一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法及应用

摘要

本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，本发明涉及一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法及应用，基于吸附硫瑾的铂纳米线@SBA‑15微球复合材料构建的电化学免疫传感器，用于定量检测乙型肝炎病毒标志物，具有特异性强，灵敏度高，检测限低的优点，对乙型肝炎病毒感染的早期诊断具有重要的科学意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法，应用于乙型肝炎病毒标志物的检测。

背景技术

乙型肝炎病毒感染是全球最严重的健康问题之一，它可引发慢性肝炎、肝硬化等疾病，甚至引发位居全球癌症死亡率第二名的肝癌。血液中乙型肝炎病毒标记物的浓度是诊断乙型肝炎病毒感染的标准，乙型肝炎病毒标志物浓度的精确检测对乙型肝炎病毒感染的早期诊断具有重要意义。因此，发展高灵敏的乙型肝炎病毒标志物的定量检测方法尤为迫切。

近年来，随着临床诊断技术的飞速发展，性能优越的电化学免疫传感器脱颖而出，并被广泛应用于病毒标志物或肿瘤标志物的检测中。夹心型电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点，对痕量级病毒和肿瘤标志物的检测具有重要价值。

基底材料和催化剂材料作为电化学免疫传感器的重要组分，对提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用。近年来，纳米材料及其复合材料被广泛应用于免疫传感器的构建当中。本发明利用层层自组装技术，以电沉积金薄膜和金纳米粒子构建的双金层为基底，以吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球作为检测抗体标记物构建一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器，具有检测范围广、检测下限低、操作简单、检测速度快等优点，对乙型肝炎的早期诊断具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法及应用，实现了对乙型肝炎病毒标志物的超灵敏检测。

本发明的目的之一是提供一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法。

本发明的目的之二是将所制备的一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器用于乙型肝炎病毒标志物的检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法，步骤如下：

（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；

（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、1.0 wt% ~ 2.0wt%的氯金酸溶液中，电镀25 ~ 35 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；

（3）将上述电极浸入30 mL、1.0 mmol/L的4-氨基苯硫酚溶液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（4）继续将电极浸入50 mL、0.04 ~ 0.05 mg/mL的金纳米粒子分散液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（5）将6.0 µL、5.0 ~ 10.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，4.0>

（6）继续将3.0 µL、0.5 wt% ~ 1.0 wt%的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极，4.0>

（7）继续滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4.0>

（8）将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液滴涂于电极表面，置于4.0>

2. 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法，所述相关材料的制备，步骤如下：

（1）金纳米粒子分散液的制备

将1.0 ~ 2.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中，加热至沸腾，加入1.5 ~ 3.5 mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，继续回流10 ~ 20 min，后冷却至室温，得到金纳米粒子分散液；

（2）吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体HBs-Ab₂孵化物分散液的制备

①铂纳米线@SBA-15微球的制备

取1.0 ~ 1.5 mL、12 wt%的氯亚铂酸钾溶液置于100 mL 烧杯中，置入0.4 ~ 0.6 g的SBA-15粉末，搅拌均匀，超声15 ~ 20 min后，置于25 °C真空干燥箱内干燥24 h，继续加入2.0 ~ 3.0 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液后，置于25 °C真空干燥箱内还原1.0 h，继续加入5.0 ~ 7.0 mL、10 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌20 ~ 40 min后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24 h，得到铂纳米线@SBA-15微球；

②吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球的制备

称取40 ~ 50 mg铂纳米线@SBA-15微球浸入到10 mL、1.0 ~ 1.5 mol/mL的硫瑾溶液中，超声分散，并在振荡器中持续振荡6.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24 h，得到吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球；

③吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体HBs-Ab₂孵化物分散液的制备

取2.0 ~ 6.0 mg吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球分散到1.0 mL超纯水中，加入1.0 ~2.0 mL、20 ~ 30 μg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体Ab₂分散液，置于4.0>2孵化物分散液，在4.0>

3. 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器，用于乙型肝炎病毒标志物抗原的检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH 5.3 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）利用差分脉冲伏安法对乙型肝炎病毒标志物抗原进行检测，扫描范围为0.0 ~ 0.6V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为50 ms，记录电流峰值；

（3）记录不同浓度下的乙型肝炎病毒标志物抗原所对应的电流峰值；

（4）利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎病毒标志物抗原的浓度。

本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）本发明利用电沉积金薄膜和金纳米粒子构建的双金层能够有效增加电极表面的电子传递效率，并且，由于金纳米粒子具有良好的生物相容性，使构建的双金层能够稳定结合大量的具有活性的捕获抗体，从而增加免疫传感器的稳定性，对于提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用；

（2）本发明采用性能优良的吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球被作为检测抗体标记物用于免疫传感器的构建中。催化性能和导电性能极佳的铂纳米线镶嵌到SBA-15的内部后，有效增强了SBA-15的导电性，而SBA-15中发达的有序介孔结构能够提供大量的催化活性位点，并能有效增加反应物与铂纳米线@SBA-15微球的接触时间，通过这种协同作用和优势互补作用，增大免疫传感器的灵敏度。硫瑾的吸附使SBA-15微球的导电性进一步增大。此外，硫瑾中具有氨基官能团，使吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球具有更好的生物相容性，提高检测抗体的负载量。因此，以吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球作为检测抗体标记物有效放大电信号，提高免疫传感器的灵敏度，降低免疫传感器的检测下限；

（3）一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器对不同乙型肝炎病毒标志物的检测，其对乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的线性检测范围是0.00001 ng/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为3.3 fg/mL；对乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag的线性检测范围是0.0005 ng/mL ~50 ng/mL，最低检测下限为0.167 pg/mL；对乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag的线性检测范围是0.00003 ng/mL ~ 60 ng/mL，最低检测下限为10 fg/mL；表明一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器可以达到精确定量检测乙型肝炎病毒标志物的目的。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。

实施例1 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法

（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；

（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液中，电镀25 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；

（3）将上述电极浸入30 mL、1.0 mmol/L的4-氨基苯硫酚溶液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（4）继续将电极浸入50 mL、0.04 mg/mL的金纳米粒子分散液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（5）将6.0 µL、5.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，4.0>

（6）继续将3.0 µL、0.5 wt%的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电面，4.0>

（7）继续滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4>

（8）将6.0 µL、1.0 mg/mL的吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液滴涂于电极表面，置于4.0>

实施例2 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法

（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；

（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、1.5 wt%的氯金酸溶液中，电镀30 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；

（3）将上述电极浸入30 mL、1.0 mmol/L的4-氨基苯硫酚溶液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（4）继续将电极浸入50 mL、0.05 mg/mL的金纳米粒子分散液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（5）将6.0 µL、7.5 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，4.0>

（6）继续将3.0 µL、0.75 wt%的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极，4.0>

（7）继续滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4>

（8）将6.0 µL、2.0 mg/mL的吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液滴涂于电极表面，置于4.0>

实施例3 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法

（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；

（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、2.0 wt%的氯金酸溶液中，电镀35 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；

（3）将上述电极浸入30 mL、1.0 mmol/L的4-氨基苯硫酚溶液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（4）继续将电极浸入50 mL、0.05 mg/mL的金纳米粒子分散液，浸泡2.0 h，超纯水冲洗，室温下晾干；

（5）将6.0 µL、10.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，4.0>

（6）继续将3.0 µL、1.0 wt%的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极，4.0>

（7）继续滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4>

（8）将6.0 µL、3.0 mg/mL的吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液滴涂于电极表面，置于4.0>

实施例4 所述金纳米粒子分散液的制备

将1.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中，加热至沸腾，加入1.5 mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，继续回流10 min，后冷却至室温，得到金纳米粒子分散液。

实施例5 所述金纳米粒子分散液的制备

将1.5 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中，加热至沸腾，加入2.5 mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，继续回流15 min，后冷却至室温，得到金纳米粒子分散液。

实施例6 所述金纳米粒子分散液的制备

将2.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中，加热至沸腾，加入3.5 mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，继续回流20 min，后冷却至室温，得到金纳米粒子分散液。

实施例7 所述吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液的制备

①铂纳米线@SBA-15微球的制备

取1.0 mL、12 wt%的氯亚铂酸钾溶液置于100 mL 烧杯中，置入0.4 g的SBA-15粉末，搅拌均匀，超声15 min后，置于25 °C真空干燥箱内干燥24 h，继续加入2.0 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液后，置于25 °C真空干燥箱内还原1.0 h，继续加入5.0 mL、10 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌20 min后，离心，用超纯水洗涤，将所得到固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24h，得到铂纳米线@SBA-15微球；

②吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球的制备

称取40 mg铂纳米线@SBA-15微球浸入到10 mL、1.0 mol/mL的硫瑾溶液中，超声分散，并在振荡器中持续振荡6.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24 h，得到吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球；

③吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液的制备

取2.0 mg吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球分散到1.0 mL超纯水中，加入1.0 mL、20 μg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体Ab₂分散液，置于4.0>2孵化物分散液，在4.0>

实施例8 所述吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液的制备

①铂纳米线@SBA-15微球的制备

取1.5 mL、12 wt%的氯亚铂酸钾溶液置于100 mL 烧杯中，置入0.5 g的SBA-15粉末，搅拌均匀，超声20 min后，置于25 °C真空干燥箱内干燥24 h，继续加入2.5 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液后，置于25 °C真空干燥箱内还原1.0 h，继续加入6.0 mL、10 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌30 min后，离心，用超纯水洗涤，将所得到固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24h，得到铂纳米线@SBA-15微球；

②吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球的制备

称取45 mg铂纳米线@SBA-15微球浸入到10 mL、1.5 mol/mL的硫瑾溶液中，超声分散，并在振荡器中持续振荡6.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24 h，得到吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球；

③吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液的制备

取4.0 mg吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球分散到1.0 mL超纯水中，加入1.5 mL、25 μg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体Ab₂分散液，置于4.0>2孵化物分散液，在4.0>

实施例9 所述吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液的制备

①铂纳米线@SBA-15微球的制备

取1.5 mL、12 wt%的氯亚铂酸钾溶液置于100 mL 烧杯中，置入0.6 g的SBA-15粉末，搅拌均匀，超声20 min后，置于25 °C真空干燥箱内干燥24 h，继续加入3.0 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液后，置于25 °C真空干燥箱内还原1.0 h，继续加入7.0 mL、10 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌40 min后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24 h，得到铂纳米线@SBA-15微球；

②吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球的制备

称取50 mg铂纳米线@SBA-15微球浸入到10 mL、1.5 mol/mL的硫瑾溶液中，超声分散，并在振荡器中持续振荡6.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30 °C真空干燥箱内干燥24 h，得到吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球；

③吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球/检测抗体Ab₂孵化物分散液的制备

取6.0 mg吸附硫瑾的铂纳米线@SBA-15微球分散到1.0 mL超纯水中，加入2.0 mL、30 μg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体Ab₂分散液，置于4.0>2孵化物分散液，在4.0>

实施例10 所述夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器对乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的检测

（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH =7.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）利用差分脉冲伏安法对分析物进行检测，扫描范围为0.0 ~ 0.6 V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为50 ms，记录电流峰值；

（3）记录不同浓度下的乙型肝炎病毒标志物抗原所对应的电流峰值；

（4）利用工作曲线法，得到所述免疫传感器对乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的线性检测范围是0.00001 ng/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为3.3 fg/mL。

实施例11 所述夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器对乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag的检测

按照实施例10的方法对乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag进行检测，其线性检测范围是0.0005 ng/mL ~ 50 ng/mL，最低检测下限为0.167 pg/mL。

实施例12 所述夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器对乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag的检测

按照实施例10的方法对乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag进行检测，其线性检测范围是0.00003 ng/mL ~ 60 ng/mL，最低检测下限为10 fg/mL。