一种适用于中草药千里香种苗的组织培养方法

摘要

本发明公开了一种适用于中草药千里香种苗的组织培养方法，主要为将千里香的种子或顶芽或腋芽在萌发培养基上培养长出萌发小苗，接种在丛生芽诱导培养基上繁殖并经扩培继代培养，长出丛生芽和不定芽后得到无根苗，然后将无根苗进行不定根诱导培养，经炼苗后再移栽培植即可。本发明的培养基分别为萌发培养基在MS上加6‑BA和NAA或GA；丛生芽诱导培养基在MS上加6‑BA和NAA和TDZ，不定根诱导培养基在MS上加6‑BA、NAA和IBAK。本发明中草药千里香不定芽叶片肥厚，茎干粗大，具有变异率低，增殖系数高的优点，炼苗成活率达到90％以上，适用于提供中草药千里香的种苗，成本低，污染小，四季可生产，适合大规模育苗。

说明书

技术领域

本发明属于植物繁殖技术领域，尤其涉及一种适用于中草药千里香种苗的组织培养方法。

背景技术

千里香(Murraya paniculata(L.)Jack.，)又名：万里香、九秋香、九树香，为芸香科九里香属植物的小乔木，其根、干燥叶及带叶嫩枝用作草药，千里香药材使用广泛，是2010年版《中国药典》收载的九里香品种之一，主要分布于广西、云南、贵州等地。具有行气活血，散瘀止痛，解毒消肿的功效，主治胃脘疼痛、风湿痹痛、跌打肿痛、疮痈、蛇虫咬伤；亦用于麻醉止痛。千里香中主要含香豆精、黄酮、挥发油等成分，经研究发现其黄酮类成分含量较高。我国于20世纪60年代初开始利用中草药千里香资源研发治疗各种疼痛的药物。

目前国内市场上千里香药材原料90％以上来自广西，它是“三九胃泰颗粒”和国内妇科名牌产品“肤阴洁复方黄松洗液、湿巾”等多种中成药的主要原料药材。因为千里香雄蕊退化严重，产生种子量极少，种子繁殖率极低。野生资源年产量远不能满足市场需求，也面临着野生资源濒于枯竭的境况。因此，采用人工繁殖育苗的方法对保护野生千里香资源和满足规模化生产的需要显得十分必要。千里香树浑身是宝，除了千里香的根茎叶药用价值外，其树型优美还可以作为园艺树种，千里香还是大石山区石漠化治理和林业生产的经济价值极高的树种。然而，千里香育苗是抑制中草药千里香产业的瓶颈，因千里香属扦插极难生根树种之一，普通扦插不能生根和种子萌发率低等问题限制了其应用推广。

目前，中草药千里香的种植栽培主要是采用种子实生苗进行育苗，由于结实极少，种子萌发率低，生长周期长，占地面积大，难以实现高效快速的大规模工业化种植栽培。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种适用于中草药千里香种苗的组织培养方法，本培养方法包括丛生芽诱导培养和不定根诱导培养，并经过数轮继代培养后，芽生长正常，炼苗成活率达到90％以上，可以显著提高千里香的种苗存活率；并可以解决现有中草药千里香种子实生苗不能高效快速的大规模工业化种植栽培的问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种适用于中草药千里香种苗的组织培养方法，包括胚、芽预处理、丛生芽诱导培养、不定根诱导培养以及移栽培植；所述组织培养方法的具体步骤为：

(1)预处理：将千里香的种子、顶芽或腋芽，经过无菌处理后接种在盛放有萌发培养基的试管或培养瓶中进行萌发培养，每试管或培养瓶中接种一颗种子或顶芽或腋芽，然后置于培养室中；

(2)丛生芽诱导培养：将萌发培养基中培养得到的萌发小苗转入盛放有丛生芽诱导培养基中进行培养，5-6周后进行扩培继代培养，得到无根苗；

(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，培养5-7周；

(4)移栽培植：将不定根诱导培养得到的根长为0.4-1.5cm的种苗经炼苗后移栽至泥炭+细沙或珍珠岩混合基质中，在温度16-25℃，湿度60-70％，自然光照的条件下培养3-5周，待植株发育3-5张功能叶后，将其植入室外大田种植即可。

较佳地，在步骤(1)，所述无菌处理为：用软毛刷醮加入了少量洗洁精的水液轻擦枝条及其腋芽处，用自来水冲洗1-1.5h，在超净工作台中，用体积分数浓度为65-75％的酒精灭菌20-40s，再用无菌水冲洗3-4次，质量分数浓度为0.1-0.2％的升汞灭菌8-10min，无菌水冲洗3-5次。

较佳地，在步骤(1)，所述萌发培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.4g/L，pH 5.8-7.0；或所述萌发培养基为MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+GA 30mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉5.4g/L，pH 5.8-7.0。

较佳地，在步骤(2)，所述丛生芽诱导培养基为：MS基础培养基+6-BA 1.0-2.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+TDZ 0.1-4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 5.8-7.0。

较佳地，在步骤(3)，所述不定根诱导培养基为：1/2MS基础培养基+6-BA 1.0-2.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+IBAK 0.1-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH5.8-7.0。

较佳地，所述萌发培养的条件为温度23-27℃，光照时间12-14h/d，光照强度1500-20001ux；丛生芽诱导培养的条件为温度23-27℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-20001ux；不定根诱导培养条件为温度23-27℃，光照时间10-12h/d，光照强度2000-25001ux。

较佳地，在步骤(2)，萌发小苗的苗高为1.0-3.0cm，将其剪成5-10mm长度的带叶茎段后，再转入丛生芽诱导培养基中进行诱导培养。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明以中草药千里香的种子或顶芽或腋芽为外植体，经过培养基的筛选，制成了诱导的专用培养基，成功地建立了中草药千里香组织培养育苗的全套体系，为中草药千里香大量组织培养快速繁殖提供了一条可靠的技术和方法。本发明的积极效果是采用组织培养方法，繁殖系数达6-7倍，在短期内能提供大量的优质种苗，加快了千里香推广应用的速度。经过诱导增殖，大多数千里香不定芽叶片肥厚，茎干粗大，经过数轮继代培养后，芽生长正常。与同类方法相比具有很大优势，如扦插育苗虽然比较容易操作，但是枝条扦插繁殖生根困难，成活率低；种子育苗方法中由于千里香种子较小，种皮坚硬，常规田间发芽率不足4％，造成种子的大量浪费和造林中千里香种苗的缺乏。所以本发明具有很强的实用意义，采用组织培养法繁育种苗，实现叶丰栽培管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模千中草药里香育种提供了快速有效途径。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

本发明中：6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为α-萘乙酸，IBAK为吲哚丁酸钾盐，GA为赤霉素，TDZ为N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲。

实施例1

(1)预处理：取采来的健康饱满的中草药千里香顶芽或腋芽材料，用软毛刷醮加入了少量洗洁精的水液轻擦枝条及其腋芽处，自来水冲洗1h，在超净工作台中，体积分数浓度为70％酒精灭菌20s，无菌水冲洗4次，质量分数浓度为0.1％的升汞灭菌8min，无菌水冲洗5次；经表面灭菌处理好的材料接种在盛放有萌发培养基的试管中进行萌发培养，每试管中接种一颗顶芽或腋芽，然后置于培养室中，萌发培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.4g/L，pH 5.8；在温度25℃，光照时间12h/d，光照强度15001ux条件下培养5周，期间清除污染材料；

(2)丛生芽诱导培养：取苗高1.0cm的萌发小苗，剪成5mm长度的带腋芽的茎段，转入丛生芽诱导培养基上进行诱导培养，丛生芽诱导培养基为：MS基础培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 5.8；培养条件为温度25℃，光照时间14h/d，光照强度20001ux；5周后进行扩培继代培养，得到无根苗；

(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，不定根诱导培养基为：1/2MS基础培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+IBAK 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 5.8；在温度25℃，光照时间10h/d，光照强度20001ux，培养6周；

(4)移栽培植：将诱导出的根长为1.0cm的种苗经炼苗后移栽到泥炭+细沙混合基质中，在温度16℃，湿度70％，自然光照的条件下培养4周，植株成活率可达95％；待植株发育3张功能叶后，将其植入室外大田上种植即可。

实施例2

(1)预处理：取采来的健康饱满的千里香种子材料，去掉外种皮，在超净工作台上，用体积分数浓度为65％的酒精灭菌40s，无菌水冲洗3次，质量分数浓度为0.2％升汞灭菌10min，无菌水冲洗3次；经表面灭菌处理好的材料接种在盛放有萌发培养基的培养瓶中进行萌发培养，每培养瓶中接种一颗种子，然后置于培养室中，萌发培养基为：种子萌发培养基MS+6-BA 2.0mg/L+GA30mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉5.4g/L，pH 7.0的萌发培养基上，置于培养室中进行暗培养，培养5周，以长出幼叶为萌发标准统计萌芽率；

(2)丛生芽诱导培养：取苗高9.0cm的萌发小苗，剪成10mm长度的带腋芽和叶的茎段，转入丛生芽诱导培养基进行诱导培养，丛生芽诱导培养基为：MS基础培养基+6-BA2.5mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 7.0；培养条件为温度27℃，光照时间16h/d，光照强度15001ux，6周后进行扩培继代培养，得到无根苗；

(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，不定根诱导培养基为：1/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.1mg/L+IBAK0.2mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 7.0；在温度27℃，光照时间12h/d，光照强度25001ux，培养7周；

(4)移栽培植：将诱导出的根长为0.4cm的种苗经炼苗后移栽到泥炭+细沙混合培养基质中，在温度25℃，湿度75％，自然光照的条件下培养5周，植株成活率可达92％；待植株发育5张功能叶后，将其植入室外大田上种植即可。

实施例3

(1)预处理：取采来的健康饱满的中草药千里香顶芽或腋芽材料，用软毛刷醮加入了少量洗洁精的水液轻擦枝条及其腋芽处，自来水冲洗1.5h，在超净工作台中，体积分数浓度为75％的酒精灭菌30s，无菌水冲洗4次，质量分数浓度为0.2％的升汞灭菌8min，无菌水冲洗5次；经表面灭菌处理好的材料接种在盛放有萌发培养基的试管中进行萌发培养，每试管中接种一颗顶芽或腋芽，然后置于培养室中，萌发培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5.4g/L，pH 5.8；在温度27℃，光照时间16h/d，光照强度20001ux条件下培养5周，期间清除污染材料；

(2)丛生芽诱导培养：取苗高3.0cm的萌发小苗，剪成10mm长度的带腋芽的茎段，转入丛生芽诱导培养基上进行诱导培养，丛生芽诱导培养基为：MS基础培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 7.0；培养条件为温度27℃，光照时间16h/d，光照强度15001ux；5周后进行扩培继代培养，得到无根苗；

(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，不定根诱导培养基为：1/2MS基础培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+IBAK 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L，pH 5.8；在温度25℃，光照时间10h/d，光照强度20001ux，培养6周；

(4)移栽培植：将诱导出的根长为1.5cm的种苗经炼苗后移栽到泥炭+珍珠岩混合基质中，在温度25℃，湿度60％，自然光照的条件下培养5周，植株成活率可达95％；待植株发育5张功能叶后，将其植入室外大田上种植即可。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。