一种加拿大糖槭离体再生的方法

摘要

本发明公开了一种加拿大糖槭离体再生的方法，包括如下步骤：取材，外植体的预处理，外植体不定根的诱导处理，外植体的定植，外植体的成苗管理。本发明的优点在于：其一，一方面取材方便，材料丰富，且能保持母本株系的优良性状；另一方面极大节约了种质材料，提高了繁殖效率；其二，繁殖速度快，繁育周期短，操作简单；其三，严格优化并控制生根促进液的种类和浓度，使其成为加拿大糖槭植株不定根诱导的最佳浓度；其四，消毒剂、营养补液以及营养基质等的种类和浓度选择也严格与加拿大糖槭植株生长过程中所需的必要元素相配合，同时避免有害元素的引入；其五，取材时间的确定也是经过实验对比所选出的最适合加拿大糖槭生长的时间。

说明书

技术领域

本发明涉及糖槭繁殖领域，尤其涉及一种加拿大糖槭离体再生的方法。

背景技术

加拿大糖槭(Acer saccharum Marsh)，原产加拿大，为槭树科，槭树属，多年生大型落叶乔木，性耐寒，在我国东北和南方各省区均有零星引种栽培，是一种集观赏、糖浆生产和材用等用途于一身的多功能树种。其嫩枝细长，呈亮红棕色，树叶全年有丰富的色彩变化，春夏叶色浓绿，入秋后叶色从金黄至桔红，具有极高的观赏价值；其树干中流出的液汁可浓缩成可口的食用枫糖浆和砂糖而被誉为“铁杆甘蔗”，具有极高的商业价值；此外，加拿大糖槭的材质坚硬，纹理细致，无特殊气味，是很好的建筑和家具用材。因此，引种并大面积繁育该树种，不仅可以推动枫糖在我国的产业化生产，丰富我国的食品加工产业，同时也可以作为观赏树种和用材树种在我国三北和南方各省城市推广，这对于丰富我国林业资源，带动林业经济发展具有重大意义。

目前，加拿大糖槭的繁殖栽培主要采用从加拿大引进的种子进行播种繁育，由于加拿大糖槭种壳坚硬且存在深度休眠，致使其种子萌发率极低(10％)，且通过种子繁殖不利于加拿大糖槭优良性状的保持。此外，通过利用扦插技术对加拿大糖槭进行繁育的研究已有报道，但是以10-16cm长的加拿大糖槭枝条作为繁殖材料，虽可以保持母本植株的优良特性，但存在繁殖过程繁琐，繁殖效率低等问题，很难满足规模化繁育加拿大糖槭优良品种的需求。

因此，针对目前加拿大糖槭繁育所存在的诸多问题，急需开发一种简单的，可以快速有效的获得遗传变异小、性状整齐一致的加拿大糖槭苗的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种步骤简单，操作方便，且可快速有效获得遗传变异小、性状整齐一致的加拿大糖槭苗的加拿大糖槭离体再生的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种加拿大糖槭离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)取材

选取野外多年生加拿大糖槭优良株系的当年生枝条的微茎段为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的加拿大糖槭微茎段剪切为适宜大小、至少带有1-2个腋芽和1-2个叶片的微茎段，接着置于流水下进行冲洗，冲洗后通过高锰酸钾溶液进行表面消毒，消毒后阴干备用；

(3)外植体不定根的诱导处理

将步骤(2)中经过消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中进行不定根的诱导处理；其中生根促进液具体为含有800-2000mg/L亚精胺和100-500mg/L 2.4-D的混合溶液；

(4)外植体的定植

将步骤(3)中的经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施不含有机元素的营养补液的营养基质中，以互不重叠为准；其中，营养基质由上下两层构成：下层是4-6cm厚的营养土，上层是3-5cm厚的河沙；

(5)外植体的成苗管理

将步骤(4)中定植后的加拿大糖槭微茎段盖上塑料膜，于温室大棚中继续不定根的诱导和成苗培养，最后获得完整的再生植株。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中优良株系指具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的株系。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中适宜大小指2.0-5.0cm长。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中高锰酸钾溶液具体为浓度0.1-0.3％的高锰酸钾消毒溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述高锰酸钾溶液的使用方法为：将待消毒的样品置于浓度0.1-0.3％的高锰酸钾消毒溶液中消毒2-5min。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中将消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中浸泡30-90s。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中将经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施不含有机元素的营养补液的营养基质中，插入长度为0.5-1.0cm。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中营养补液为不含有机元素的WPM培养液。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中温室大棚具体为温度22-25℃、相对湿度80-85％的温室大棚。

作为本发明的优选方式之一，所述取材时间为6-7月份。

本发明相比现有技术的优点在于：本发明提供了一种加拿大糖槭离体再生的方法，具有以下突出优点：其一，本发明所用的外植体是2.0-5.0cm、携带腋芽的加拿大糖槭微茎段，一方面取材方便，材料丰富，且能保持母本株系的优良性状；另一方面该与传统的扦插枝条相比，极大节约了种质材料，提高了繁殖效率；其二，本发明具有繁殖速度快，繁育周期短(50d即可成苗)，操作简单等优势，对于加拿大糖槭植株的规模化繁育具有重要意义；其三，本发明严格优化并控制生根促进液的种类和浓度，使其成为加拿大糖槭植株不定根诱导的最佳浓度；其四，本发明的预处理、定植及成苗管理步骤中的消毒剂、营养补液以及营养基质等的种类和浓度选择也严格与加拿大糖槭植株生长过程中所需的必要元素相配合，同时避免有害元素的引入；其五，本发明的取材时间的确定也是经过实验对比所选出的最适合加拿大糖槭生长的时间。

附图说明

图1是实施例3中的一种加拿大糖槭离体再生的方法的加拿大糖槭茎段定植图；

图2是实施例3中的一种加拿大糖槭离体再生的方法的加拿大糖槭茎段不定根形成图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种加拿大糖槭离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)取材

6月份，选取野外多年生加拿大糖槭优良株系(具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的株系)的当年生枝条的微茎段为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的加拿大糖槭微茎段剪切为2.0cm长、至少带有1个腋芽和1个叶片的微茎段，接着置于流水下进行冲洗，冲洗后通过浓度0.1％的高锰酸钾消毒溶液进行表面消毒2min，消毒后阴干备用；

(3)外植体不定根的诱导处理

将步骤(2)中经过消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中浸泡30s，进行不定根的诱导处理；其中生根促进液具体为含有800mg/L亚精胺和100mg/L 2.4-D的混合溶液；

(4)外植体的定植

将步骤(3)中的经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施营养补液的营养基质中，以互不重叠为准，插入长度为0.5cm；其中，营养基质由上下两层构成：下层是4cm厚的营养土，上层是3cm厚的河沙；营养补液为不含有机元素的WPM培养液；

(5)外植体的成苗管理

将步骤(4)中定植后的加拿大糖槭微茎段盖上塑料膜，于温度22℃、相对湿度80％的温室大棚中继续不定根的诱导和成苗培养，培养70d后，最后获得完整的再生植株，其中不定根的诱导率为61.4％，平均每个外植体产生1-3条不定根。

实施例2

本实施例的一种加拿大糖槭离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)取材

7月份，选取野外多年生加拿大糖槭优良株系(具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的株系)的当年生枝条的微茎段为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的加拿大糖槭微茎段剪切为5.0cm长、至少带有2个腋芽和2个叶片的微茎段，接着置于流水下进行冲洗，冲洗后通过浓度0.3％的高锰酸钾消毒溶液进行表面消毒5min，消毒后阴干备用；

(3)外植体不定根的诱导处理

将步骤(2)中经过消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中浸泡90s，进行不定根的诱导处理；其中生根促进液具体为含有2000mg/L亚精胺和500mg/L 2.4-D的混合溶液；

(4)外植体的定植

将步骤(3)中的经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施营养补液的营养基质中，以互不重叠为准，插入长度为1.0cm；其中，营养基质由上下两层构成：下层是6cm厚的营养土，上层是5cm厚的河沙；营养补液为不含有机元素的WPM培养液；

(5)外植体的成苗管理

将步骤(4)中定植后的加拿大糖槭微茎段盖上塑料膜，于温度25℃、相对湿度85％的温室大棚中继续不定根的诱导和成苗培养，培养60d后，最后获得完整的再生植株，其中不定根的诱导率为82.6％，平均每个外植体产生2-5条不定根，且不定根的平均长度为到2-4cm。

实施例3

本实施例的一种加拿大糖槭离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)取材

7月份，选取野外多年生加拿大糖槭优良株系(具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的株系)的当年生枝条的微茎段为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的加拿大糖槭微茎段剪切为3.0cm长、至少带有2个腋芽和2个叶片的微茎段，接着置于流水下进行冲洗，冲洗后通过浓度0.2％的高锰酸钾消毒溶液进行表面消毒3min，消毒后阴干备用；

(3)外植体不定根的诱导处理

将步骤(2)中经过消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中浸泡60s，进行不定根的诱导处理；其中生根促进液具体为含有1000mg/L亚精胺和200mg/L 2.4-D的混合溶液；

(4)外植体的定植

将步骤(3)中的经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施营养补液的营养基质(如图1)中，以互不重叠为准，插入长度为0.8cm；其中，营养基质由上下两层构成：下层是5cm厚的营养土，上层是4cm厚的河沙；营养补液为不含有机元素的WPM培养液；

(5)外植体的成苗管理

将步骤(4)中定植后的加拿大糖槭微茎段盖上塑料膜，于温度23℃、相对湿度83％的温室大棚中继续不定根的诱导和成苗培养；培养15d后，加拿大糖槭微茎段的形态学下端膨大，并伴有淡黄色的紧密的愈伤组织形成；培养30d后，茎段的基本产生长度为1-2cm左右的不定根；培养50d后不定根的诱导率高达90.1％，平均每个外植体产生3-5条不定根，且不定根的平均长度为到4-6cm(如图2)。

实施例4

本实施例测试了不同取材时间对加拿大糖槭茎段不定根诱导的影响，分别以4、5、6、7、8、9和10月份的加拿大糖槭当年生微茎段为外植体进行实验，包括如下步骤：

(1)取材

分别在4、5、6、7、8、9和10月份，选取野外多年生加拿大糖槭优良株系(具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的株系)的当年生枝条的微茎段为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的加拿大糖槭微茎段剪切为3.0cm长、至少带有2个腋芽和2个叶片的微茎段，接着置于流水下进行冲洗，冲洗后通过浓度0.2％的高锰酸钾消毒溶液进行表面消毒3min，消毒后阴干备用；

(3)外植体不定根的诱导处理

将步骤(2)中经过消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中浸泡60s，进行不定根的诱导处理；其中生根促进液具体为含有1000mg/L亚精胺和200mg/L 2.4-D的混合溶液；

(4)外植体的定植

将步骤(3)中的经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施营养补液的营养基质中，以互不重叠为准，插入长度为0.8cm；其中，营养基质由上下两层构成：下层是5cm厚的营养土，上层是4cm厚的河沙；营养补液为不含有机元素的WPM培养液；

(5)外植体的成苗管理

将步骤(4)中定植后的加拿大糖槭微茎段盖上塑料膜，于温度23℃、相对湿度83％的温室大棚中继续不定根的诱导和成苗培养，50d后统计微茎段的生根情况。

研究结果表明：如表1所示，不同取材时期对加拿大糖槭一年生微茎段不定根的诱导具有重要影响；4-5月份，由于加拿大糖槭的微茎段尚处于未木质化状态，微茎段定植后基部易出现变黑坏死的现象，生根率较低；6-7月份，由于加拿大糖槭的微茎段处于半木质化状态，不定根的诱导率最高达到90.1％；8-10月份，随着加拿大糖槭的微茎段木质化程度增加，不定根的诱导率出现下降的趋势，推测原因为木质化程度越来越高，微茎段的再生能力下降等原因，影响了微茎段的再生效率；因此；6-7月份为最佳的取材时间。

表1不同取材时间对加拿大糖槭微茎段不定根诱导的影响

注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。

实施例5

本实施例测试了不同种类营养补液对加拿大糖槭茎段不定根诱导的影响，包括如下步骤：

(1)取材

7月份，选取野外多年生加拿大糖槭优良株系(具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的株系)的当年生枝条的微茎段为外植体；

(2)外植体的预处理

将步骤(1)中的加拿大糖槭微茎段剪切为3.0cm长、至少带有2个腋芽和2个叶片的微茎段，接着置于流水下进行冲洗，冲洗后通过浓度0.2％的高锰酸钾消毒溶液进行表面消毒3min，消毒后阴干备用；

(3)外植体不定根的诱导处理

将步骤(2)中经过消毒处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端置于生根促进液中浸泡60s，进行不定根的诱导处理；其中生根促进液具体为含有1000mg/L亚精胺和200mg/L 2.4-D的混合溶液；

(4)外植体的定植

将步骤(3)中的经过生根促进液处理后的加拿大糖槭微茎段的形态学下端定插入提前喷施营养补液的营养基质中，以互不重叠为准，插入长度为0.8cm；其中，营养基质由上下两层构成：下层是5cm厚的营养土，上层是4cm厚的河沙；营养补液为不同类型植物培养液；

(5)外植体的成苗管理

将步骤(4)中定植后的加拿大糖槭微茎段盖上塑料膜，于温度23℃、相对湿度83％的温室大棚中继续不定根的诱导和成苗培养，50d后统计微茎段的生根情况。

研究结果表明：如表2所示，不同培养液类型对加拿大糖槭一年生微茎段不定根的诱导具有重要影响，其中，DKW培养液的效果最差，不含有机元素的WPM培养液最佳；因此，不含有机元素的WPM培养液为加拿大糖槭培养的最佳营养补液。

表2培养液类型对加拿大糖槭微茎段不定根诱导的影响

注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。