一种猕猴桃根部内生放线菌的分离及其应用

摘要

本发明公开了一种猕猴桃根部内生放线菌菌及其应用，猕猴桃根部内生放线菌为球孢链霉菌，命名为球孢链霉菌SCAU‑1，保藏编号为CCTCC NO：M 2016577。本发明从患溃疡病猕猴桃植株根部中分离出的功能内生放线菌菌，不仅促进植物生长也可以明显抑制植物病原真菌和病原细菌的生长的能力，可用于“肥药兼效型”微生物肥料的制作，促进猕猴桃的生长；连续三次盆栽实验显示SCAU‑1发酵液经清水稀释后，采用灌根方式对猕猴桃苗表现出明显的促生作用，能够明显提高猕猴桃苗期的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种猕猴桃内生放线菌的分离及其应用。

背景技术

猕猴桃营养非富，汁多味美，被人们誉为“水果之王”，是理想的绿色食品，近年来需求日益增加。但是因为果农一味追求高产，采用不科学的栽培管理方式，如氮磷肥的重施、钾肥的轻施，有机肥的缺施等导致猕猴桃易患溃疡病、叶片黄化病等病害，致使猕猴桃优果率下降、土壤肥力急速削减，严重影响猕猴桃产量及品质。

微生物肥料能够有效的改良土壤肥力，提高化肥的利用率同时提高能源利用率。实践证明，微生物肥料在绿色有机食品生产、农业生态环境保护以及高产、优质、高效农业的持续发展中发挥着重要的作用。微生物肥料的功能核心是有益微生物，施入土壤后，能固定空气中的氮素，活化土壤中的养分，改善植物的营养环境，微生物在生命活动过程中产生活性物质，刺激植物的生长。但是当前的微生物肥料普遍存在功能单一、菌株活性退化的问题，因此，挖掘新的功能微生物对于多功能微生物肥料的研发具有重要意义。

内生菌是一类生活在活体植物组织内、不会引起植物明显病害的微生物，能作为外源基因的载体，具有促进植物生长、抗逆境、抗病害、增加宿主植物的他感作用以及对病虫害的防治等作用。猕猴桃根部内生菌丰富，而患病植株会诱导自身根部的微生物群落发生响应变化，以患溃疡病的猕猴桃植株根部为分离材料，可以提高具有潜在抗病促生的功能微生物的分离效率。以患溃疡病的猕猴桃植株根部为分离源，进行内生放线菌的分离筛选对于挖掘新的具有抗病促生复合功能的微生物菌种资源并应用于新型复合微生物菌剂的开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猕猴桃内生放线菌及其应用，通过综合评价筛选猕猴桃内部放线菌的功能特性，旨在解决当前微生物肥料生产菌种单一、菌株优良性状退化、猕猴桃专用微生物菌剂环境适应性弱等问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种猕猴桃根部内生放线菌，所述猕猴桃根部内生放线菌为球孢链霉菌，命名为球孢链霉菌SCAU-1(Streptomycesglobisporus SCAU-1)，已于2016年10月18日保藏至武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为：CCTCC NO：M 2016577。该菌具有较广泛的抗菌作用，同时能促进植物生长，兼具“肥药”双效功能，使用该菌制成的微生物肥料对于在农业种植业中减少化学肥料和农药施用具有重要意义。

本发明的另一目的在于一种猕猴桃根部内生放线菌的分离方法，采集患溃疡病的猕猴桃根部样品，用0.1％Tween 20清洗30s，无菌水冲洗3次，75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3次，有效氯含量2％次氯酸钠溶液浸泡3-5min，无菌水冲洗3次；10％NaHCO₃浸泡10min，无菌水清洗3次，然后研磨成匀浆后接于TSA培养基平板中，在28℃导致培养30d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化，通过分离获得32株菌落形态各不相同的菌株。

进一步的，该菌株的生物学特征如下：该菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、丁香假单胞菌、玉米纹枯病菌、西瓜枯黄病菌和番茄早疫病菌具有抑制作用，IAA产量大于40mg/L，可产生纤维素酶。

本发明的另一目的在于一种利用权利要求1所述猕猴桃内生放线菌制备的发酵液。

进一步的，包括：将筛选得到的球孢链霉菌SCAU-1活化后接种于高氏一号培养液中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养96h后，作为种子液以1:1比例加入高氏一号培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养96h使其活菌数达到10亿以上，取出备用。

本发明的另一目的在于一种利用猕猴桃内生放线菌制备的球孢链霉菌SCAU-1菌液体菌剂。

本发明的另一目的在于一种猕猴桃内生放线菌发酵液在猕猴桃种植中的应用。

进一步的，将按50-200比例稀释SCAU-1菌株发酵液，在猕猴桃移栽时，将SCAU-1进行猕猴桃灌根处理，活菌含量约为2×107cfu/ml。

本发明发酵液在猕猴桃盆栽中的应用，将按50-200比例稀释的SCAU-1菌株的发酵液采用灌根的方式进行猕猴桃苗的接菌处理。

本发明的有益技术效果是：本发明提供的猕猴桃内生放线菌及其应用，从猕猴桃中分离出特异内生放线菌，不仅可以促进植物的生长，还可以抑制植物病原真菌和细菌的生长，且具备高效纤维素降解能力，可用于抗病促生型多功能微生物肥料的制作，改善土壤理化性质，促进植物生长；连续三次盆栽实验显示SCAU-1发酵液经清水稀释后，采用灌根的方式对猕猴桃表现出明显的促生作用，能够明显提高猕猴桃苗期的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积。本发明的球孢链霉菌SCAU-1，具有较广泛的抗菌作用，同时能促进植物生长，具有“肥药”兼效功能，使用该菌制成的发酵菌剂对于在农业种植业中减少化学肥料和农药施用具有重要意义；菌株具有广泛的抗菌活性，高效纤维素降解能力，同时产生IAA，对植物具有明显的促进生长作用，表现出多重生物学功能。该菌制作的生物肥料能够促进猕猴桃等植物的生长，同时促进猕猴桃品质。对于在猕猴桃栽培中开展“减肥减药”具有潜在应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的猕猴桃内生放线菌的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的猕猴桃盆栽实验前后对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例的猕猴桃内生放线菌，经形态、生理、分子鉴定为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)，命名为球孢链霉菌SCAU-1(Shreptamyccs glablsporusSCAU-1)，已于2016年10月18日保藏至武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为：CCTCC NO：M 2016577。

如图1所示，本发明实施例的猕猴桃内生放线菌的制备方法包括以下步骤：

S101：猕猴桃选择，采自四川传统猕猴桃主产区-都江堰，植物体患溃疡病；

S102：猕猴桃根部内生放线菌的分离，以患溃疡病猕猴桃根部为分离材料，将根剪短成1cm左右，利用75％酒精以及2％次氯酸钠表面消毒。研磨成匀浆后涂布于高氏一号培养基平板中，以最后一次洗涤水作对照，以检测表面消毒是否彻底；

S103：在28℃导致培养30d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化。通过分离，共获得32株菌落形态各不相同的菌株。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

(一)球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)SCAU-1菌株筛选

1、猕猴桃选择

采自四川传统猕猴桃种植基地-都江堰，猕猴桃患溃疡病；

2、猕猴桃内生放线菌的分离

采用患溃疡病猕猴桃根部样品，用0.1％Tween 20清洗30s，无菌水冲洗3次，75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3次，有效氯含量2％次氯酸钠溶液浸泡3-5min，无菌水冲洗3次；10％NaHCO₃浸泡10min，无菌水清洗3次。然后研磨成匀浆后接于TSA培养基平板中，以最后一次洗涤水作对照，以检测表面消毒是否彻底；在28℃导致培养30d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化。通过分离，共获得32株菌落形态各不相同的菌株。

3、内生放线菌产吲哚乙酸(IAA)测定

将步骤2中的32株内生放线菌培养到对数期，取菌液50μl于含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中(约3ml)中，重复3次，28℃140r/min振荡培养1.5天，取50μl于洗净的白瓷板中，加100μl显色剂，25℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基为对照。

将产吲哚乙酸的内生放线菌继续在含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中培养24-48h后，8000r/min离心5min，取上清液2ml加入4ml Salkowski显色剂，25℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)。

32株菌中有19株产生IAA，产量大于40mg/L的菌株有3株，其中SCAU-1菌株IAA产量最高，为43.3mg/L。

4、产纤维素酶测定

将步骤2中的菌株点种于羧甲基纤维素钠培养基平板上，30℃培养2d，用1mg/mL的刚果红溶液侵染1h，再用1mol/L的NaCl溶液脱色1h，倒入1mol/L的HCl使背景呈蓝色而使透明圈更加明显，记录透明圈直径HD值与菌落直径CD值并计算其比值。32株菌中有3株具纤维素酶活，SCAU-1的HD/CD值约1.45。

6、菌株抑菌能力测定

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、丁香假单胞菌、玉米纹枯病菌、西瓜枯黄病菌和番茄早疫病菌为供试病原菌，通过平板拮抗测定分离菌株对病原菌的抑制作用。记录HD值与CD值并计算其比值。32株供试内生放线菌中有6株对上述6种病原菌均表现出抑制效果，其中SCAU-1对西瓜枯黄病菌和大肠杆菌的HD/CD值分别为2.4和3.2，对金黄色葡萄球菌、丁香假单胞菌、玉米纹枯病菌、和番茄早疫病菌的HD/CD值介于约1.2-2.1。

7、SCAU-1发酵液的准备

将上述步骤中筛选得到的球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)SCAU-1活化后接种于高氏一号培养液中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养36h后，作为种子液以1:1比例加入高氏二号培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养36h使其活菌数达到10亿以上，取出备用。

8、猕猴桃盆栽应用

供试猕猴桃品种为红阳，将按一定比例稀释的SCAU-1菌株的发酵液采用灌根的方式进行猕猴桃苗的接菌处理，以无菌水作对照，培养60后测定猕猴桃苗相关指标。

表1猕猴桃苗在各处理中的形态指标

从表1可以看出，不同浓度SCAU-1菌株的发酵液稀释物对猕猴桃苗的根数、根长、株高、叶片数和叶绿素含量均表现出促进作用，具有潜在应用价值。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。