一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒

摘要

本发明公开了一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒，以结核分枝杆菌Rv0189c蛋白或其类似物作为诊断标志物。本发明通过ELISA方法对受试者的血液或体液标本进行检测，用于区分活动性和潜伏性结核感染，单独使用其敏感性达到62.4％，特异性为88.4％。当与其他诊断抗原(如16kD,LAM)合用，可进一步提高诊断的敏感性。本发明的检测只需要单份样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合基层地区大规模的结核感染检测。

说明书

技术领域

本发明属结核病诊断技术领域，具体涉及一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒。

背景技术

结核病是当今全球面临的主要公共健康问题之一，它的病原体是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，属分枝杆菌属。近年来，由于耐药结核病、人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核分枝杆菌感染、大规模人口流动等问题的出现，结核病疫情出现加重的趋势。目前，全球每年约有900万人发展成活动性结核，200万～300万人死于结核病。据估计，目前全世界约有1/3的人口感染了Mtb，其中绝大多数为潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)，即机体的免疫系统能够控制结核杆菌的复制而不发展成为结核病，但又不能将其彻底清除的状态。此时结核杆菌处于潜伏状态，在在免疫力低下者中，结核杆菌能够重新复制，发展成为活动性肺结核从而成为新的传染源。感染者终生约有5％～10％的风险发展成为活动性结核病，若同时伴有HIV的感染，这种概率则高达每年10％，远高于HIV阴性者。流行病学调查显示约有85％～90％新诊断的活动性肺结核系结核菌素试验阳性的LTBI演变而来。因此，对LTBI者的进行早期诊断和预防性治疗，既能够减少已感染结核杆菌者的发病机会，又可以通过影响发病，来减少结核杆菌在人群中的传播。

自1976年Hassau等建立用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗结核分支杆菌抗体的方法以来，结核病的血清学诊断方法得到飞速发展，技术日益成熟，并得到了越来越广泛的应用。血清学诊断具有快速、简便、低廉且不需要活细胞等优点。这些年来，在血清学诊断抗原方面的研究已经取得了相当大的进步，确认了几个很有希望的血清学抗原，如38kDa,Lipoarabinomannan(LAM)，16kDa(Rv2031c),MTB81(Rv1837c),ESAT-6(Rv3875),Antigen 85B(Rv1886c),Antigen60以及选取不同蛋白的融合蛋白等.目前已有数种商品化的结核血清学诊断试剂盒，包括应用结核抗原Antigen 60的Anda-TB检测(Anda Biologicals，Strasbourg,France)，应用LAM及38kDa抗原的Pathozyme Myco及应用38kDa和16kD抗原的Pathozyme TB Complex Plus(Omega Diganostics,Allo,Scotland,UK)及应用LAM抗原的MycoDot(Blackstone,Massachusetts,USA)。对现有商品化试剂盒的meta分析表明,无论是在肺结核还是肺结核的诊断中，现有的商品化血清学检测方法均未达到理想的诊断效果。因此，发现新的血清学诊断抗原标志物，并建立新的结核病免疫诊断方法以及相应的试剂盒是结核病诊断所急需的。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种特异性和敏感性俱佳的结核快速检测试剂及相应的试剂盒。本发明的检测试剂盒检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉。

为了实现上述技术目的，本发明提供的技术措施包括：

本发明首先公开了一种用于区分活动性及潜伏性结核感染的检测抗原Rv0189c抗原。该抗原是由结核分枝杆菌基因Rv1985c所编码的蛋白。结核杆菌Rv1985c蛋白包含575个氨基酸，分子量59.4kDa。该蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

本发明所述的Rv0189c抗原能够制备结核性血清学诊断试剂，用于区分活动性及潜伏性结核感染。

本发明的再一个目的是提供一种快速检测结核病的诊断试剂盒。它包含上述重组蛋白Rv0189c和Rv0189c抗体的阳性对照试剂，这类试剂可以是含Rv1985c阳性抗体的动物血清或通过杂交瘤细胞培育出的Rv1985c单克隆抗体。如待测者体液中抗体的滴度超过了阳性对照试剂，则判定为阳性。

本发明涉及的试剂盒中，除了有重组抗原Rv0189c和其特异性抗体外，还应用用于检测的各种试剂和器具，包括各种缓冲液、稀释液、反应液和终止液。

本发明中所述的蛋白除了通常所指的一种氨基酸聚合物，还应该包括其类似物如多肽。多肽可与上述蛋白序列同源，这个类似物能够与蛋白同样结合到相同的抗体分子上，且类似物中处于等价位置上的氨基酸与原始肽中的那些抗原序列相同或保守。

本发明所述的蛋白和多肽可以通过天然分离获得，也可以通过人工合成。一种具有代表性的方法是用较长的融合蛋白制备上述肽段，次融合蛋白包含上述代表性的肽段序列。所述肽也可由多肽经过物理或化学裂解所产生。

本发明中所涉及的可用于检测的免疫反应包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay,ELISA)，免疫沉淀实验，免疫凝集实验，免疫荧光实验，胶体金免疫层析法等。

在本发明中，采用多孔塑料或聚酯板作为反应界面，由于抗原蛋白可以与之非特异性结合，样本中的抗原特异性抗体能够与包被Rv0189c抗原的多孔板相互作用，形成的抗原抗体复合物与酶联的第二抗体进行反应，洗去未结合的酶标抗体，加入底物后产生带有颜色的产物，在检测仪上测得增加的光吸收值。

本发明的另一重要目的是提供一种快速检测并区分活动性及潜伏性结核感染的方法，即本发明的试剂盒的使用方法，主要包括以下步骤:

a)使用Rv0189c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介质；

b)采集待测样品，通常是受试者的血清，稀释一定倍数；

c)将稀释后样品加入介质中与Rv0189c反应；

d)加入酶联或胶体金等染料偶联试剂，该试剂能与Rv0189c抗原抗体复合物特异反应。典型的试剂如:酶联Rv0189c多肤，Protein A，抗IgG,IgM二抗等；

e)直接显色或加入显色剂显色；

f)肉眼或仪器读取颜色的改变，以超过一定域值的颜色改变判定为阳性检测。

值得注意的是，该方法至少使用Rv0189c一种抗原用于检测相应抗体，但不局限于该种抗原。与其他有较高诊断价值的结核抗原，如LAM,38kDa,30kDa,16KDa,A60等抗原一起使用，可以提高检测的阳性检出率。

本发明提供了一种特异性和敏感性俱佳的结核快速检测试剂，可应用受试者的血液或体液标本进行检测，并区分活动性结核病和潜伏性结核感染，具有较高临床应用价值。本发明的检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合基层地区大规模的结核感染检测。

附图说明

图1为活动性结核患者(ATB)和潜伏性结核感染者(LTBI)血清样本中Rv0189c特异性IgG抗体的检测含量。

图2为血清样本中Rv0189c特异性IgG抗体诊断活动性结核患者(ATB)和潜伏性结核感染者(LTBI)的受试者工作曲线(ROC曲线)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1.重组Rv0189c抗原作为检测试剂用于区分活动性及潜伏性结核感染

1.收集临床标本

(1)病史资料采集：

采用问卷调查表形式，由专科医务人员分别调查入选病例的性别、年龄、BCG接种史、既往结核病病史、近期活动性结核密切接触史、慢性风湿性疾病诊断、入组前3个月免疫抑制剂治疗情况等相关病史。对排除新发活动性结核、慢性风湿性疾病及HIV感染可能，无免疫抑制剂治疗史及既往结核病史的26例健康对照者收集其性别、年龄、BCG接种史等基本情况。入组时对所有研究对象均拍摄胸片以排除新发活动性结核，并记录有无陈旧性肺结核病灶或其他非正常影像学表现。

(2)活动性结核病人及潜伏性结核感染者的入选：

活动性结核组(ATB group)：入选活动性结核患者28例，要求入选者年龄在18岁以上，HIV(-)，排除肿瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染(如慢性HBV/HCV感染等)；且尚未接受抗结核治疗。潜伏性结核组(LTBI group)：在活动性肺结核患者的家庭接触者中筛选LTBI者，入选34例。要求结核特异QuantiFERON或T-SPOT.TB检测为阳性。所有入选者签署知情同意书。抽取入选者的外周血，同时记录相关临床资料。

(3)标本采集与处理：

每个入选研究对象用肝素抗凝的真空采血管采集外周血4ml。血浆标本为将全血200g，离心15min，吸取上清，保存在冻存管内，-80℃冻存

2.使用重组蛋白Rv0189c制备区分活动性及潜伏性结核感染的诊断试剂盒

(1)利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测活动性结核患者和结核潜伏感染者

两组人群血清标本中IgG的免疫应答。

具体检测步骤为

1)包被：抗原为100ul/孔，浓度为5ug/ml；

2)洗板：PBST 300ul/孔，3min，洗3次；

3)封闭：1％BSA/PBS，300ul/孔，37℃孵育1h；

4)洗板：PBST 300ul/孔，3min，洗3次；

5)加入稀释的待测血清(除Rv1985c IgG 1：500稀释，其他均以1：100稀释)，100ul/孔，37℃孵育1h；

6)洗板：PBST 300ul/孔，5min，洗5次；

7)加酶标二抗：加入新鲜稀释的酶标抗体(1:2000稀释)100ul/孔，37℃孵育1h；

8)洗板：PBST 300ul/孔，5min，洗5次；

9)显色：加入现配的底物溶液100ul/孔，37℃30min；

10)终止：2M H₂SO₄，50ul/孔；

11)测定：492nm，670nm，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

(2)统计方法

对于Rv0189c抗原的ELISA结果，以健康对照者血清的平均OD值加上2倍标准方差作为判定阈值，若大于此阈值，即判断为阳性，反之则为阴性。采用单尾ANOVA测试对三组人群之间OD值的差异进行统计分析。

3.检测结果

在实施例中，有四种商品化诊断试剂盒作为对照，分别为The PATHOZYME-MYCO IgG(Myco G),The PATHOZYME TB complex plus(TB complex),The IBL M.tuberculosis IgG ELISA(IBL)和The Anda Biologicals TB(Anda-TB)试剂盒。他们被作为一种血清学诊断对照方法与我们研究的Rv0189c抗原作比较。

结果表明，Rv0189c特异性的IgG抗体水平在活动性结核病人中显著高于潜伏性结核感染组(p<0.001)(图1)。应用ROC分析，可以得到它的曲线下面积AUC为0.8213，得到最佳诊断阈值为157U/ml(图2)。在这一阈值下，Rv0189c抗原在活动性及潜伏性结核感染组中的阳性率分别为62.4％和11.6％(表1)。Rv0189c抗原作为标志物区分活动及潜伏性结核感染的敏感性为62.4％，特异性为88.4％。尽管Rv0189c抗原蛋白单独用于区分活动性及潜伏性结核诊断，其诊断的准确性有不足，但如果与其它血清学诊断试剂盒如Anda-TB或TB complex联用，能够明显的提高诊断效果。如Rv0189c联合TB complex试剂盒，其敏感性可达82.7％，特异性为87.4。

表1.Rv0189c蛋白区分活动性及潜伏性结核感染的敏感性和特异性

通过上述实施例的7组对比实验能够知道，Rv0189c蛋白区分活动性及潜伏性结核感染的敏感性明显优于四组对照试剂，同时特异性也较好。Rv0189c蛋白作为结核快速检测试剂，可应用受试者的血液或体液标本进行检测，并区分活动性结核病和潜伏性结核感染，具有较高临床应用价值。本发明的检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合基层地区大规模的结核感染检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

<110> 复旦大学附属华山医院

<120> 一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒

<160> 1

<210> 1

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Gln Thr Thr Asp Glu Ala Ala Ser Val Ser Thr Val Ala Asp

1 5 1015

Ile Lys Pro Arg Ser Arg Asp Val Thr Asp Gly Leu Glu Lys Ala Ala

202530

Ala Arg Gly Met Leu Arg Ala Val Gly Met Asp Asp Glu Asp Phe Ala

354045

Lys Pro Gln Ile Gly Val Ala Ser Ser Trp Asn Glu Ile Thr Pro Cys

505560

Asn Leu Ser Leu Asp Arg Leu Ala Asn Ala Val Lys Glu Gly Val Phe

65707580

Ser Ala Gly Gly Tyr Pro Leu Glu Phe Gly Thr Ile Ser Val Ser Asp

859095

Gly Ile Ser Met Gly His Glu Gly Met His Phe Ser Leu Val Ser Arg

100 105 110

Glu Val Ile Ala Asp Ser Val Glu Val Val Met Gln Ala Glu Arg Leu

115 120 125

Asp Gly Ser Val Leu Leu Ala Gly Cys Asp Lys Ser Leu Pro Gly Met

130 135 140

Leu Met Ala Ala Ala Arg Leu Asp Leu Ala Ala Val Phe Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Gly Ser Ile Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ser Asp Gly Ser Glu Arg

165 170 175

Asp Val Thr Ile Ile Asp Ala Phe Glu Ala Val Gly Ala Cys Ser Arg

180 185 190

Gly Leu Met Ser Arg Ala Asp Val Asp Ala Ile Glu Arg Ala Ile Cys

195 200 205

Pro Gly Glu Gly Ala Cys Gly Gly Met Tyr Thr Ala Asn Thr Met Ala

210 215 220

Ser Ala Ala Glu Ala Leu Gly Met Ser Leu Pro Gly Ser Ala Ala Pro

225 230 235 240

Pro Ala Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe Ala Arg Arg Ser Gly Gln

245 250 255

Ala Val Val Glu Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Ala Arg Asp Ile Leu

260 265 270

Thr Lys Glu Ala Phe Glu Asn Ala Ile Ala Val Val Met Ala Phe Gly

275 280 285

Gly Ser Thr Asn Ala Val Leu His Leu Leu Ala Ile Ala His Glu Ala

290 295 300

Asn Val Ala Leu Ser Leu Gln Asp Phe Ser Arg Ile Gly Ser Gly Val

305 310 315 320

Pro His Leu Ala Asp Val Lys Pro Phe Gly Arg His Val Met Ser Asp

325 330 335

Val Asp His Ile Gly Gly Val Pro Val Val Met Lys Ala Leu Leu Asp

340 345 350

Ala Gly Leu Leu His Gly Asp Cys Leu Thr Val Thr Gly His Thr Met

355 360 365

Ala Glu Asn Leu Ala Ala Ile Thr Pro Pro Asp Pro Asp Gly Lys Val

370 375 380

Leu Arg Ala Leu Ala Asn Pro Ile His Pro Ser Gly Gly Ile Thr Ile

385 390 395 400

Leu His Gly Ser Leu Ala Pro Glu Gly Ala Val Val Lys Thr Ala Gly

405 410 415

Phe Asp Ser Asp Val Phe Glu Gly Thr Ala Arg Val Phe Asp Gly Glu

420 425 430

Arg Ala Ala Leu Asp Ala Leu Glu Asp Gly Thr Ile Thr Val Gly Asp

435 440 445

Ala Val Val Ile Arg Tyr Glu Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Met Arg

450 455 460

Glu Met Leu Ala Ile Thr Gly Ala Ile Lys Gly Ala Gly Leu Gly Lys

465 470 475 480

Asp Val Leu Leu Leu Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Thr Thr Gly

485 490 495

Leu Cys Val Gly His Ile Ala Pro Glu Ala Val Asp Gly Gly Pro Ile

500 505 510

Ala Leu Leu Arg Asn Gly Asp Arg Ile Arg Leu Asp Val Ala Gly Arg

515 520 525

Val Leu Asp Val Leu Ala Asp Pro Ala Glu Phe Ala Ser Arg Gln Gln

530 535 540

Asp Phe Ser Pro Pro Pro Pro Arg Tyr Thr Thr Gly Val Leu Ser Lys

545 550 555 560

Tyr Val Lys Leu Val Ser Ser Ala Ala Val Gly Ala Val Cys Gly

565 570 575