一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂及其应用

摘要

本发明属于微生物免疫学领域，具体公开了一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂及其应用，所述的微生物免疫增强剂为丁酸梭菌Cb‑F1610，保藏编号：CCTCC NO：M2016587。将其拌饵投喂鲫鱼一周，可快速激活干扰素诱导Mx基因的表达和鱼类先天性免疫系统，增强鲫鱼抗疱疹病毒CaHV能力，与未使用免疫增强剂Cb‑F1610菌株的鱼比较，这一免疫增强剂能使鱼的存活率提高34%，在水产养殖中将会有广阔应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物免疫学、病毒学、渔业生物技术及动物饲料与营养学等领域，一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂及其应用，更具体涉及一种丁酸梭菌Clostridiumbutyricum Cb-F1610，该菌株可用作免疫增强剂来提高水产动物抗病毒或抗其它病原微生物的免疫力。

背景技术

我国每年水产养殖因病造成的直接经济损失超过150亿元[农业部渔业渔政管理局等,2016.中国农业出版社出版，北京]。而防治水产养殖病害，长期依赖化学药物类、抗生素类等，这给食品与水生态安全带来严重隐患。作为世界水产大国，我们迫切需要研发安全、成本低、且无药残和耐药性的免疫增强剂及其使用技术，以提高水产动物的免疫力，实现我国渔业健康和可持续发展的目标。

免疫增强剂又称免疫调节剂，是能通过促进或诱导机体防御反应，提高机体免疫能力，增强机体对抗原微生物或病原体侵染的物质。现使用的鱼类免疫增强剂通常有：微生物多糖、甲壳素和壳聚糖、植物多糖等[王玉堂,2013.中国水产]。在人类和高等脊椎动物肠道内定殖的丁酸梭菌Clostridium butyricum因其产生丁酸、乙酸、乳酸、胞外酶，还能合成维生素类化合物等[Hayashi et al,2013.Cell Host Microbe]，对人类和高等脊椎动物具有保健、助消化等代谢生物功能，也有提高人类抗菌力的作用[et al,2014,JEnviron Sci Health B]，因而被认为是益生菌(Probiotics)[Hayashi et al,2013.CellHost Microbe]。在一定程度，丁酸梭菌还可替代畜禽抗生素使用[Zhang et al.2016.JAnim Sci Biotechnol]。另也有益生菌，如乳酸杆菌L.rhamnosus被认为有益水产动物的抗菌作用[Nayak,2010.Fish Shellfish Imm；Panigrahi et al.2005.Aquaculture]。

鲫急性鳃出血病是由疱疹病毒(Carassius auratus herpesvirus,CaHV)引起的鱼类病毒病[Zeng et al,2016.Arch Virol]，发病快、传染性强、死亡率高[方进等，2016.中国水产科学]。在有的养殖区，CaHV导致鱼的致死率最高可达100％[陈昌福等，2015.当代水产]。现查明有不同种类的鱼疱疹病毒，如鲤疱疹病毒1型，2型和3型(CyHV1,CyHV2和CyHV3，Cyprinid herpesviruses,CyHVs)[Davison et al,2013.J Virol；张奇亚&桂建芳，2014.中国科学:生命科学]。世界动物卫生组织(OIE)已将鱼类疱疹病毒列为重点水生动物疫病名录，我国也已将其列入二类疫病名录[农业部渔业渔政管理局，2015.中国农业出 版社,北京]。最近有报道指出，引起鲫急性鳃出血症的鲫疱疹病毒CaHV与CyHVs基因组之间虽有保守基因和同源序列，但不同的鱼类疱疹病毒在基因组大小、基因组结构等方面却有较大差异[Zeng et al,2016.Arch Virol]。

虽然，在人类疱疹病毒疫苗研发方面已下大力气，但在对有重大公共卫生影响的人类疱疹病毒疫苗历时八年的临床试验宣布失败之后[Cohen.2010.Science]，人们意识到用疫苗来防控疱疹病毒会有很大局限性，就试图寻找或利用其他途径来对抗疱疹病毒的侵染。近期有报道指出：人类机体代谢与疱疹病毒感染进程密切相关[苏晨鹤等，2016.生命科学]。鱼类对疱疹病毒感染的免疫应答有粘膜免疫、先天性免疫和获得性免疫等不同方式[Adamek et al,2014.DCI；Gui，2015.Sci China Life Sci]，这预示通过生物技术研发益生菌，并利用其调节和增强鱼体免疫功能、产生有效的抗病毒作用将成为可能，也非常必要。

利用益生菌来调节机体代谢，以增强水产动物抗病毒的免疫能力是一新的框架思路。丁酸梭菌是一类能形成内生芽孢的严格厌氧菌，具有耐温、耐酸、稳定性好的特性。其主要代谢产物不仅有丁酸、乙酸和乳酸，能产生多种胞外酶，还能合成维生素类化合物等[Hayashi et al,2013.Cell Host Microbe]，无毒、副作用，由于水产领域的特殊性，直至申请日前，尚未见丁酸梭菌直接用于鱼类或水产动物抗病毒免疫的专利和报道。

申请人提供了一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂，测试证实：经安全方式将Cb-F1610菌株递送到鱼体内，的确能快速激活和强力提升鱼体的先天性免疫水平，从而产生抗疱疹病毒CaHV的显著效果。同时显示，Cb-F1610菌株及相关技术作为不同水产动物免疫增强剂具有很大的开发和运用潜能。

本申请是经分离鉴定的纯培养物；且测定出使用后鱼的免疫器官脾组织中先天性免疫基因Mx快速上升，同时显著抑制病毒基因的表达---这是通过深入研究鱼的免疫基因增强表达，同时病毒基因抑制表达两个不同方面，精准揭示出Cb-F1610菌株增强鱼抗病毒免疫力的分子机理：因调节机体代谢，迅速激活先天性免疫系统，高效表达干扰素诱导Mx基因，从而产生广谱抗病原病毒及其它病原微生物的作用。这些证据充分显示该专利有更好效果和更广泛的用途。另外，我们还使用液体发酵的方式对Cb-F1610菌株进行了扩增培养(参见实施例2)，这为该菌株的扩大培养及工业规模化生产提供了有益的借鉴。

发明内容

本发明的一个目的在于提供了一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂，所述的微生物 免疫增强剂为一种丁酸梭菌，该菌株已于2016年10月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-F1610，保藏编号：CCTCC NO：M2016587，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-F1610的应用，该菌株可用于制备提高水产动物免疫力药物，或饵料添加剂。

为了达到上述目的，本发明采取如下技术措施：

一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂，该增强剂为丁酸梭菌，来源于动物源性饲料，通过，经稀释、分离、纯培养和筛选最终得到，该菌株已于2016年10月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-F1610，保藏编号：CCTCC NO：M2016587，地址：中国武汉武汉大学。

Cb-F1610菌株具有典型丁酸梭菌的生理生化特征：菌体形态呈杆状，产芽孢；菌落呈乳白色或微黄色不规则圆形，略有酸臭味：菌体革兰染色为阳性；严格厌氧，耐热，80℃加热10min不影响菌的活力；对抗菌素卡那霉素有耐药性；能利用葡萄糖；液体培养时，前期产生大量的气体，后期产生较多沉淀。

丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-F1610的应用，该菌株可用于制备提高水产动物微生物免疫增强剂。

以上所述的水产动物包括但不限于鱼、虾、鳖、蛙等水产养殖动物。

以上所述的应用，当用于鲫鱼时，投喂剂量和方式为：10⁴cfu/g_鱼体重拌饵投喂，时间≥一周。

以上所述的应用，优选该菌株用于制备鲫鱼的抗疱疹病毒病药物或饵料添加剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)获得一种能调节鱼体代谢、增强鱼类免疫系统功能的新型免疫增强剂，并为研发渔用广谱抗病毒制剂、免疫增强剂提供候选材料与实用技术。

2)利用常规培养基与优化培养条件所获得的Cb-F1610菌株培养物，质优、量高(生物量可达10⁸cfu/mL)、成本低。

3)使用免疫增强剂的方式是直接拌饵投喂，操作便捷，避免了鱼体损伤及捕捞过程对鱼产生的胁迫压力。在受到疱疹病毒攻击和感染时，用或未用免疫增强剂的鱼类，其先天性免疫基因表达水平与鱼群的存活率都有显著差异。

4)利用本发明所述的水产动物免疫增强剂，能快速提升鱼的先天性免疫水平，尤其是促进干扰素诱导的Mx基因表达，使鱼体在受到病毒(如鲫急性鳃出血病疱疹病毒，CaHV)攻击时，能迅速产生免疫应答，保护效果明显，使鱼的存活率提高34％。

5)使用后无药残，也不产生耐药性。

6)基于上述优点，这类免疫增强剂在水产养殖中将会有广阔应用前景；而本发明产生的菌株及优化培养条件等，是适用于工业规模化生产的渔用免疫增强剂和关键技术。

附图说明

图1.丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-F1610菌株的显微和超微形态。

图1中A为革兰氏染色显微图；图1中B为负染电镜图。

图2.在经疱疹病毒CaHV感染后不同天数(0d,3d,6d和9d)的鲫脾组织中，病毒基因和免疫基因的表达与分析。

图2中A：CaHV主要衣壳蛋白MCP(CaHV-MCP)基因拷贝数。图2中B：以β-actin基因为内参，非特异性免疫相关的干扰素诱导蛋白Mx基因的相对表达量。Imm：在攻毒前已饲喂免疫增强剂Cb-F1610菌株的实验组组。Con：未饲免疫增强剂Cb-F1610菌株的对照组。

图3扩增三个基因的片段大小与序列。

这三个基因分别编码：病毒主要衣壳蛋白(CaHV-MCP)，干扰素诱导蛋白(Mx)，和抗体基因(IgM)。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特备说明，则均为本领域常规方案；所述试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。本发明实施例所用的鱼为鲫鱼。

实施例1：

候选免疫增强剂丁酸梭菌Cb-F1610菌株的筛选、纯培养及其分子鉴定

1)固体培养基配制：酵母浸膏3g、胰蛋白胨10g、葡萄糖10g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸0.5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH 7±0.1，115℃，20min灭菌备用。

液体培养基为固体培养基不加琼脂。

2)培养步骤：

(1)将动物源性饲料用无菌水悬浮成菌液，置于80℃水浴10min杀死非芽孢菌，经平板划线接种到固体培养基，37℃厌氧培养48h。

(2)待长出菌落，挑单菌落，接种到含1mL液体培养基的EP管中，封石蜡膜隔绝空气，37℃厌氧培养48h。

(3)取菌样进行革兰氏染色和显微观察、负染电镜观察、PCR检测，选择检测结果均符合丁酸梭菌特征的单一菌落，挑取厌氧生长优势明显的菌落再进行分离和纯培养。

(4)获得的菌株Cb-F1610为革兰氏阳性芽孢杆菌，能形成白色或奶油色的不规则圆形菌落，菌体大小约为0.8～1.4×4～8μm，两端钝圆，呈直杆状或稍弯曲，单个或成对，周身鞭毛(图1)。

(5)据NCBI中丁酸梭菌16s rDNA序列设计引物：F:GTCGAGCGATGAAGCTCCTT；R:TCCCTTTACGCCCAGTAAATC，再进行PCR测试，从Cb-F1610菌株核酸中扩增出一条为490bp的特异片段。进一步对该扩增片段进行测序分析，并与丁酸梭菌典型株Clostridium butyricum(AB687551)、产气荚膜梭菌Clostridium perfringens(NR_112169)、肉毒梭菌Clostridiumbotulinum(X73844)、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(NR_116023)等不同菌的16SrDNA相应扩增片段的同源序列进行比对。结果显示Cb-F1610菌株与丁酸梭菌代表株Clostridium butyricum(AB687551)的同源性最高。因此，鉴定Cb-F1610菌株为丁酸梭菌。

该菌株已于2016年10月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-F1610，保藏编号：CCTCC NO：M2016587，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

丁酸梭菌Cb-F1610的液体发酵方法：

1)液体培养基配制：酵母浸膏3g、胰蛋白胨10g、葡萄糖10g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸0.5g、蒸馏水1000mL，pH 7±0.1，115℃，20min灭菌备用。

2)挑单菌落培养：将平板上的丁酸梭菌Cb-F1610用牙签沾取，接种到1mL的液体培养基中，37℃培养24h，获单菌落培养液。

3)菌株活化：取单菌落培养液0.5ml，接种到含9.5ml液体培养基的试管中,37℃培养24h，获活化Cb-F1610菌液。

4)扩大培养：取10mL活化Cb-F1610菌液，置于有190mL液体培养基锥形瓶中悬浮，pH7±0.1，37℃厌氧培养24h，获含菌量为10⁸cfu/mL的菌液。

可按此方法，将Cb-F1610菌株扩大到发酵罐培养。

实施例3：

丁酸梭菌Cb-F1610的安全性测试：

测试投喂Cb-F1610菌株对鱼群生长生活的影响：设置四个实验组和一个对照组，每组30尾，平均体重6g/尾。在四个实验组中，使用含菌量为10⁴cfu/g_鱼体重的Cb-F1610菌株拌饵投喂，时间分别为1，2，3，4周。再与未投喂Cb-F1610菌株的对照组鱼群进行比较。还将用含有10⁴cfu/g_鱼体重的Cb-F1610菌株水体浸泡鱼4周的实验组，与未浸泡菌鱼的对照组进行比较。显示不同实验组鱼群的生长、泳动、吃食等情况均表现正常。这表明使用Cb-F1610菌株作为鱼的免疫增强剂是安全的。

使用Cb-F1610菌株拌饵投喂1～4周的四个实验组鱼群中，各抽查其脾组织和头肾组织中不同先天性免疫相关基因(如干扰素诱导的Mx基因，干扰素调节因子IRF基因和干扰素诱导的另一种重要抗病毒基因蛋白激酶PKR基因)的表达水平。显示投喂1～2周，Mx基因表达达到峰值，其它基因表达差异不如Mx基因显著。

实施例4：

Cb-F1610菌株对鱼组织不同免疫基因表达水平的影响：

按实施例3的步骤1)的方法和剂量使用Cb-F1610菌株拌饵投喂一周后，用3.2×LD₅₀剂量的鲫疱疹病毒(CaHV)悬液注射攻毒。在攻毒不同时间(0d,3d,6d和9d)，分别取已投喂Cb-F1610菌株实验组(Imm)的鱼，制备脾组织DNA。对其中的病毒主要衣壳蛋白(CaHV-MCP)基因及免疫相关基因，包括先天性免疫基因(干扰素相关的Mx基因)和获得性免疫基因(抗体IgM基因)的表达水平进行测试，所设计的引物(见表1)。同时以未投喂Cb-F1610菌株的鱼为对照组(Con)，进行荧光定量PCR测试和比较。

表1.扩增检测基因的引物

荧光定量PCR测试CaHV MCP拷贝数

1)使用DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA ExtractionKit Ver.5.0，Clontech公司产品)，从攻毒后不同时间的鲫脾组织中提取DNA，制备含CaHV基因组的模板。操作步骤：取约4mg鲫脾组织置于EP管中，加入180μl裂解液(Buffer GL)，20μl蛋白酶K(Proteinase K)和10μl RNA酶(RNaseA,10mg/ml)，56℃温浴约3h。加缓冲液(Buffer GB)和100％乙醇各200μl，吸打混匀。将核酸纯化柱(Spin Column)安置于收集管(Collection Tube)上，溶液移至核酸纯化柱中，15000g离心2min，弃滤液。加500μl缓冲液A(Buffer WA)至核酸纯化柱中，15000g离心1min，弃滤液。将700μl缓冲液B(Buffer WB)加至核酸纯化柱中，15000g离心1min，弃滤液，再重复此操作一次。将核酸纯化柱安置于新收集管上，在核酸纯化柱的中央处加入40μl灭菌水或洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min，15000g离心2min洗脱DNA；将离下液重新加入到核酸纯化柱膜的中央，室温静置5分钟后，15000g离心2min洗脱，获得含CaHV基因组的鱼脾组织DNA样品。

2)将提取的DNA稀释50倍，用Eppendorf Biophotometer plus测定DNA浓度。

3)荧光定量PCR反应体系：加1.0μl经十倍稀释的上述含CaHV基因组的鱼脾组织DNA(0.01～0.1μg)，12.5μl的2×UltraSYBR Mixture Mix(With high ROX，康为世纪公司产品,其中包含高效热启动酶GoldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBRGreen I荧光染料和Mg2)，再各加0.5μl 10μM的引物CaHV-MCP-F/R，10.5μl dH2O，使反应的终体积为25μl。混匀后，离心15s使反应组分集中在管底。进行荧光定量PCR扩增，先是95℃保温10min；接着40个循环，程序为95℃变性15s，60℃复性与延伸1min；再是测融合曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s。在荧光定量PCR仪数据分析系统中，读出Ct值。数据显示，Ct值小于33,提示整个检测过程有效；且融合曲线是单峰，说明扩增产物特异性好、结果可信。

4)另外，以CaHV基因组为模版，参见表1中CaHV-MCP-F/R引物，扩增CaHV MCP基因部分片段，电泳后切胶回收DNA片段，连接到pMD18-T载体上，再转化Top10感受态细胞并培养，制备pMD18-T-MCP质粒，并测定浓度，根据质粒浓度和分子计算每微升质粒中含拷贝数(质粒浓度g/μl÷质粒分子量g/mol×阿伏伽德罗常数＝质粒拷贝数/μl)，将质粒稀释成拷贝数10¹⁰/μl，然后10倍梯度稀释。标准品质粒取拷贝数10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³/μl>

通过标准曲线算出CaHV-MCP基因的拷贝数之后，以CaHV-MCP基因拷贝数为纵坐标，以时间(d)为横坐标，绘制曲线图。结果显示CaHV-MCP基因表达，在使用过免疫增强剂的实验组(Imm)到6d才出现峰值；而未使用免疫增强剂的对照组(Con)在3d就出现峰值(图2)。这说明使用免疫增强剂Cb-F1610菌株对侵染鱼体内的病毒复制有强力抑制作用。

荧光定量PCR测试鲫先天性免疫(Mx)基因和获得性免疫(抗体IgM)基因的相对表达量：

1)制备RNA：在取有20mg鱼脾组织的EP管中加1mL Trizol(Invitrogen公司)，充分研磨，加0.2mL氯仿颠倒混匀，室温静置2min，12000g，4℃离心15min。取上层水相(约0.5mL)移至新EP管中，加0.5mL异丙醇颠倒混匀，室温下静置10min，12000g，4℃离心10min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀，7500g，4℃离心5min，弃乙醇，空气干燥10min，用40μl DEPC处理水溶解沉淀，获鲫脾组织RNA。

2)去除基因组DNA：加上述制备的鲫脾组织RNA 5μl，2μl 5×gDNA EraserBuffer,1μl gDNA Eraser，2μl RNase Free dH2O，使总体积为10μl，42℃保温2min。

3)逆转录：上述去除基因组DNA液10μl，加1μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，4μl RT Primer Mix，4μl 5×PrimeScript Buffer 2，1μl RNase Free dH2O，使总体积为20μl，分别置37℃条，15min，85℃5s，4℃10min，获得鲫脾组织的cDNA。

4)荧光定量PCR测试：加1.0μl经十倍稀释的上述鲫脾组织的cDNA，12.5μl的2×UltraSYBR Mixture Mix(With high ROX，康为世纪公司产品,其中包含高效热启动酶GoldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料和Mg2)，再分别加0.5μl 10μM的引物Mx-F/R(或IgM-F/R)，10.5μl dH2O，使反应的终体积为25μl，混匀后离心15s使反应组分集中在管底。进行荧光定量PCR扩增，先是保温阶段：95℃保温10min；接着95℃变性15s，60℃复性与延伸1min进行40个循环；再是测融合曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s；继而在荧光定量PCR仪数据分析系统中，读出Ct值。

5)经2^-ΔΔCt法进行相对表达量的计算和分析：△△Ct＝△Ct(试验样品)—△Ct(基准样品)；

△Ct(试验样品)＝Ct(试验样品，目的基因)—Ct(试验样品，内参基因)；

△Ct(基准样品)＝Ct(基准样品，目的基因)—Ct(基准样品，内参基因)；

利用上述方法分别得出使用(Imm)或未使用(Con)免疫增强剂的鱼脾组织中免疫蛋白Mx和IgM基因的相对表达量。之后，以Mx基因相对表达量为纵坐标，以时间(d)为横坐标，绘制曲线图。

结果显示Mx基因表达，在使用免疫增强剂的实验组(Imm)的3d就出现峰值；而未使用免疫增强剂的对照组(Con)直到6d才出现峰值(图2)，此时这组鱼的死亡率已超过90％。这表明使用免疫增强剂Cb-F1610菌株能快速、显著增强鱼的先天性免疫能力。另外，IgM基因表达在实验组和对照组中，都在6d才出现峰值，表明免疫增强剂Cb-F1610菌株对鱼体抗病毒的特异性免疫作用贡献不够明显。

分别用引物CaHV-MCP-F/R、Mx-F/R、IgM-F/R经PCR扩增3个不同基因的片段，测序片段长度各为225bp、349bp和209bp(图3)。

上述研究证明，免疫基因与病毒基因表达量这两者之间呈负相关。使用Cb-F1610菌株能快速激活鱼体干扰素系统及其诱导的Mx基因表达，使鱼先天性免疫力快速提升，同时抑制病毒核心基因的表达，起到显著增强鱼体抗疱疹病毒感染的作用。

实施例5：

Cb-F1610菌株在制备鲫鱼免疫增强剂中的应用：

取110尾鲫(平均体重6g/尾)，暂养于水温25±1℃的水箱中，再分为两组，每组各55尾。

1)按实施例3中的方法，使用Cb-F1610菌株投喂一周的鱼为实验组(Imm，即免疫增强剂组)，并用3.2×LD₅₀剂量的鲫疱疹病毒(CaHV)悬液注射攻毒。

2)设未投喂Cb-F1610菌株的鱼为对照组(Con)，并用3.2×LD₅₀剂量的鲫疱疹病毒(CaHV)悬液注射攻毒。

3)攻毒后逐日观察、记录并比较实验组(Imm)与对照组(Con)鱼群的存活率。结果见表2.

表2实验组(Imm)与对照组(Con)在攻毒后，不同时间(d)存活的鱼及存活率

可见结果实验组(Imm)要比对照组(Con)鱼的存活率高34％。显示免疫增强剂Cb-F1610菌株能因增强鱼体免疫能力，而使受病毒攻毒的鱼群存活率显著提高。