法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-01-03
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N 7/01 专利号:ZL2017100549883 申请日:20170124 授权公告日:20191011
专利权的终止
2019-10-11
授权
授权
2017-07-25
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N7/01 申请日:20170124
实质审查的生效
2017-06-30
公开
公开
技术领域
本发明涉及重组病毒基因工程技术领域,具体涉及一种同时预防人3型腺病毒-人55型腺病毒-人7型腺病毒的多表位疫苗候选株。
背景技术
人腺病毒(human Adenovirus, HAdV)感染的患者主要是婴幼儿及体弱人群,特别是其感染导致的重症肺炎病死率高。腺病毒流行范围广,传播速度快,近年来在多个国家和地区爆发和流行,给人们的公共卫生安全带来了极大的威胁。导致重症肺炎的腺病毒主要是B组的呼吸道腺病毒,近几年在全世界范围内均有呼吸道腺病毒爆发流行的报道。B组呼吸道腺病毒中的3,7,14,55型经常在人群中流行,造成重症肺炎。相对其它型别的腺病毒感染(人3、7、14 型等)HAdV-B55感染引起的肺炎症状通常更严重。
接种腺病毒疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一,但安全有效的腺病毒疫苗一直以来未被研究开发。上世纪70、80年代美国研制并曾经在军队新兵中使用的人4型、7型肠溶型腺病毒活疫苗被证明对腺病毒引起疾病非常有效,目前世界范围内只有在美国军队中使用,但单价的腺病毒活苗存在一定的安全隐患。目前我国还没有呼吸道腺病毒疫苗投入使用。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足,本发明的目的在于提供一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用。
本发明提供了一种重组人3型腺病毒,所述重组人3型腺病毒是在人3型腺病毒六邻体(Ad3)的HVR2区、HVR5区分别插入人55型腺病毒(Ad55)中和抗原表位55R2、人7型腺病毒(Ad7)中和抗原表位7R5;其中,所述人55型腺病毒中和抗原表位55R2的氨基酸序列为LKVSDEESK,所述人7型腺病毒中和抗原表位7R5的氨基酸序列为EAADAFSPE。
优选的,所述人55型腺病毒中和抗原表位替换的氨基酸序列为人3型腺病毒六邻体HVR2区的TTEGEE。
优选的,所述人7型腺病毒中和抗原表位替换的替换氨基酸序列为人3型腺病毒六邻体HVR5区的DAVAGALA。
本发明还提供了一种同时预防人3型腺病毒-人55型腺病毒-人7型腺病毒的多表位疫苗候选株,所述多表位疫苗候选株含有上述所述的重组人3型腺病毒。
本发明还提供了一种载体,所述载体包含上述所述的重组人3型腺病毒。
本发明还提供了一种重组人3型腺病毒的制备方法,包括如下步骤:
在人3型腺病毒六邻体的HVR2区、HVR5同时插入人55型腺病毒中和抗原表位55R2、人7型腺病毒中和抗原表位7R5;其中,
所述人55型腺病毒中和抗原表位55R2的氨基酸序列为LKVSDEESK;
所述人7型腺病毒中和抗原表位7R5的氨基酸序列为LKVSDEESK和EAADAFSPE。
本发明所提供的重组人3型腺病毒,允许Ad55、Ad7中和表位个别氨基酸的缺失、替换或添加。但需要保持中和表位的免疫原性;允许被置换的HVR2、HVR5区个别氨基酸的缺失、替换或添加,但需要保持腺病毒的稳定性,同时保证外源表位的免疫活性。
本发明的有益效果在于:本发明中,在人3型腺病毒六邻体衣壳上同时展示Ad55、Ad7的中和表位,该重组腺病毒可以产生抗Ad3、Ad55、Ad7感染的免疫应答,多次免疫注射能加强免疫。该重组病毒可以同时预防Ad3、Ad55、Ad7感染。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解,下面结合实施例对本发明作进一步的说明,实施方式提及的内容并非对本发明的限定。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,下列实施例中未提及的具体实验方法,通常按照常规实验方法进行。
本说明书实施例中的Ad3是使用本研究团队前期使用的Hadv3病毒株(全基因Genbank号:DQ099432)。
实施例1:构建重组病毒载体
以HAdv3载体为模板,重叠PCR分别扩增含有Ad55的中和抗原表位的六邻体片段。再次用重叠PCR扩增同时Ad55、Ad7的中和抗原表位的六邻体片段,经过Cla I,Bam H I双酶切后与经过Cla I,Bam H I酶切后的穿梭质粒PBRLOR连接构建穿梭质粒,命名为PBRLOR –Ad55-Ad7。将构建好的穿梭质粒经过EcoR I,Sal I双酶切与骨架质粒pBRAd3△E3GFP经过Pac I,AvR II在BJ5183内同源重组,得到重组质粒pAd3-55R2-7R5△E3GFP。所使用的引物见表1,55r2,7r5为PCR筛选鉴定用特异引物。
表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3-Ad55-Ad7六邻体基因使用的引物
将上述重组得到的质粒pAd3-Ad55R2-7R5△E3GFP经过AsisI酶切后,转染Ad293细胞,拯救包装得到重组病毒。大量培养并CsCl密度梯度离心纯化病毒粒子。经过纯化的病毒粒子达到1×1012 VPs/ml,测定OD260/OD280比值约1.2-1.4,内毒素检测<10EU/ml。重组病毒pAd3-Ad55R2-7R5△E3GFP在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定,表明重组病毒基因组保持稳定,没有基因缺少、重组现象。
实施例2:重组病毒的免疫原性实验
制备抗血清,进行血清中和实验,验证重组病毒载体的免疫原性。将纯化的重组病毒pAd3-Ad55R2-7R5△E3GFP肌肉注射免疫小鼠,得到的多抗血清进行微量中和实验,检测重组病毒产生的抗体中和Ad3,Ad55,Ad7的能力。
免疫3次后第14天采集的小鼠血清中和反应实验结果见表2,表2为多次免疫小鼠血清的中和效价,实验结果数据表明多次免疫后抗Ad3,Ad55,Ad7的免疫应答均得到加强。
表2 多次免疫后血清中和效价
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
机译: 一种针对呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗,其包含重组人腺病毒血清型35,所述重组人腺病毒血清型35包含编码RSV F蛋白的核酸。为受试者接种RSV疫苗的方法;包含重组人腺病毒血清型35的细胞;制备针对RSV的疫苗的方法;编码F ProteinRSV的重组核酸。
机译: 抗呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗,所述疫苗包含重组人腺病毒血清型26,所述重组人腺病毒血清型26包含编码RSV F蛋白或其片段的核酸。针对RSV的疫苗接种方法;包含重组人腺病毒血清型的细胞产生方法26;疫苗;编码VMr F蛋白的重组核酸。
机译: (54)标题:传播猴腺病毒载体的方法(57)摘要:本发明提供了在包括人细胞的细胞中繁殖猴腺病毒的方法,所述细胞包括从人腺病毒分离的一种或多种基因产物。还提供了繁殖方法,其中猴腺病毒包含编码人腺病毒基因产物的核酸序列。本发明进一步提供了通过这种繁殖方法获得的猴腺病毒,包括复制缺陷型猴腺病毒。