一种带有分子标志物的环状RNA及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其包括以下步骤：S1：将表达所述环状RNA的线性形式RNA的DNA构建体加入体外转录体系中，转录得到带有分子标志物并且5’末端为单磷酸基团的线性RNA；S2：将所述线性RNA加入连接体系，使所述线性RNA的5’端和3’端形成3’,5’‑磷酸二酯键，从而得到所述环状分子。本发明还涉及所述环状RNA在获得与细胞中所述环状RNA相互作用的蛋白质中的应用以及获得该蛋白质的方法。通过使用本发明的方法制备的环状RNA与原序列形成的环状RNA在结构上相似度极高，与蛋白的结合效力跟原序列所形成环状RNA基本没有差别，是研究与环状RNA相互作用的蛋白质的有力工具。

说明书

技术领域

本发明涉及环状RNA领域，更特别地，涉及一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，该方法制备的带有分子标志物的环状RNA，所述环状RNA在获得与细胞中所述环状RNA相互作用的蛋白质中的应用以及获得该蛋白质的方法。

背景技术

环状RNA(circular RNAs，circRNAs)是一类广泛存在于各种生物细胞中、具有调控基因表达功能的非编码RNA，具有结构稳定和组织特异性表达等特征。近年来，随着高通量测序技术的广泛应用，研究者们发现环状RNA具有保守性的特征。因此，这一类古老且的分子受到了极大的关注。

2012年，Salzman团队发现几百种与人类基因表达密切相关的环状RNA；2013年，Jeck团队在人类成纤维细胞中检测到了约2.5万种环状RNA。相继有大量关于环状RNA分子研究的文献报道，其中，哈佛医学院Salmena团队提出了著名的“ceRNA分子调控假说”。该假说认为，ceRNA的生物学功能是通过microRNA应答元件(miRNA response element，MRE)完成的，环状RNA分子可作为一种“分子海绵”，吸附大量micro RNA，进而影响基因的转录调控。

细胞内几乎所有分子都不是单独发挥作用的，需要结合相应的DNA、RNA或蛋白才能发挥正常的生物学功能。近年来，环状RNA分子与microRNA之间相互作用的研究越来越多，也越来越成熟，但是环状RNA与蛋白相互作用的研究却寥寥无几。究其原因，主要是目前尚缺乏大量获得带分子标记的环状RNA的分子生物学方法。本领域现有技术中，常常直接使用线性分子或通过在两端加接头形成环状分子来研究与环状RNA相互作用的蛋白质。然而，这样的分子在结构上与环状RNA的差异极大，因此，其得到的结果可信度非常低。也有些研究者公开了一些合成环状RNA的方法，但是，他们的方法往往需要进行复杂的化学处理步骤，从而降低了合成的可靠性，并推高了人工成本和试剂成本。

因此，为了深入了解环状RNA分子，阐明其生物学功能，需要一种简单低廉的分子生物学方法来合成带分子标记的环状RNA。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其包括以下步骤：

S1：将表达所述环状RNA的线性形式RNA的DNA构建体加入体外转录体系中，转录得到带有分子标志物并且5’末端为单磷酸基团的线性RNA；

S2：将所述线性RNA加入连接体系，使所述线性RNA的5’端和3’端形成3’,5’-磷酸二酯键，从而得到所述环状分子。

优选地，所述体外转录体系中包含所述线性RNA的5’端第一个核糖核苷的单磷酸形式，以及所有四种核糖核苷的三磷酸形式，并且所述四种核糖核苷的三磷酸形式中的一种或多种被分子标志物标记，所述核糖核苷单磷酸的浓度高于其对应的核糖核苷三磷酸的浓度。

优选地，所述核糖核苷单磷酸的浓度是其所对应的核糖核苷三磷酸浓度的5-15倍。

优选地，所述分子标志物是生物素。

优选地，所述连接体系中包含RNA连接酶和单链引导DNA，所述引导DNA的5’端与所述线性RNA的5’端互补，3’端与所述线性RNA的3’端互补，所述引导DNA的两端分别与所述线性RNA的5’端和3’端结合，并使所述线性RNA的5’端和3’端分别有0-10个碱基游离。

优选地，所述引导DNA的5’端和3’端分别独立地为8-15nt长，所述引导DNA的3’端与5’端之间无间隔序列，或者有小于等于5nt的间隔序列。

本发明还提供了上述方法制备的环状RNA。

本发明还提供了所述环状RNA在获得与细胞中所述环状RNA相互作用的蛋白质中的应用。

本发明还提供了一种获得与细胞中环状RNA相互作用的蛋白质的方法，其包括以下步骤：

S3：将上述环状RNA作为探针，与细胞裂解液共同孵育，所述环状RNA跟与其相互作用的蛋白质形成环状RNA-蛋白复合物；

S4：通过所述分子标志物捕获所述环状RNA-蛋白复合物；

S5：从捕获的所述环状RNA-蛋白复合物分离得到所述蛋白质。

优选地，所述分子标志物是生物素，并且通过磁珠捕获所述环状RNA-蛋白复合物。

通过使用本发明的方法制备的环状RNA的序列仅在原序列的5’端多了少数几个多余的碱基，所形成的环状RNA与原序列形成的环状RNA在结构上相似度极高，与蛋白的结合效力跟原序列所形成环状RNA基本没有差别。所制备的环状RNA还带有分子标记，因此，是研究与环状RNA相互作用的蛋白质的有力工具。

附图说明

图1为研究环状RNA以及与其相互作用的蛋白质的流程图；

图2为guide DNA与线性RNA的结合示意图；

图3为RNA酶R消化处理后，将RNA在3％变性琼脂糖凝胶中电泳的电泳图；

图4为RNA酶R处理的环状RNA探针经过逆转录PCR后，DNA产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳的电泳图；

图5为环状RNA探针进行RNA pull-down实验得到将蛋白洗脱之后在12％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳后进行考马斯亮蓝染色得到的染色照片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明以环状RNA分子hsa_circ_0123777为例来进一步阐述本发明的内容，流程如图1所示。

1.hsa_circ_0123777表达载体的构建

在circular interactome网站(http://circinteractome.nia.nih.gov)中找到环状RNA分子hsa_circ_0123777的编码序列(SEQ ID NO:1)。以人类基因组DNA为模版扩增环状RNA分子的线性序列。为确保成功构建载体，设计引物时，在引物的5'端加入相应的限制性内切酶酶切位点。本例在前引物中加入HindIII(CCCAAGCTT)酶切位点，在后引物中加入BamH I(CGCGGATCC)酶切位点。扩增成功后用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收(DNA胶回收试剂盒购买自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，DNA产物放至-20℃保存。如果无法成功扩增环状RNA分子的线性DNA序列，可以找相应的生物公司合成。

将该环状RNA的线性序列连接到可用于体外转录的真核表达载体中，具体方法如下：选用的真核克隆载体为pcDNA3.1(+)-myc-His C(可进行体外转录的真核载体均符合条件)。用内切酶Hind III和Bam HI(购自TAKARA公司，Hind III货号为1060,BamH I货号为1010)分别对上述DNA产物和pcDNA3.1(+)-myc-His C空载体进行双酶切，酶切体系如下：

DNA产物酶切体系，总体积30μl：10x QuickCut Green buffer 3μl，Hind III 1.5μl，BamH I 1.5μl，DNA产物2μg，余下为ddH₂O；

pcDNA3.1(+)-myc-His C空载体双酶切体系，总体积20μl：10x QuickCut Greenbuffer 2μl，Bam HI 1μl，Hind III 1μl，pcDNA3.1(+)空载1μg，余下为ddH₂O；

充分混匀后，37℃，反应1.5小时，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，回收结束后测样品浓度。

将上述双酶切DNA产物连接至pcDNA3.1(+)-myc-His C克隆载体上。10μl体系中包含5μl DNA连接酶(DNA连接酶试剂盒购自TAKARA公司，货号为6022)，DNA双酶切产物和pcDNA3.1(+)-myc-His C双酶切克隆载体合计5μl，保证DNA产物与克隆载体的摩尔比为10:1，16℃连接1小时，连接反应结束后置于冰上备用；

将含有环状RNA线性DNA序列的pcDNA3.1(+)-myc-His C质粒载体转化进入大肠杆菌。具体方法如下：从-80℃中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上解冻2-3分钟，加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育20分钟后42℃热激60秒，迅速放至冰上静置2分钟，然后加入450μl不含抗生素的无菌LB液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时，复苏条件为37℃，200转/分钟。取复苏后的菌液100μl均匀涂布于直径为3.5厘米含氨苄青霉素抗性的LB固体选择培养基中，吸收10分钟后，倒置于37℃恒温培养箱中过夜。次日挑取单菌落至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，经37℃200转/分钟，摇菌繁殖12小时后提取质粒，1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定；

用内切酶Hind III和BamH I(购自TAKARA公司，Hind III货号为1060,BamH I货号为1010)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认DNA片段已整合至pcDNA3.1(+)-myc-His C载体上，重组质粒构建成功。

2.体外转录

将上述进行体外转录构建成功的重组质粒进行体外转录，体外转录体系中额外加入单磷酸鸟苷(GMP)和生物素标记的尿嘧啶(Biotin-16-UTP)，合成大量被生物素标记并且5’端为单磷酸基团的线性RNA。具体方法如下：

质粒线性化：用内切酶BamH I对pcDNA3.1(+)-myc-His C重组质粒的T7启动子下游3’端进行单酶切。20μl酶切体系：10x QuickCut Green buffer 3μl，BamH I 1.5μl，pcDNA3.1(+)重组质粒7μg，余下为ddH₂O；

质粒线性化体系在37℃条件下反应2小时，确保充分切开。用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳进行鉴定并回收线性质粒(DNA胶回收试剂盒购买自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，检测线性化处理后质粒回收产物的浓度；

线性化质粒的去磷酸化：用内切酶BamH I酶切使质粒线性化之后，质粒的粘性末端基团分别为单磷酸和羟基，磷酸基团与羟基结合成磷酸二酯键之后可使线性化质粒自身连接成完整的质粒。而当去除了粘性末端单磷酸基团后，该磷酸基团变为羟基，因此无法形成磷酸二酯键，无法连接成完整的质粒。为防止BamH I酶切线性化后质粒自身连接，使用小牛碱性磷酸酶CIAP(CIAP购买自TAKARA公司，货号为2250A)去磷酸化，50μl去磷酸化体系如下：10x Buffer 5μl，CIAP 3μl，线性化质粒30μl，余下为ddH₂O；

充分混匀后，在37℃条件下反应1小时。反应结束后用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳进行鉴定并回收(DNA胶回收试剂盒购买自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，测浓度后-20℃保存，备用；

体外转录的原料中包含Biotin-16-UTP，使体外转录的产物被Biotin标记；

因体外合成的外源线性RNA的5’端为三磷酸结构，3’端为羟基结果，使得外源线性RNA的5’端无法与3’端连接形成环状，所以必须保证5’端为单磷酸结构，这样外源线性RNA的首尾才能相连成环状结构。在本例中，表达载体的转录起始点是G,所以，体外转录的原料还包括大量GMP，GMP:GTP＝5-15:1(在本例中为10:1)(GMP购买自北京索莱宝科技有限公司，货号为G8850)，使体外转录的RNA中包含大量被生物素标记并且5’端为单磷酸基团的线性RNA，确保环化的顺利进行；

Biotin RNA labeled mix(Biotin-16-UTP购买自ROCHE公司，货号为11388908910)配制：ATP/CTP/GTP/UTP为100mM,Biotin-16-UTP为10mM，配制完成后-20℃保存。NTP浓度为10mM，体外转录时NTP的工作终浓度应为1mM；

体外转录所用的RNA聚合酶为T7RNA polymerase(T7RNA polymerase购买自碧云天，货号为D7069)，30μl体外转录体系配制如下：5x Transcription Buffer 6μl，BiotinRNA labeled mix 3μl，GMP(100mM)3μl，T7RNA聚合酶3μl，RNA酶抑制剂1μl，线性化质粒1μg，余下为ddH₂O；

充分混匀后，在37℃条件下，反应4h。反应结束后用2％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定大小正确后用RNA回收试剂盒回收(RNA回收试剂盒购买自Zymo Research公司，货号为R1011)，样品-80℃保存。至此，制备出大量被生物素标记的线性RNA，该线性RNA的编码序列如SEQ ID NO:3所示，在环状RNA的编码序列的两端分别多了一小段载体序列和添加的酶切位点序列，而这些多出来的序列很短，并且对环状RNA的结构没有影响。

3.连接成环：将上述RNA的5’端和3’端连接，形成3,5磷酸二酯键，合成带有生物素标签的外源环状RNA探针，具体实施方法如下：

设计guide DNA：为促进环化效率，现设计单链guide DNA。该单链guide DNA 5’端和3’端分别有8-15个碱基可分别与上述RNA的5’端和3’端碱基互补配对，中间多出一段间隔序列(gap splint)无法与上述RNA结合，或者该间隔序列也可以不存在。在本例中，guideDNA序列如SEQ ID NO:2所示。使上述RNA的首尾与该guide DNA结合后，RNA的5’末端和3’末端分别有0-10个碱基游离，形成单链连接的模型，示意图如图2所示；

使用T4RNA LigaseⅠ(购买自碧云天，货号为D7021)催化单链RNA分子内5’末端磷酸基团与3'末端羟基基团之间形成磷酸二酯键，首尾连接成功后形成环状RNA分子，30μl体外环化体系：10×Reaction Buffer 3μl，T4RNA LigaseⅠ2μl，ATP 2μl，BSA 2μl，RNA酶抑制剂1μl，线性RNA 2μg，guide DNA(100mM)3μl，余下为ddH₂O；

充分混匀后在37℃条件下反应4小时，反应结束后用3％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定环化情况，环化RNA分子与线性RNA分子相比，电泳速度更慢。余下产物经RNA纯化回收(RNA回收试剂盒购买自Zymo Research，货号为R1011)后-80℃保存。

4.消化线性RNA：用RNA酶R切掉未环化成功的线性RNA，得到纯化的外源环状RNA探针，具体实施方案如下：

RNA酶R(购买自epicentre公司，货号为RNR07250)消化，去除线性RNA干扰。具体消化体系如下：反应结束后用3％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定环化情况，环化RNA分子与线性RNA分子相比，电泳速度更慢。余下产物经RNA纯化回收(RNA回收试剂盒购买自Zymo Research，货号为R1011)后-80℃保存；

10μl消化体系为：10x Buffer 1μl，RNase R 1U，RNA 0.5μg，余下为ddH₂O；

充分混匀后在37℃条件下反应10分钟，然后于85℃处理5秒灭活RNA酶，RNase R消化结束后，用3％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定环化效率。本发明实施例环化效率检测如图3所示；

使用随机引物将体外环化的RNA产物逆转录(逆转录试剂盒购买自TAKARA公司，货号为RR037A)，10μl逆转录体系中包含2μl Buffer，0.5ul MIX，0.5μl Randam primer 6，0.5μg RNA，最后双蒸水补足体系。37℃，反应15分钟，85℃灭活5秒。以逆转录所得到的cDNA作为模版进行普通PCR，PCR结束后电泳(图4)回收DNA产物，并送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认环化位点的存在。

5.RNA pull-down实验：将制备的环状RNA探针与细胞裂解液共同孵育，形成RNA-蛋白质复合物，该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而对RNA富集，获得磁珠-环状RNA探针-蛋白质复合物。具体实施方案如下：

RNA pull-down实验中，每个样品所需要的细胞量为1000万个细胞(约合一个直径为10cm的培养皿)，本实施例收集2个培养皿，一个作为对照组，另外一个样品作为实验组；

关于实验对照和处理分组，本实施例采用未环化的RNA探针作为对照组，即线性的RNA探针；本实施例采用环化后的探针作为实验组，即环状RNA探针；

将制备的环状RNA探针与细胞裂解液在4℃条件下，360度旋转摇床中杂交孵育过夜。杂交的体系中包括细胞裂解液、RNA探针、链霉亲和素标记的磁珠(购买自ThermoFisher公司，货号为11205D)、RNA酶抑制剂(RNA酶抑制剂Recombinant RNase Inhibitor购买自TAKARA公司，货号为2313A)，蛋白酶抑制剂(PMSF购买自Thermo Fisher公司，货号为36978B；cocktail购买自ROCHE公司，货号为04693132001)；

用PBS清洗磁珠3次，消除非特异性结合造成的干扰，PBS中加入蛋白酶抑制剂(PMSF购买自Thermo Fisher公司，货号为36978B；cocktail购买自ROCHE公司，货号为04693132001)。注意清洗磁珠弃上清时不要完全将EP管内的液体吸净，前2次经离心后每次留50μl液体，最后一次则全部吸净，获得纯化的磁珠-环状RNA探针-蛋白质复合物。

6.蛋白质的回收和分析：将所述磁珠-环状RNA探针-蛋白质复合物洗脱，获得纯化的蛋白质，进行蛋白质检测，如Western Blot和质谱分析，找到与环状RNA相互作用的蛋白。具体实施方案入如下：

利用酸碱变性的原理，将结合在环状RNA探针上的蛋白洗脱下来，进行蛋白质检测；

具体的洗脱方式如下：配制0.1M Glycine-HCl洗脱液(PH＝2.5-3.0)，1.5M TRIS-HCl洗脱液(PH＝8.8)。首先在磁珠-环状RNA探针-蛋白质复合物中加入0.1M Glycine-HCl洗脱液50μl，充分混匀后静置30秒，打断蛋白与RNA之间的连接，然后加入1.5M TRIS-HCl洗脱液1μl,充分混匀进行酸碱中和，然后12000转/分钟离心1分钟，取上清收集在一个新的EP管内；重复上述操作继续洗脱一次，最后收集102μl蛋白洗脱液置于液氮速冻，10分钟后从液氮中取出放至-80℃保存；

取出30μl蛋白洗脱液，加入5×蛋白质变性Loading Buffer 6μl，充分混匀后置于95℃水浴锅中加热10分钟使蛋白变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)，80V恒压电泳90分钟后将胶切下，用固定液(40％乙醇，10％乙酸)浸泡后置于37℃恒温培养箱中固定30分钟，固定结束后用考马斯亮蓝于37℃恒温培养箱中染色30分钟，再用固定液(40％乙醇，10％乙酸)进行褪色，37℃恒温培养箱中褪色30分钟后更换固定液，并置于4℃冷库脱色过夜，观察考马斯亮蓝染色情况，初步判断经过RNA pull-down实验后，是否有蛋白被拉下来，证明存在与环状RNA相互作用的蛋白质。洗脱的蛋白质进行电泳后的考马斯亮蓝染色如附图5所示。

剩下的蛋白洗脱液送至武汉生物技术研究院进行蛋白质质谱检测。最终找到与环状RNA相互作用的蛋白质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 254

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atattgatgg acagtatgca atgactcgag ctcagagggt acgagctgct atgttccctg 60

agacattaga tgagggcatg cagatcccat ctacacagtt tgatgctgct catcccacta 120

atgtccagcg tttggctgaa ccatcacaga tgctgaaaca tgcagttgta aacttgatta 180

actatcaaga tgatgcagaa cttgccacac gtgcaatccc tgaactgaca aaactgctaa 240

atgacgagga ccag 254

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgaggacca gggagaaagc tgg 23

<210> 3

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggagaccca agctggctag ttaagcttat attgatggac agtatgcaat gactcgagct 60

cagagggtac gagctgctat gttccctgag acattagatg agggcatgca gatcccatct 120

acacagtttg atgctgctca tcccactaat gtccagcgtt tggctgaacc atcacagatg 180

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