高灵敏单线态氧磷光探针的制备及其应用

摘要

本发明公布了一个双核钌配合物的制备方法及其单线态氧传感器方面的应用。以单线态氧的浓度的对数值为横坐标，发光强度的对数值为纵坐标绘制出标准工作曲线，用于测定中性和碱性水介质中单线态氧浓度。该方法具有可见光激发、高灵敏度、高选择性和易操作的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及溶液中单线态氧(¹O₂)的测定，具体地说是一类含有蒽环衍生物配体的一种双核钌金属配合物单线态氧磷光探针的制备及其应用。

背景技术

单线态氧是氧分子处于高能激发态的一种不稳定的存在形式，单线态氧作为有机化学中一种珍贵试剂，在许多光化学和光生物反应，如光降解、污染物的光转化、化学发光、生物体氧化老化、甚至是光致癌作用等过程中，都扮演着十分重要的角色。在有机合成中，单线态氧使得在高度立体专一的有机化合物中引入氧变得极为容易。在生物体系中，单线态氧对生命体系有着重大的影响，单线态的生理学氧化作用越来越受到研究者的关注。单线态氧在细胞损伤和凋亡中起着重要的作用，它可能造成对机体的强氧化性损伤，从而引起机体脂质过氧化作用的发生，导致生物膜、小动脉、DNA、蛋白质和中枢神经系统的损伤，加快机体的衰老和死亡,因此被认为是体内重要的毒性物种,引发与氧化损伤有关的疾病，如白内障、肺水肿、糖尿病、肌肉萎缩、营养缺乏、精神病和肿瘤萌生等[(a)K.Briviba,L.O.Klotz,H.Sies,Toxic and signaling effects of photochemically or chemicallygenerated singlet oxygen in biological systems,Biol.Chem.,1997,378,1259.b)J.R.Wagner,P.A.Motchnik,R.Stocker,H.Sies,B.N.Ames,The oxidation of bloodplasma and low density lipoprotein components by chemically generated singletoxygen,J.Biol.Chem.,1993,268,18502.]。单线态氧在细胞的增生、分化、凋亡等调控中也起重要作用，被认为是一种新的第二信使[(a)R.W.Redmond,I.E.Kochevar,Spatiallyresolved cellular responses to singlet oxygen,Photochem.Photobiol.,2006,82(5),1178-1186.(b)N.L.Oleinick,R.L.Morris,I.Belichenko,The role of apoptosisin response to photodynamic therapy:what,where,why,and how,Photochem.Photobiol.Sci.,2002,1,1–21.]。相反，人们也可以利用单线态氧的强氧化性质去杀死恶性肿瘤细胞或组织，达到治愈癌症的目的。实验发现，当恶性肿瘤细胞获取并结合单线态氧敏化剂药物的能力显著大于正常组织时，通 过光照后，药物分子产生的单线态氧就能选择性地杀死肿瘤细胞。医学上用亚甲基蓝光敏法产生的单线态氧来对血浆消毒和肿瘤的光动力学诊断，这种光动力学治疗技术在肿瘤的诊断和治疗中具有广泛的应用前景。单线态氧与人类健康和疾病密切相关，是当前生命科学和化学科学交叉研究的热点。

由于单线态氧在光化学和光生物过程中具有如此重要的地位，¹O₂检测倍受关注，特别是生物体系中¹O₂的检测越来越引起科研工作者的关注。研发高灵敏度和选择性好的单线态氧的小分子荧光探针具有重要意义，它能实时地给出单线态氧靶向细胞体系内生物大分子的重要空间分布信息，能够适时准确地检测体内单线态氧的含量,对于某些疾病的预防、诊断以及病理的研究都有十分重要的指导意义[K.Tanaka,T.Miura,N.Umezawa,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,Rational>1O₂的检测[K.Andersen,Z.Cao,P.R.Ogilby,L.Poulsen,I.Zebger,J.Phys.Chem.A.2002,106,8488.]。(2)化学捕获吸光光度法，利用9,10-二苯基蒽(DPA)与¹O₂的特征性反应生成稳定的内过氧化物引起DPA吸收光谱的变化，通过检测DPA吸收光谱的变化来测量¹O₂，此法选择性好，灵敏度虽比1268nm磷光探测高得多[M.J.Steinbeck,A.U.Khan,M.J.Karnovsky,Extracellular>1O₂与带有蒽环的荧光素类探针分子专一性反应，使得探针由原来的非荧光性分子变为强荧光性分子，从而用于¹O₂的检测(N.Umezawa,K.Tanaka,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1999,38,2899；K.Tanaka,T.Miura,N.Umezawa,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.2001,123,2530.)。该方法检测时间短，灵敏度高，>1O₂(A.A.Krasnovskii,C.Schweitzer,H.Leismann,C.Tanielian,E.A.Luk’yanets,QuantumElectron.,2000,30,445；A.A.Krasnovskii,M.E.Bashtanov,N.N.Drozdova,O.A.Yuzhakova,E.A.Luk’yanets,Quantum>1O₂的测定。(5)稀土荧光探针，袁景利小组基于稀土荧光配合物的长寿命荧光特征，制备了一系列稀土荧光探针，利用时间分辨荧光检测技术测定单线态氧已取得较好的效果(袁景利，宋波，王桂兰，谭明乾，一种基于铕配合物的单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510130851.9；袁景利，宋波，王桂兰，一种单线态氧铕配合物荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号：200510045768.1；袁景利，宋波，王桂兰，一种铽配合物单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510045767.7)，这类配合物的激发波长处于紫外区，测定¹O₂时，对生物体系有损伤(B.Song.G.L.Wang.M.Q.Tan.J.L.Yuan.New>

发明内容

本发明的目的是开发可见光激发，灵敏度高的新型¹O₂荧光探针。

本发明的技术方案如下：

一种含有蒽环衍生物配体的钌双核配合物，其结构式为[Ru(L²)₂(H₂L¹)Ru(L²)₂]X_k，其中X为抗衡阴离子，X为负一价离子时，k＝4；X为负二价离子时，k＝2。L＝bpy或phen等氮杂双齿配体；bpy、phen和H₂L¹其结构式分别如下式所示：

上述抗衡阴离子多为负一价的离子，例如Cl^-、ClO₄^-、PF₆^-、NO₃^-、CF₃SO₃^-、BF₄^-。

本发明的配合物的具体例子例如：

配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄的结构如下式所示：

上述配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄可通过下述方法制备得到的：

先由文献方法合成的9,10-蒽二醛(Ryu,D.；Park,E.；Kim,D.S.；Yan,S.H.；Lee,J.Y.；Chang,B.Y.；Ahn,K.H.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,2394；Kim,H.S.；Moon,H.S.；Jang,D.O.,Superamol.Chem.,2006,18,97；Klanderman,B.H.,J.Org.Chem.,1966,31,2618.)和1,10-邻菲啰啉-5,6-二酮在乙酸铵/乙酸存在下缩合合成关键配体H₂L¹；然后H₂L¹与Ru(bpy)₂Cl₂2H₂O在乙二醇中反应后，经Al₂O₃柱色谱提纯。

本发明的以过渡金属钌或铱为中心离子，以蒽环衍生物为配体的配合物具有单线态氧荧光探针的性能，适用于中性和碱性体系中¹O₂的定性和/或定量测定。

该配合物的单线态氧荧光探针的应用过程为：在中性或碱性溶液中，利用所述的配合物作为荧光探针捕获体系中的¹O₂并与单线态氧作用生成所述配合物的内过氧化物，体系的荧光强度显著增强，通过可见光激发的荧光测定法可以检测体系中的¹O₂。具体步骤是：

1.在已知的能有效的产生单线态氧的中性或碱性体系中加入本发明的配合物，在一系列的单线态氧浓度条件下，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，得到相对应的荧光量子效率，获得荧光量子效率相对于单线态氧浓度的标准曲线；

2.在含所述配合物的中性或碱性缓冲溶液中加入一定量的待测溶液，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，计算得到其荧光量子效率；

3.以步骤2测得的荧光强度的对数值为纵坐标，以单线态氧的对数浓度做横坐标作图，线性部分即为测定单线态氧浓度的标准曲线。

本发明公开的单线态氧磷光探针可见光激发，且与单线态氧反应后生成其内过氧化物荧光强度增强幅度大的单线态氧荧光探针。本发明的探针具有如下优点：

1.适用于中性和碱性体系中¹O₂的测定。

2.具有较高的单线态氧检测灵敏度，最低检测为3.12-2.7nM。

3.具有较好的选择性，其它活性氧物种(H₂O₂,·OH，ONOO^-)引起体系荧光信号增强的幅度很小。

附图说明

图1示意了在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄(5μM)吸收光谱的影响，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中的吸收光谱的变化；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的吸收光谱的变化。图1(a)和(b)的插图分别示意了在中性和碱性体系中的配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄(5μM)的荧光强度与体系中单线态氧浓度之间的关系。

图2示意了在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄(5μM)发光光谱的影响，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中的荧光光谱的变化；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的荧光光谱的变化。图2(a)和(b)的插图分别示意了在中性和碱性体系中的配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄(5μM)的荧光强度与体系中单线态氧浓度之间的关系。

图3示意了在中性和碱性体系中的配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄(5μM)的荧光量子效率与单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。

图4示意了中性和碱性体系中配合物[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄(1.67μM)与活性氧物种([ROS]＝0.53μM)的作用，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步说明。

实施例一、配体H₂L¹的合成：

78mg(0.33mmol)9，10-蒽二醛和140mg(0.66mmol)1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮和500mg(0.33mmol)醋酸铵溶于20ml醋酸中，N₂保护下回流6h。反应后将溶液加入冰水中，放置一夜，出现大量黄色沉淀。抽滤，干燥。甲醇洗，干燥。所得粗产品溶解度非常差，不易提纯。

实施例二、[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄的合成：

H₂L¹(0.0307g,0.05mmol)、Ru(bpy)₂Cl₂·2H₂O(0.0520g,0.1mmol)于10ml乙二醇中，氮气保护下140℃搅拌反应12小时，反应溶液由最初的紫色变成深红色，冷却。将乙二醇旋出，产物用固体CH₂Cl₂/CH₃OH(体积比20/1)溶解，用中性Al₂O₃(200-300目)柱层析分离,洗提剂为体积比20～50/1CH₂Cl₂/CH₃OH，收集主要的红色带，旋蒸除去溶剂。将所得固体用乙腈/乙醚扩散重结晶，得红色固体0.045g，产率56.9％。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/z＝360.9([M－4Cl>－]⁺)，M＝C₈₀H₅₄N₁₆Cl₄Ru₂，计算值：360.0([M－4Cl^－]⁺)。氢核磁共振谱(δ_H，ppm，>6)：9.20(d，J＝7.36Hz，2H)，9.03(d，J＝6.88Hz，2H)，8.91(d，J₁＝8.34Hz，J₂＝11.98Hz，8H)，8.25(t，J＝7.96Hz，4H)，8.16(m，8H)，7.97(s，8H)，7.91(d，J＝5.40Hz，4H)，7.72(d，J＝5.48Hz，4H)，7.64(m，8H)，7.43(s，4H)。红外光谱(KBr，cm^-1)：3422br,1596w,1461w,1443w,1384s,1353s,767m，726w。元素分析[C₈₀H₅₄N₁₆Cl₄Ru₂·4CH₃CN·18.5H₂O(F.W.＝2079.46)]计算值：C，50.79；H，4.99；N，13.46％；实测值：C，50.39；H，4.23；N，14.05％。

实施例三 单线态氧传感性质和测定

以[Ru(bpy)₂(H₂L¹)Ru(bpy)₂]Cl₄为例，介绍本发明配合物作为荧光探针在中性和碱性溶液中检测单线态氧的方法和检测性能。

中性体系中¹O₂的测定：首先在含有10mM>2O₂，H₂O₂/NaOCl体系在中性溶液中单线态氧产率几乎是100％(A.M.Held,D.J.Halko,J.K.Hurst,J.Am.Chem.Soc.1978,100,5732–5740.)。随着H₂O₂的加入，体系中不断产生¹O₂，所产生的¹O₂与配合物作用，配合物中的蒽环在350nm-400nm之间的吸收不断降低，证明蒽环是与¹O₂反应的活性基团，同时体系荧光强度逐渐增强。

碱性体系中¹O₂的测定：在含有10mM>2MoO₄的pH＝9-11的碳酸盐缓冲溶液中加入配合物，然后在体系中加入H₂O₂，H₂O₂/Na₂MoO₄体系在碱性溶液中能有效的产生单线态氧(K.Tanaka,T.Miura,N.Umezawa,Y.Urano,K.Kikuchi,T.Higuchi,T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.,2001,123,2530-2536；M.Q.Tan,B.Song,G.L.Wang,J.L.Yuan,FreeRadic.Biol.Med.,2006,40,1644–1653.)。随着H₂O₂的加入，体系不断产生¹O₂，所产生的¹O₂与配合物作用，配合物中的蒽环在350nm-400nm之间的吸收不断降低，证明蒽环是与¹O₂反应的活性基团，同时体系荧光强度逐渐增强。

配合物在中性和碱性溶液中对单线态氧均有较好的检测性能，参见图1～图2，中性条件下的单线态氧是由H₂O₂/NaClO体系在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液产生的；碱性环境中单线态氧可由H₂O₂/Na₂MoO₄体系在pH＝9.95的0.1M的碳酸盐缓冲溶液产生。测定用仪器为GBC>2O₂体系即会产>1O₂，随着¹O₂与配合物的作用，蒽环部分在350nm-400nm之间的吸收不断降低，如图1所示，证明蒽环是与¹O₂反应的活性基团。在未加入H₂O₂时体系几乎没有荧光发射，随着¹O₂浓度的增加，在464nm光激发下体系在610nm处的荧光发射逐渐增强，如图2所示(图2中箭头所指方向为¹O₂浓度增加的方向)，中性和碱性的溶液中有单线态氧和无单线态氧存在时荧光强度比分别达5.4和7.6，量子效率增加分别达到7.6和8.8。体系的荧光增强是由于配合物与¹O₂作用生成其内过氧化物从而影响荧光体的发射性质，改变了其发光性能从而发出较强的荧光。在464nm光激发下体系的在610nm处荧光发射强度与¹O₂浓度之间的关系如图3所示，中性与碱性缓冲液中的发光强度的对数值对单线态氧浓度对数值作图结果分别示于插图中，模拟插图中的线性部分分别得方程：lgI＝3.56+0.328lg[¹O₂](n＝15,r＝0.986)and>1O₂](n＝15,r＝0.993)。将插图中的直线部分作为标准曲线，可以以配合物为探针在中性和碱性条件下测定任一未知体系中的单线态氧浓度。

配合物与活性氧物种的作用实验中，配合物与H₂O₂,·OH，ONOO^-等活性氧物种作用时体系荧光强度变化很小，而配合物与¹O₂作用后体系的荧光大大增强，如图4所示，这表明配合物对¹O₂具有很好的选择性。在中性和碱性条件下对¹O₂的检测最低浓度根据背景标准偏差的三倍计算分别为7.6nM和5.2nM，表明该配合物对¹O₂具有很高的灵敏度。