一种从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮的方法

摘要

本发明公开了一种从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮的方法，包括以下步骤：（1）发酵：将乳酸菌与新鲜银杏叶混匀，密封条件下发酵20天以上；提取前加入活性干酵母；（2）水提，得提取液和银杏叶渣；（3）提取得银杏叶多糖；（4）提取银杏叶黄酮粗提取物；（5）银杏叶黄酮粗提取物，陶瓷膜过滤，通过大孔吸附树脂lx‑5，洗脱，洗脱液直接通过大孔树脂lxd‑200或D301，收集流出液，浓缩，喷雾干燥，得银杏叶黄酮。本发明的方法，通过对新鲜的银杏叶进行乳酸菌发酵保藏，利于活性成分的浸出，节约能源，降低生产成本。本发明的方法，银杏叶多糖和银杏叶黄酮的收率和提取率都得到了明显提高，更利于产业化应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮的方法，属于天然产物提取与分离技术领域。

背景技术

银杏被称为“活化石”植物，是我国特有的珍贵树种，随着银杏叶中有效成分的药用、保健等综合价值的挖掘和开发，对银杏叶的系统研究在世界范围内掀起了高潮。银杏叶中蛋白质含量10.9％～15.5％，总糖含量7.3％～8.7％，还原糖含量4.0％～5.6％，黄酮含量0.4％～1.2％。已开发的银杏叶提取物主要是银杏叶总黄酮醇苷(含萜类内酯)提取物(简称：银杏叶黄酮)和银杏叶多糖。银杏叶黄酮和萜内酯具有清除自由基和扩张血管、拮抗血小板因子的作用；银杏叶多糖具有降低血糖、延缓衰老、提高免疫力的作用；银杏酸具有抗肿瘤、抗微生物的作用，但又有较强的胚胎毒性和细胞毒性。目前，已经有很多含银杏叶黄酮的保健食品和药品上市。关于银杏叶提取物方面的研究国内外文献报道较多，提取技术、功能应用、检测方法等等，也有相关一次性提取银杏叶多种提取物的专利报道。

中国专利申请CN 103130816A(申请号201210406959.6)公开了一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，包括原料前处理步骤、提取步骤、多糖沉淀步骤、大孔树脂分离步骤、硅胶干柱分离步骤、反相层析精制步骤和结晶步骤等，可同时得到银杏多糖、银杏提取物、银杏总黄酮、银杏总内酯、银杏内酯A、B、C单体等多种活性物质。所用原料是银杏叶干粉，加入纤维素酶及果胶酶破壁后，烘干，再采用乙醇溶液进行提取，提取液浓缩与金银花干粉混合絮凝得到多糖，絮凝后的上清液再经过大孔树脂分离、硅胶干柱、反相层析等步骤，得到银杏黄酮提取物、银杏内酯提取物等。该专利申请中多糖絮凝步骤额外添加了金银花干粉，银杏多糖测定结果中会含有金银花的相应成分。

中国专利CN 102603482A(申请号201210038103.8)公开了一种银杏叶多组分的分离技术，以银杏叶为原料，采用超声提取和超临界CO₂萃取——精馏相结合的技术实现有效多组分的分离。首先用不同浓度乙醇两次超声提取银杏叶，过滤得到的滤液和滤渣分别经以下工艺进行：1)将滤渣采用超临界CO₂萃取分离得聚戊烯醇类化合物；萃余物采用“水提醇沉”法分离得到银杏多糖；2)将滤液超滤、浓缩后采用超临界CO₂萃取，在适当的温度和压力下先分离得银杏酚酸类；改变萃取条件，启用精馏柱，采用轴向变温分四段加热，继续萃取分离出银杏萜类内酯和黄酮类化合物。该专利是以银杏叶为原料，先采用乙醇溶液萃取，萃取液用于分离银杏黄酮和萜类内酯，萃取渣用于制备银杏多糖。但超临界CO₂萃取产量低，产品纯度不高，且能耗和投资相对比较大，不利于大规模生产。

中国专利申请CN 105477026A(申请号201610073800.5)公开了一种从银杏外种皮中联合提取银杏酸、黄酮和萜内酯以及多糖的工艺，干燥的银杏外种皮经多次萃取后得到银杏酸粗提物和一次残渣，银杏酸粗提物进一步提纯后得到纯度大于97wt％的银杏酸；一次残渣经多次浸提后得到黄酮和萜内酯粗提物和二次残渣，黄酮和萜内酯粗提物进一步纯化后得到黄酮≥24wt％、萜内酯≥6wt％提取物；二次残渣经多次水提后得到多糖粗提物和无毒残渣，多糖粗提物进一步纯化后得到纯度大于98wt％银杏多糖。该专利中原料是银杏的外种皮，提取工艺是先分离得到银杏酸，再制备银杏黄酮，最后分离银杏多糖。

另外，银杏叶的贮存，目前一般是采购新鲜银杏叶(水分70％(w/w)以上)，用大型烘干机烘干至水分含量10％以内，储存备用。这一生产环节需要消耗大量的能源，导致生产企业生产成本也偏高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮的方法。本发明的方法，通过对新鲜的银杏叶进行乳酸菌发酵保藏，替代现有的烘干机烘干工艺，利于活性成分的浸出，节约能源，降低生产成本。保藏后的银杏叶，直接加水浸提，过滤，滤液浓缩，用于银杏多糖的生产，滤渣再用乙醇提取精制生产银杏叶黄酮提取物。原料先提取多糖再用于生产黄酮，可同时得到银杏叶多糖和黄酮两种产品，与现有技术中报道的工艺相比，银杏叶提取物的收率和提取率都得到了明显提高，且提高了后期精制纯化的效率，得到的产品纯度也明显提高。本发明的方法，比现有工艺更加节能，提取率更高，更利于产业化应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮的方法，包括以下步骤：

(1)发酵：将乳酸菌(市场购买的乳酸菌是固体粉状的，使用前先常温水活化，此为常规手段)与新鲜银杏叶按质量比1:1000～10000的比例混匀，密封条件(比如装在密封袋中)、缺氧条件、自然环境温度下发酵20天以上；在进行提取前3～5天，加入银杏叶质量的2％～6％的活性干酵母，继续密封发酵；

(2)水提：取出发酵后的银杏叶，按物料比1:5～12(重量比)的比例加入水，70～95℃提取0.5～3h，过滤，得提取液和银杏叶渣，提取液用于银杏叶多糖的提取，银杏叶渣用于银杏叶黄酮的提取；

(3)上述提取液，用乙醇溶液提取1～3次，每次提取时间6～24h，提取后离心分离，得上清液和沉淀，沉淀即为银杏叶多糖；

优选的，先将提取液浓缩至原体积的1/12～1/5，再加入1～5倍体积的95％(体积百分数)乙醇溶液，室温下提取6～24h；

(4)调整上述上清液的乙醇浓度至50％～70％(体积百分数)，与银杏叶渣按重量比5～12:1的比例混合，60～85℃回流提取2～6h，过滤，滤液为银杏叶黄酮粗提取物；

(5)银杏叶黄酮粗提取物回收乙醇后，陶瓷膜过滤(以除去部分色素、大分子物质)，透过液采用0.5～2BV/h流速通过大孔吸附树脂lx-5，用55％～75％(体积百分数)乙醇溶液洗脱，洗脱液以0.2～0.6BV/h流速直接通过大孔树脂lxd-200或D301，收集流出液，浓缩，回收乙醇，喷雾干燥，得银杏叶黄酮(符合国家药典标准的银杏叶提取物，含总黄酮醇苷、萜类内酯)。

所述乳酸菌、活性干酵母，为市售的含植物乳杆菌的乳酸菌保存剂和酿酒活性干酵母。本发明所采用的乳酸菌、活性干酵母，分别购自亚芯生物科技有限公司、安琪酵母。

本发明的从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮的方法，具有以下优点：

1、本发明采用乳酸菌保存鲜银杏叶，利于多糖和黄酮成分的浸出；替代现有的烘干机烘干银杏叶保存工艺，节约大量电能的消耗，降低企业生产成本。

2、本发明的工艺，在提取前3～5天，加入活性干酵母，可以降低提取液中单糖的含量，提高银杏叶多糖产品纯度，与其他工艺相比，银杏叶多糖达到相同的质量，可以减少一次醇沉的次数，或者相同醇沉次数时，多糖的含量要提高5.2％～8.9％，如表1所示。

3、银杏叶多糖醇沉后的上清液与银杏叶渣混合，用于提取银杏叶黄酮，可回收第一步水提工艺中损失的少许黄酮成分，同时减少新鲜乙醇的消耗量，节约生产成本。

4、本发明先用水提取制备银杏叶多糖，再用乙醇溶液提取银杏叶黄酮，与现在普遍采用的先提取银杏叶黄酮，剩余的渣再用于提取银杏叶多糖的技术相比，得到的银杏叶黄酮产品纯度要提高3.8％～6.4％，如表2所示，提高了企业生产效率，降低企业生产成本，经济效益十分显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮

步骤如下：

乳酸菌与鲜银杏叶(1kg，水分含量72.4％)按质量比1:1000混匀，装在密封袋中，自然环境温度发酵保藏90天；解开密封袋，加入银杏叶质量的4％的活性干酵母，封口3天取出；按物料比1:8加入无离子水，70℃提取3h，过滤；提取液浓缩8倍，用4倍体积的95％的乙醇室温下提取20h，离心分离，醇沉2次，沉淀烘干，得银杏叶多糖20.42g，，经检测，含量为48.4％(即银杏叶多糖纯度为48.4％)，提取率为7.4％。

上清液调整至乙醇浓度65％，与银杏叶渣按10:1混合，75℃回流提取2.5h，过滤，得到银杏叶黄酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜过滤，透过液采用2BV/h流速通过大孔吸附树脂lx-5，用60％乙醇洗脱，洗脱液以0.3BV/h流速直接通过大孔吸附树脂lxd-200，收集流出液，浓缩，回收乙醇，喷雾干燥，得银杏叶提取物(含总黄酮醇苷、萜类内酯)6.02g，经检测，总黄酮醇苷含量为31.3％，萜类内酯含量为7.1％；银杏叶黄酮提取率为87.5％(相对于银杏叶中黄酮含量计算)。

实施例2从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮

步骤如下：

乳酸菌与鲜银杏叶(10kg，水分含量72.4％)按质量比1:5000混匀，装在密封袋中，自然环境温度发酵保藏40天；解开密封袋，加入银杏叶质量的2.5％的活性干酵母，封口5天取出；按物料比的1:5加入无离子水，80℃提取2h，过滤；提取液浓缩5倍，用2倍体积的95％的乙醇室温下提取24h，离心分离，醇沉3次，沉淀烘干得到银杏叶多糖198g，含量52.8％，提取率为7.2％。

上清液调整至乙醇浓度55％，与银杏叶渣按5:1混合，80℃回流提取4h，过滤，得到银杏叶黄酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜过滤，透过液采用0.5BV/h流速通过大孔吸附树脂lx-5，用70％乙醇洗脱，洗脱液以0.6BV/h流速直接通过大孔吸附树脂lxd-200，收集流出液，浓缩，回收乙醇，喷雾干燥，得银杏叶提取物(总黄酮醇苷、萜类内酯)，得到银杏叶提取物55.7g，产品中总黄酮醇苷含量为30.6％，萜类内酯含量为6.4％；银杏叶黄酮提取率85.7％(相对于银杏叶中黄酮含量计算)。

实施例3从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮

步骤如下：

乳酸菌与鲜银杏叶(10kg，水分含量72.4％)按质量比1:10000混匀，装在密封袋中，自然环境温度发酵保藏21天；解开密封袋，加入银杏叶质量的5.4％的活性干酵母，封口3天取出；按物料比的1:12加入无离子水，90℃提取1.5h，过滤；提取液浓缩10倍，用5倍体积的95％的乙醇室温下提取10h，离心分离，醇沉3次，沉淀烘干得到银杏叶多糖215.3g，含量50.3％，提取率为7.8％。

上清液调整至乙醇浓度70％，与银杏叶渣按12:1混合，60℃回流提取2h，过滤，得到银杏叶黄酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜过滤，透过液采用1BV/h流速通过大孔吸附树脂lx-5，用75％乙醇洗脱，洗脱液以0.2BV/h流速直接通过大孔吸附树脂D301，收集流出液，浓缩，回收乙醇，喷雾干燥，得银杏叶提取物(总黄酮醇苷、萜类内酯)，得到银杏叶提取物60.8g，产品中总黄酮醇苷含量为28.2％，萜类内酯含量为7.0％；银杏叶黄酮提取率85.4％(相对于银杏叶中黄酮含量计算)。

实施例4从银杏叶中同时提取银杏叶多糖和银杏叶黄酮

步骤如下：

乳酸菌与鲜银杏叶(20kg，水分72.4％)按质量比1:6000混匀，装在密封袋中，自然环境温度发酵保藏52天；解开密封袋，加入银杏叶质量的2％的活性干酵母，封口4天取出；按物料比的1:10加入无离子水，70℃提取3h，过滤；提取液浓缩9倍，用3倍体积的95％的乙醇室温下提取6h，离心分离，醇沉3次，沉淀烘干得到银杏叶多糖430.1g，含量47.1％，提取率为7.8％。

上清液调整至乙醇浓度50％，与银杏叶渣按8:1混合，70℃回流提取3h，过滤，得到银杏叶黄酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜过滤，透过液采用1.2BV/h流速通过大孔吸附树脂lx-5，用68％乙醇洗脱，洗脱液以0.6BV/h流速直接通过大孔吸附树脂D301，收集流出液，浓缩，回收乙醇，喷雾干燥，得银杏叶提取物(总黄酮醇苷、萜类内酯)，得到银杏叶提取物127.7g，产品中总黄酮醇苷含量为27.8％，萜类内酯含量为6.7％；银杏叶黄酮提取率86.9％(相对于银杏叶中黄酮含量计算)。

实验本发明方法与常规方法的比较

(1)采用本发明的方法(具体方法步骤如实施例1、2、3、4所示，醇沉1次、2次、3次时均进行检测)提取银杏叶多糖，检测醇沉次数分别为1次、2次、3次时的多糖含量，如表1所示。同时，与常规方法(常规方法为未经发酵的传统水提醇沉工艺，表1中，常规方法与其相对应的实施例的方法的不同之处在于：不加入乳酸菌和酵母菌，直接向银杏叶中加入无离子水)进行对比。结果如表1所示。由表1可见，本发明的方法，可以提高银杏叶多糖产品纯度，与常规方法相比，相同醇沉次数时，多糖的含量要提高5.2％～8.9％。

表1

(2)采用本发明的方法(具体方法步骤如实施例1、2、3、4所示)提取银杏叶黄酮，检测总黄酮醇苷含量，如表2所示。同时，与常规方法(常规方法为未经发酵的传统提取黄酮工艺，表2中，常规方法与其相对应的实施例的方法的不同之处在于：不加入乳酸菌和酵母菌，直接向银杏叶中加入无离子水)进行对比。结果如表2所示。由表2可见，本发明的方法，与常规方法相比，得到的银杏叶黄酮产品纯度要提高3.8％～6.4％。

表2

银杏叶原料中黄酮含量％(绝干)本发明方法黄酮纯度未经发酵的传统工艺黄酮含量0.78％31.3％(实施例1)24.9％0.72％28.2％(实施例3)24.7％0.72％27.8％(实施例4)24.0％0.74％30.6％(实施例2)24.5％

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。