)去除步骤(3)析出的固态杂质,收集上清液。
在一个优选的技术方案中,所述脂肪酸为十碳脂肪酸,即癸酸。
在一个更为优选的技术方案中,所述培养液为CHO细胞发酵获得的培养液。
更为优选地,在步骤(1)中,在细胞发酵结束前2-4小时至发酵结束后添加所述癸酸进入细胞培养液。
再为优选地,步骤(1)中,所述癸酸的终浓度为0.2-1%。
尤为优选地,步骤(1)中,所述癸酸的终浓度为0.4%。
在另一个优选的技术方案中,步骤(2)中,所述精胺的终浓度保持在0.1%。
在一个优选的技术方案中,步骤(2)中,所述反应的温度为35-37℃。
在另一个优选的技术方案中,步骤(2)中,所述反应的时间为2-4小时。
在另一个优选的技术方案中,步骤(3)中,所述静置的时间为2-4小时。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1)操作简单、耗时短、工作量小,可应用于工业化生产。
2)操作温度易控,符合常规工业生产设备要求。
3)应用该方法纯化的单克隆抗体的纯度和收率高,HCP降低至低于500ppm,DNA小于10ppb;IgG1纯度为95%以上,回收率高于90%。当应用赛多利斯双级深层过滤时,利用癸酸沉淀后的细胞回收液滤过量是利用辛酸沉淀的两倍以上。
附图说明
图1:利用癸酸沉淀分离纯化单克隆抗体的流程图一;
图2:癸酸浓度与IgG收率相关性曲线图;
图3:利用癸酸沉淀分离纯化单克隆抗体的流程图二
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明,但以下实施例仅是例证,本发明并不局限于这些实施例。实施例中的实验方法,如无特殊说明,均采用本领域常规技术。无特殊说明,所有化学试剂均为商用常规分析纯试剂。
癸酸,又名正癸酸、羊蜡酸(Capric acid;Decanoic acid;Decatoic acid;Decylic acid;Decoic acid;Nonane-d-carboxylic acid),分子式:CH3(CH2)8CO(OH),分子量:172.27,CAS号:334-48-5
其分子式如下式(I)所示:
癸酸主要用于制取癸酸酯类产品,其酯类用作香料、湿润剂、增塑剂和食品添加剂等。
精胺,是含有两个氨基和两个亚氨基的多胺类物质(中文别名:精碱精素;精胺;精素;N,N'-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺;O,O-二甲基硫代磷酰胺;1,12-二氨基-4,9-二氮十二烷),分子量:202.34,CAS号:71-44-3。
其分子式如下式(II)所示:
精胺可作为有机磷农药中间体。同时,精胺是典型的阴离子表面活性剂,具有良好的渗透、乳化、泡沫和去污能力,广泛应用于化工,农药、纤维、电渡、选矿等工业,尤其适用于化妆品、牙膏、香波等的制造。纺织工业中适用于洗涤羊毛和丝绸。
实施例1.单克隆抗体细胞培养液的澄清(具体流程见图1)
(1)细胞培养:单克隆抗体IgG1由CHO表达产生,抗体在5L
(2)培养液预处理:将细胞培养液在室温、4000×g条件下离心20min,之后经由0.22μm滤膜(Rapid-Flow Filters,Thermo Scientific)过滤,收集过滤液。
(3)沉淀污染物:在收集的过滤液中添加癸酸,使其终浓度为0.4%,通过添加1M醋酸或1M Tris缓冲液将反应pH调至5.0-5.5,在反应进行30分钟后加入终浓度为0.1%的精胺。37℃混匀4h,搅拌速率控制在200-300rpm。之后将温度降至25℃。
(4)分离污染物沉淀:4 000g离心15min,收集上清液。
(5)检测:通过Generation III CHO HCP试剂盒检测,HCP降低至500ppm以下;由数字型PCR仪QX100TM>TM>
实施例2.不同癸酸浓度对宿主杂质去除的影响
(1)细胞培养:同实施例1。
(2)培养液预处理:同实施例1。
(3)沉淀污染物:在收集的过滤液中添加不同量的癸酸,使其终浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%,pH调至5.0-5.5,37℃混匀4h。将温度降至25℃,静置4h。
(4)分离污染物沉淀:同实施例1。
(5)检测:同实施例1。结果显示,综合考虑抗体蛋白收率与宿主杂质去除效率,0.4%的癸酸浓度为最优(见图2)。
实施例3.单克隆抗体细胞培养液的澄清(具体流程见图3)
(1)细胞培养:同实施例1。
(2)添加癸酸:在发酵结束前4h添加癸酸,使其终浓度为0.4%。在反应进行30分钟后加入0.1%精胺。
(3)降温:发酵结束后,将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞:将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀,收集过滤液。
(5)检测:同实施例1。HCP降低至低于500ppm,DNA小于10ppb;IgG1纯度为95%以上,回收率高于90%。
实施例4.辛酸和癸酸细胞培养液澄清对比
(1)细胞培养:同实施例1。
(2)添加辛酸和癸酸:在发酵结束前4h添加癸酸,使其终浓度为0.4%。在反应进行30分钟后加入0.1%精胺。
(3)降温:发酵结束后,将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞:将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀,收集过滤液。
(5)应用赛多利斯双级深层过滤,利用癸酸沉淀后的细胞回收液滤过量是利用辛酸沉淀的两倍以上。
实施例5.应用蛋白A亲和层析分离癸酸澄清后细胞培养液
(1)细胞培养:同实施例1。
(2)添加癸酸:在发酵结束前4h添加癸酸,使其终浓度为0.4%。在反应进行30分钟后加入0.1%精胺。
(3)降温:发酵结束后,将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞:将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀,收集过滤液。
(5)经过蛋白A分离纯化单克隆抗体HCP降低至低于检测线,DNA小于1ppb;IgG1纯度为99%以上,回收率高于99%。而没有经过癸酸澄清的细胞回收液,HCP在500-1000ppm,DNA小于1ppm;IgG纯度为95%,回收率为90-95%。
实施例6.应用切向流过滤分离纯化癸酸法澄清后的细胞培养液
(1)细胞培养:同实施例1。
(2)添加癸酸:在发酵结束前4h添加癸酸,使其终浓度为0.4%。在反应进行30分钟后加入0.1%精胺。
(3)降温:发酵结束后,将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞:将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀,收集过滤液。
(5)直接应用切向流过滤浓缩进行单克隆抗体的分离纯化,HCP降低至低于100ppm,DNA小于10ppb;IgG1纯度为95%以上,回收率高于95%。符合现有FDA标准的单克隆抗体蛋白产品。实现无色谱柱单克隆抗体分离纯化。
机译: 澄清和稳定细胞培养液的方法
机译: 澄清和稳定细胞培养液的方法
机译: 一种固定化培养液中包括全微生物细胞的培养液的制备方法