一种促进骨细胞生长的合成支架及其制备方法

摘要

本发明公开了一种促进骨细胞生长的合成支架及其制备方法。包括：首先，将壳聚糖加入乙酸中，搅拌至完全溶解制备成壳聚糖的乙酸胶体；然后将丹参酚酸B溶于乙醇并将其添加到壳聚糖的乙酸中搅拌均匀得到混合溶液，然后将Ca(NO3)

说明书

【技术领域】

本发明涉及骨支架技术领域，尤其涉及一种促进骨细胞生长的合成支架及其制备方法。

【背景技术】

目前已有用于骨损伤后促进骨细胞生长的支架，主要材料是羟磷灰石(Shuai et al.2013)。为了克服此材料的脆性，在后续的支架中加入壳聚糖，能有效提升支架的生物相容性与生物降解能力(Ma et al.2014)。

由于缺乏血管网络的生成，现有支架的促骨细胞生成作用被极大限制(Phelps et al.2010)。

丹参酚酸B提取自丹参，是目前最有效的促血管生成的物质之一(Guo et al.2014)。例以下文献记载：

Shuai C,Gao C,Feng P,Peng S and Wen X(2013)Grain growth associates mechanical properties in nano-hydroxyapatite bone scaffolds.J Nanosci Nanotechnol 13:5340-5345.

Ma XY,Feng YF,Ma ZS,Li X,Wang J,Wang L and Lei W(2014)The promotion of osteointegration under diabetic conditions using chitosan/hydroxyapatite composite coating on porous titanium surfaces.Biomaterials 35:7259-7270.

Phelps EA and Garcia AJ(2010)Engineering more than a cell:vascularization strategies in tissue engineering.Curr Opin Biotechnol 21:704-709.

Guo HD,Cui GH,Tian JX,Lu PP,Zhu QC,Lv R and Shao SJ(2014)Transplantation of salvianolic acid B pretreated mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with myocardial infarction through angiogenesis and paracrine mechanisms.Int J Cardiol 177:538-542.

然而现有技术中存在以下缺陷或不足：

由于缺乏血管网络的生成，现有支架的促骨细胞生成作用被极大限制。支架作用不明显，无血管生长或血管生长缓慢，导致细胞生长速度慢，预后一般。

【发明内容】

本发明提供一种促进骨细胞生长的合成支架及其制备方法，该支架可以在56天内稳定的持续的释放药物。增加骨支架在临床治疗中的应用效力。

为有效实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种促进骨细胞生长的合成支架，该支架是由丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石复合材料制成；支架中丹参酚酸B的含量不少于1×10^-7mol。

丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石复合材料是丹参酚酸B、壳聚糖、Ca(NO ₃)₂与KH₂PO₄制得，Ca/P的摩尔比为5:3，壳聚糖/羟磷灰石最终质量比为1：2。

该支架的密度为94.2±1.6kg/m³，孔隙率为83.3±0.8％，弹性模量为25.2±2.9kP。

一种促进骨细胞生长的合成支架的制备方法，包括以下步骤：

首先，将壳聚糖加入乙酸中，搅拌至完全溶解制备成壳聚糖的乙酸胶体；然后将丹参酚酸B溶于乙醇并将其添加到壳聚糖的乙酸中搅拌均匀得到混合溶液，然后将可溶性钙盐、磷酸盐加入混合溶液中搅拌以制备成丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石前驱体溶液；其中，Ca/P的摩尔比为5:3，壳聚糖/羟磷灰石最终质量比为1：2；

然后，前驱体溶液混匀处理后，离心以去除气泡；再将前驱体溶液注入模具中，再逐步梯度降温冷冻成固体，然后将溶液冻干8-24h；经充分干燥后，将丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石支架浸泡弱碱溶液中脱酸，并用蒸馏水冲洗数次；之后，再次将支架冻干，然后两端部截去，即得到了促进骨细胞生长的合成支架。

作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

首先，将2g的壳聚糖加入100ml体积比为2％的乙酸中，搅拌制备成壳聚糖的乙酸胶体；然后将48～72mg丹参酚酸B溶于1mL乙醇并将其添加到壳聚糖的乙酸中搅拌均匀，然后将Ca(NO₃)₂、KH₂PO₄加入混合溶液中搅拌，以制备成丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石前驱体溶液；

然后，前驱体溶液搅拌4～5h后离心除气泡；再将溶液注入塑料模具中，依次放置于4℃的环境中2h、后放置-10℃环境中3h，或5h内逐步从4℃降温到-10℃，使溶液冻成固体，然后将固体冻干8-24h；经充分干燥后，将丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石支架浸泡在质量分数为1～2％的NaOH溶液中0.5-2h，并用蒸馏水冲洗数次；之后，再次将支架冻干，然后两端各截去端部，即得到了促进骨细胞生长的合成支架。

作为本发明的进一步改进，逐步梯度降温冷冻具体为依次放置于4℃的环境中2h、后放置-10℃环境中3h，或5h内逐步从4℃降温到-10℃。

作为本发明的进一步改进，所有丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石支架均通过20kGy>60Co进行灭菌并储存在室温真空包装中。

作为本发明的进一步改进，所述的塑料模具腔的直径为4.0mm，长为20mm。

作为本发明的进一步改进，所述的壳聚糖分子量为2.5×10⁵，脱乙酰度≥90％，粘度>100cps，材料级别为生物医学级。

所述的可溶性钙盐、磷酸盐分别为Ca(NO₃)₂、KH₂PO₄。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

该支架通过采用丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石复合材料制成，由于其具有丹参酚酸B，依次该支架可显著提高MC3T3-E1细胞与血管内皮细胞的存活状况与细胞增殖，增加骨支架在临床治疗中的应用效力。实验表明加入了丹参酚酸B后，支架可以在56天内稳定的持续的释放药物。将支架切成5mm厚的小片，并将小片溶于细胞培养基，滤过沉渣之后培养成骨细胞。在培养基中，我们检测出，血管内皮生长因子分泌增多，MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性增高。相较于未加丹参酚酸B的支架，我们通过CCK8方法观察到，该支架显著提高MC3T3-E1与血管内皮细胞的存活状况与细胞增殖。同时，在扫描电子显微镜(SEM)下可观察到，细胞形态未发生异型性。

本发明支架的制备方法，通过分别制备原料不同的溶液之后混合得到前驱体，再进行模塑制成，该方法制备过程简单，后处理容易，反应重复性高，适合产品化推广。

【附图说明】

图1羟磷灰石、壳聚糖(CS/HA)为主要材料的支架与丹参酚酸B、羟磷灰石、壳聚糖(Sa B-CS/HA)为主要材料的支架的对比。

图2丹参酚酸B(a),CS/HA(b)与Sa B-CS/HA(c)的红外光谱对比。

图3丹参酚酸B从Sa B-CS/HA支架中释放的曲线。

图4细胞形态学对比。

图5 MC3T3-E1细胞增殖情况的对比。

图6血管内皮细胞增殖情况的对比。

图7碱性磷酸酶(ALP)活性的对比。

图8血管内皮生长因子(VEGF)活性的对比。

【具体实施方式】

下面结合附图及具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细阐述，但本发明不限于该实施例。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选施例中详细说明具体的细节。

本发明一种促进骨细胞生长的合成支架的制备方法，包括以下步骤：

首先，将2g的壳聚糖加入100ml体积比为2％的乙酸中，搅拌制备成壳聚糖的乙酸胶体；然后将48～72mg(宜多不宜少44mg、48mg也可，从实验的结果来看，实际可能要超过72mg才行)丹参酚酸B溶于1mL乙醇并将其添加到壳聚糖的乙酸中搅拌均匀，然后将Ca(NO₃)₂、KH₂PO₄加入混合溶液中长时间搅拌，以制备成丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石前驱体溶液，其中Ca/P的摩尔比值为5:3，壳聚糖/羟磷灰石最终质量比约为1：2；

然后，前驱体溶液搅拌4～5h后离心除气泡；再将溶液注倒入塑料模具中，依次放置于4℃的环境中2h，-10℃环境中3h使溶液冻成固体(或5h内逐步从4℃降温到-10℃)(逐步梯度降温冷冻成固体)，然后将固体冻干(8-24)h；经充分干燥后，将丹参酚酸B-壳聚糖/羟磷灰石支架浸泡在质量分数为1～2％(宜低不宜高1～2％)的NaOH溶液中(0.5-2)h，并用蒸馏水冲洗数次；之后，再次将支架冻干，然后两端各截去2～2.5mm，即得到了促进骨细胞生长的合成支架。

1、支架的制备

实施例1

丹参酚酸B(Sal B)(分子式：C₃₆H₃₀O₁₆,，分子量：718.6)购自sigma公司(天津、中国)；壳聚糖(CS)(分子量＝2.5×105，脱乙酰度≥90％，粘度>100cps，生物医学级)购自先锋生物科技公司(西安、中国)。首先，将2g的壳聚糖加入100ml>3)₂、KH₂PO₄(摩尔比Ca/P＝1.67)加入混合溶液中以制备成Sal>-⁷mol丹参酚酸B，我们也准备了同样制备条件下未加丹参酚酸B的支架以作为对照组。所有支架均通过20kGy>60Co进行灭菌并储存在室温真空包装中以备使用。

实施例2

丹参酚酸B(Sal B)(分子式：C₃₆H₃₀O₁₆,，分子量：718.6)购自sigma(天津、中国)；壳聚糖(CS)(分子量＝2.5×105，脱乙酰度≥90％，粘度>100cps，生物医学级)购自先锋生物科技公司(西安、中国)。首先，将2g的壳聚糖加入100ml>3)₂、KH₂PO₄(摩尔比Ca/P＝1.67)加入混合溶液中以制备成Sal>-7mol丹参酚酸B，我们也准备了同样制备条件下未加丹参酚酸B的支架以作为对照组。所有支架均通过20kGy>60Co进行灭菌并储存在室温真空包装中以备使用。

实施例3

丹参酚酸B(Sal B)(分子式：C₃₆H₃₀O₁₆,，分子量：718.6)购自sigma公司(天津、中国)；壳聚糖(CS)(分子量＝2.5×105，脱乙酰度≥90％，粘度>100cps，生物医学级)购自先锋生物科技公司(西安、中国)。首先，将2g的壳聚糖加入100ml>3)₂、KH₂PO₄(摩尔比Ca/P＝1.67)加入混合溶液中以制备成Sal>-7mol丹参酚酸B，我们也准备了同样制备条件下未加丹参酚酸B的支架以作为对照组。所有支架均通过20kGy>60Co进行灭菌并储存在室温真空包装中以备使用。

实施例4

丹参酚酸B(Sal B)(分子式：C₃₆H₃₀O₁₆,，分子量：718.6)购自sigma公司(天津、中国)；壳聚糖(CS)(分子量＝2.5×105，脱乙酰度≥90％，粘度>100cps，生物医学级)购自先锋生物科技公司(西安、中国)。首先，将2g的壳聚糖加入100ml>3)₂、KH₂PO₄(摩尔比Ca/P＝1.67)加入混合溶液中以制备成Sal>

然后，前驱体溶液匀浆4.5h后搅拌离心10min以去除气泡。将溶液倒入塑料模具(直径4.0mm，20mm长)，放置于4℃2h，-10℃3h，然后将溶液冻干16h。经充分干燥后，将Sal B-CS/HA支架浸泡在1.5％(重量/体积)NaOH溶液中1h并用蒸馏水冲洗数次。之后，再次将支架冻干，然后两端各截去2mm。最后，每个Sal B-CS/HA支架应至少包含1×10^-7mol丹参酚酸B，我们也准备了同样制备条件下未加丹参酚酸B的支架以作为对照组。所有支架均通过20kGy>60Co进行灭菌并储存在室温真空包装中以备使用。

2、支架的特性分析

2.1支架的微观结构

Sal B-CS/HA支架的分子结构可通过扫描电镜与HE染色观察。丹参酚酸B、CS/HA和Sal B-CS/Ha的红外光谱可通过范围在4,000–400cm^-1的傅里叶变换红外光谱记录。每个实验组的一个支架被研磨成粉，50℃干燥超过24h。实验前将溴化钾放在玛瑙研钵中用红外光照射3h。

图1为羟磷灰石、壳聚糖(CS/HA)为主要材料的支架与丹参酚酸B、羟磷灰石、壳聚糖(Sa B-CS/HA)为主要材料的支架的对比。从外观、HE染色、SEM均未见较大差异。

图2为丹参酚酸B(a),CS/HA(b)与Sa B-CS/HA(c)的红外光谱对比。可见丹参酚酸B在支架中结构未见改变。

2.2密度和孔隙率

支架的密度的测量的方法参照此文(Fan et al.2012)。用液体位移法测定孔隙率。实验结果的数据是五个样品数据的平均值。支架平均密度为94.2±1.6kg/m³，平均孔隙率为83.3±0.8％。

[1]Fan J,Bi L,Wu T,Cao L,Wang D,Nan K,Chen J,Jin D,Jiang S and Pei G(2012)A combined chitosan/nano-size hydroxyapatite system for the controlled release of icariin.J Mater Sci Mater Med 23:399-407.

2.3弹性模量

在室温和正常湿度情况下，样品的弹性模量通过一个通用的检测设备(ELF 3220seires2,Bose Co.,美国)来检测。样品的弹性模量可通过计算应力-应变曲线的初始线截面的斜率获得。实验结果的数据是五个样品数据的平均值。平均弹性模量为25.2±2.9kP。

2.3药物体外释放

通过高效液相色谱法测定Sal B-CS/HA支架中丹参酚酸B的释放(高效液相色谱法，Waters Co.,Milford,美国)。将Sal B-CS/HA支架浸泡在5ml pH 7.4的PBS中并轻轻摇动，转速为10rpm。在1、3、7、14、28、42和56天，收集PBS溶液并将其进行制备成冻干粉，然后300μL甲醇添加到粉末中并均匀混合。然后将溶液通过微孔过滤(孔径为22μm)过滤。同时，分别配置浓度为5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,50μg/ml and100μg/ml的丹参酚酸B的标准溶液，并通过高效液相色谱法测定不同浓度的标准浓度-吸光度曲线。Sal B-CS/HA支架中丹参酚酸B的释放浓度可根据标准曲线来确定。

图3为丹参酚酸B从Sa B-CS/HA支架中释放的曲线。丹参酚酸的稳定释放可以持续超过56天。在释放早期(1—14天)，丹参酚酸B的释放比率从10％逐渐增加至22％。在释放后期(28—56天)，药物释放速率减慢，释放药物从30％增至35％。

3、体外生物活性

3.1细胞和培养基的制备

MC3T3-E1细胞在添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中培养，人血管内皮细胞在添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM高葡萄糖培养基中培养。下面的实验中使用的所有的细胞全部为第5至第8传代的细胞。

1.5g已消毒的Sal B-CS/HA支架被切成切成厚度为4.0mm直径在5mm的小片，然后浸泡在15毫升37℃DMEM/F12或高糖DMEM培养液中72h，然后通过微孔滤膜过滤除去固体材料(孔径为22μm)，上清液作为条件细胞培养基(Sal B-CS/HA组)。用同样的方法，1.5g已消毒的未加丹参酚酸B的支架被制作成上清液，作为对照组的条件培养基(CS/HA组)

3.2支架上细胞的形态

MC3T3-E1细胞被接种到支架上，细胞密度1×10⁵/ml。5天后，样品用2.5％戊二醛固定，涂金。用扫描电子显微镜(扫描电镜)观察支架表面的细胞形态。

图4为细胞形态学对比。CS/HA与Sa B-CS/HA组的细胞形态学没有显著差异。

3.3细胞增殖

通过CCK8法检测小鼠成骨细胞MC3T3-E1的细胞增殖。将MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，每孔2000个细胞，37℃体外培养，并维持适宜湿度与5％的CO₂。一天之后，Sal>

图5为MC3T3-E1细胞增殖情况的对比。图示为CCK8的吸收程度，反应细胞存活状况。含有丹参酚酸B的支架相较于普通支架，能显著提高细胞增殖(*P＜0.05)。

图6为血管内皮细胞增殖情况的对比。图示为CCK8的吸收程度，反应细胞存活状况。含有丹参酚酸B的支架相较于普通支架，能显著提高细胞增殖(*P＜0.05)。

3.4碱性磷酸酶(ALP)活性

将MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，密度为1×10⁶/每孔。Sal>

3.5血管内皮生长因子(VEGF)的活性

将人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，密度为1×10⁶/每孔。Sal>

3.6统计学分析

统计分析采用SPSS软件，版本12.0(SPSS公司，美国)。数据均以平均值±标准差呈现。两个样本之间的统计分析进行了t检验。P<0.05被认为有统计学意义。

图7为碱性磷酸酶(ALP)活性的对比。图示为一周和两周时MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的对比。含有丹参酚酸B的支架相较于普通支架，能显著提高ALP活性(*P＜0.05)。

图8为血管内皮生长因子(VEGF)活性的对比。图示为一天和三天血管内皮细胞VEGF活性的对比。含有丹参酚酸B的支架相较于普通支架，能显著提高VEGF活性(*P＜0.05)。

以上，仅为本发明的较佳实施例，并非仅限于本发明的实施范围，凡依本发明专利范围的内容所做的等效变化和修饰，都应为本发明的技术范畴。