pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料及其制备方法与应用，该复合纳米材料由Fe3O4纳米粒子，包覆在Fe3O4纳米粒子表面的高分子层以及生长于高分子层上的金属有机框架构成；高分子层为螯合金属离子的第一聚合物或者由螯合金属离子的第一聚合物和亲水性的第二聚合物组成；金属有机框架是由Fe3+和含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物通过配位键形成。本发明提供的复合纳米材料，具有较好的磁响应性能，并可以在不同pH环境下可逆的、高选择性的捕获和释放糖蛋白，且pH环境相对温和，避免对糖蛋白活性产生影响。

说明书

技术领域

本发明属于磁性复合纳米材料领域，特别涉及pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料、其制备方法以及在糖蛋白捕获和释放方面的应用。

背景技术

蛋白糖基化，即在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，与蛋白质上的氨基酸形成糖苷键，是蛋白最普遍的翻译后修饰的一种形式，在许多生物学活动中扮演了重要角色，比如细胞粘附、分子识别、信号传导、蛋白折叠和代谢途径等。不正常的糖基化也与许多疾病有关，例如糖尿病、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等。为了更好地理解这些生物过程，或者发现新的疾病标志物，首先需要对糖蛋白进行捕获和释放。

在过去十年内，根据不同的机理，已有一些方法提出来特异性的识别或分离糖蛋白/糖肽，比如凝集素亲和色谱法(参见文献Wu,J.；Zhu,J.；Yin,H.；Buckanovich,R.J.；Lubman,D.M.Analysis of glycan variation on glycoproteins from serum by the reverse lectin-based ELISA assay.J.Proteome Res.2014,13,2197-2204)，酰肼化学法(参见文献Liu,L.；Yu,M.；Zhang,Y.；Wang,C.；Lu,H.Hydrazide functionalized core-shell magnetic nanocomposites for highly specific enrichment of N-glycopeptides.ACS Appl.Mater.Interfaces 2014,6,823-7832)，亲水相互作用色谱法(参见文献Zhu,J.；Sun,Z.；Cheng,K.；Chen,R.；Ye,M.；Xu,B.；Sun,D.；Wang,L.；Liu,J.；Wang,F.；Zou,H.Comprehensive mapping of protein N-glycosylation in human liver by combining hydrophilic interaction chromatography and hydrazide chemistry.J.Proteome Res.2014,13,1713-1721)和硼酸亲和色谱法(参加文献Li,D.；Chen,Y.；Liu,Z.Boronate affinity materials for separation and molecular recognition:structure,properties and applications.Chem.Soc.Rev.2015,44,8097-8123)。目前，引起广泛关注的实现糖蛋白捕获和分离的方法是将具有pH开关性能的硼酸亲和色谱与具有独特磁性能的磁性纳米粒子结合的策略，一般是在磁性纳米材料表面修饰上小分子的硼酸配体，首先，磁性纳米材料通过多步操作被预功能化活性基团(如羧基、氨基、叠氮基等)，然后这些活性基团再与小分子硼酸配体的活性基团(如氨基、炔基等)反应，从而嫁接上小分子硼酸配体(参见文献hang,L.；Xu,Y.；Yao,H.；Xie,L.；Yao,J.；Lu,H.；Yang,P.Boronic acid functionalized core-satellite composite nanoparticles for advanced enrichment of glycopeptides and glycoproteins.Chem.Eur.J.2009,15,10158-10166)；然而，其捕获或释放糖蛋白的过程中，所需的缓冲液pH值是强酸性或强碱性，不利于保持糖蛋白的活性，而且，硼酸功能化的磁性复合纳米材料的制备过程较为繁琐，极大增加了制备成本，加之小分子硼酸配体嫁接量因为其较大的空间位阻使得硼酸嫁接效率较低，从而限制其在生物医学方面的应用。因此，研发一种能简单有效的在温和的pH环境下高选择性地捕获和释放糖蛋白的策略，是一项非常有意义且迫切的工作。

金属有机框架(Metal-Organic Frameworks，MOFs)是由金属离子和有机配体通过配位键或分子间作用力形成的。MOFs以金属离子为中心，具有较高的孔隙率，优良的机械稳定性和易于调整的表面性能，且其具有丰富的芳香配体，由于以上独特的性质，金属有机框架被广泛应用于不同的领域，如储能、催化、小分子受体、苯同系物的分离等。最近，MOFs也被广泛应用于生物医学领域，例如药物释放、光动力学治疗、显影、酶催化和蛋白富集等。在有关于蛋白的应用中，科学家们主要集中于提高蛋白质的捕获效率，而忽略了蛋白的释放过程，被MOFs捕获的蛋白质很难从材料上洗脱下来，即使能够被洗脱下来，由于洗脱过程需要加入对蛋白活性有影响的物质，如2-甲基咪唑或三氟乙酸(参见文献W.L.Liu,S.H.Lo,B.Singco,C.C.Yang,H.Y.Huang and C.H.Lin,J.Mater.Chem.B,2013,1,928；M.Zhao,C.Deng and X.Zhang,Chem.Commun.,2014,50,6228；N.Sun,X.Zhang and C.Deng,Nanoscale,2015,7,6487；M.Zhao,X.Zhang and C.Deng,Chem.Commun.,2015,51,8116；Y.Chen,Z.Xiong,L.Peng,Y.Gan,Y.Zhao,J.Shen,J.Qian,L.Zhang and W.Zhang,ACS Appl.Mater.Interfaces,2015,7,16338；J.Zheng,Z.Lin,G.Lin,H.Yang and L.Zhang,J.Mater.Chem.B,2015,5,2185.)，会严重影响对释放后的蛋白质的进一步分析或应用。

发明内容

本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料，可以在温和的pH环境下可逆的、高选择性的捕获或释放糖蛋白。

本发明另一目的旨在提供一种反应条件温和、制备成本低的制备方法，用于制备上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料。

本发明再一目的旨在提供上述pH响应型磁性复合纳米球在糖蛋白捕获或释放中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现。

本发明提供了一种pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料，该复合纳米材料由Fe₃O₄纳米粒子，包覆在Fe₃O₄纳米粒子表面的高分子层以及生长于高分子层上的金属有机框架构成；所述高分子层为螯合金属离子的第一聚合物或者由螯合金属离子的第一聚合物和亲水性的第二聚合物组成，当高分子层为由螯合金属离子的第一聚合物和亲水性的第二聚合物组成时，所述第一聚合物与第二聚合物的质量比为1：(0.3～1)；所述金属有机框架是由Fe³⁺和含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物通过配位键形成。

上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料，第一聚合物为聚乙烯吡咯烷酮或聚多巴胺；所述第二聚合物为聚醚酰亚胺或聚丙烯酸；含有至少一个羧基的苯硼酸衍生物为5-硼酸基间苯二甲酸(5-Boronoisophthalic acid)、3-羧基苯硼酸或4-羧基苯硼酸，所述含有至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物为对苯二硼酸或间苯二硼酸。

上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的平均粒径分布窄，约为300nm～500nm。该磁性金属有机框架复合纳米材料由Fe₃O₄纳米粒子作为核，具有高的磁饱和强度，从而提供较好的磁响应性能；包裹在Fe₃O₄纳米粒子表面的高分子层作为过渡层，不仅改进了材料的亲水性，而且能够螯合金属离子，使金属有机框架(MOFs)生长于该高分子层上；最外层的金属有机框架由Fe³⁺和含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物通过配位键形成，其中含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物既作为金属有机框架的有机配体，又作为具有pH响应性和捕获蛋白质的功能分子，从而赋予材料pH响应性能以及选择性捕获蛋白质的能力。

本发明进一步提供了上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，该制备方法的基本原理是首先利用溶剂热法制备Fe₃O₄纳米粒子；再在制得的Fe₃O₄纳米粒子表面包覆由第一聚合物和亲水性的第二聚合物混合而成高分子层，制得高分子层包覆的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；然后将可溶性三价铁盐作为金属源、含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物作为有机配体，通过一锅法将MOFs生长在Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面得到pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料。

基于上述原理，本发明提供的pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，步骤如下：

(1)配制Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液

将Fe₃O₄纳米粒子分散到去离子水中，配制Fe₃O₄纳米粒子浓度为40～80mg/mL的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液；将第一聚合物或第一聚合物与第二聚合物溶于去离子水中，配制第一聚合物浓度为55～85mg/ml或第一聚合物与第二聚合物总浓度为55～85mg/ml的高分子水溶液，当将第一聚合物与第二聚合物溶于去离子水时，第一聚合物与第二聚合物的质量比为1：(0.3～1)；

(2)制备Fe₃O₄/Polymer纳米粒子

将步骤(1)配制的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液按照体积比1：(2～6)计量并加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应至少8小时得第一反应液，然后用磁铁收集第一反应液中的固体产物，再依次用去离子水、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺对固体产物洗涤得到Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；

(3)制备pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料

将步骤(2)所得洗涤后的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散到N,N-二甲基甲酰胺中，得到浓度为65～95mg/ml的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子悬浮液；将乙腈和N,N-二甲基甲酰胺等体积混合均匀得到第一混合液；按Fe₃O₄/Polymer纳米粒子悬浮液与第一混合液中N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1︰(1～16)计量Fe₃O₄/Polymer纳米粒子悬浮液和第一混合液，在搅拌下将Fe₃O₄/Polymer纳米粒子悬浮液加入到第一混合液中，并搅拌至Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散均匀得到第二混合液；在搅拌下，向第二混合液中加入可溶性三价铁盐和含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物并搅拌均匀得到第三混合液，所述苯硼酸衍生物的加入量以第二混合液中N,N-二甲基甲酰胺的含量为基准，每6～10ml>

上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，Fe₃O₄纳米粒子可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见Zhao,M.；Zhang,X.；Deng,C.Rational>2+-Iminodiacetic>3O₄纳米粒子；然后依次用乙醇和去离子水对Fe₃O₄纳米粒子进行洗涤除去未反应的原料。

上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，步骤(2)的目的是利用螯合金属离子的第一聚合物或螯合金属离子的第一聚合物与亲水性的第二聚合物一起将Fe₃O₄纳米粒子包覆完全，得到高分子层包裹的Fe₃O₄纳米粒子(即Fe₃O₄/Polymer纳米粒子)，以便在Fe₃O₄纳米粒子表面能进一步生长MOFs，其中，第一聚合物作为过渡层，螯合MOFs层的金属离子，使MOFs层在Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面生长，第二聚合物用于增加材料的亲水性，第二聚合物在本材料中并不是必须的，但是为了提高最终材料在水中的分散性，进而提高对蛋白质捕获和释放效率，第一聚合物与第二聚合物一起组成高分子层时为较佳的选择，此时第一聚合物与第二聚合物的质量比优选为1：(0.3～1)，优选为1：(0.3～0.5)。当Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液体积比为1：(2～6)时，基本可以保证Fe₃O₄纳米粒子被高分子层包覆完全。步骤(2)用磁铁收集第一反应液中的固体产物之后，需要进一步用去离子水、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺对固体产物洗涤除去吸附在固体产物表面、未反应的第一聚合物或第二聚合物，一般每种洗液洗涤三至五次即可。

上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，步骤(3)的目的是在步骤(2)得到的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面生长MOFs层，得到pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料(即Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料)。可溶性三价铁盐用于提供Fe³⁺，其可以为Fe(NO)₃或FeCl₃，当可溶性三价铁盐与含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物摩尔比为(0.5～2):1，特别是(0.8～1):1时，形成的MOFs层表现出良好的pH响应性能和蛋白质选择吸附性能。为了能够提高Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面螯合金属离子效率，Fe₃O₄/Polymer纳米粒子悬浮液与混合液的添加比例应按照中Fe₃O₄/Polymer纳米粒子悬浮液与N,N-二甲基甲酰胺体积比1：(1～16)添加，其优选比例为1：(6～10)，当Fe₃O₄/Polymer纳米粒子添加量过少，不利于Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面形成MOFs层，而当Fe₃O₄/Polymer纳米粒子添加量过大时，容易造成Fe₃O₄/Polymer纳米粒子的聚集，同样不利于Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面形成MOFs层。步骤(3)用磁铁收集第二反应液中的固体产物之后，需要进一步用N,N-二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水对固体产物洗涤除去吸附在固体产物表面的混合液以及未反应的苯硼酸衍生物等，一般每种洗液洗涤三至五次即可。

上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，所述第一聚合物为聚乙烯吡咯烷酮或聚多巴胺；所述第二聚合物为聚醚酰亚胺或聚丙烯酸；所述可溶性三价铁盐为Fe(NO)₃或FeCl₃；所述含有至少一个羧基的苯硼酸衍生物为5-硼酸基间苯二甲酸、3-羧基苯硼酸或4-羧基苯硼酸，所述含有至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物为对苯二硼酸或间苯二硼酸。

本发明进一步提供了一种上述pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料在糖蛋白捕获或糖蛋白释放中的应用；在pH为中性环境下，所述磁性金属有机框架复合纳米材料表面的苯硼酸能和糖蛋白的顺式二醇共价形成环醚，而实现对糖蛋白的捕获；而当环境pH转变到8～9的碱性环境时，就能够可逆的释放糖蛋白，即所述磁性金属有机框架复合纳米材料将捕获的糖蛋白释放。

上述糖蛋白的捕获和释放方法，可以用于捕获和释放任何一种类型的糖蛋白，例如转铁蛋白、辣根过氧化物酶、甲胎蛋白等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料，以Fe₃O₄纳米粒子作为核，具有高的磁饱和强度，从而提供较好的磁响应性能，可以在较短的时间内完成磁分离；此外，该复合纳米材料表面的MOFs层包含苯硼酸衍生物，在作为有机配体的同时，可以在不同pH环境下可逆的、高选择性的捕获和释放糖蛋白。

2、本发明提供的pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料，能够实现在pH为中性环境下有效地捕获糖蛋白，并在pH为8～9的碱性环境下可逆的释放糖蛋白，捕获和释放糖蛋白的pH环境相对温和，避免对糖蛋白活性产生影响。

3、本发明提供的pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料的制备方法，操作简单、反应条件温和，中间产物Fe₃O₄/Polymer纳米粒子在室温条件下便可得到，而Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、可溶性三价铁盐和含有至少一个羧基或者至少两个硼酸基的苯硼酸衍生物采用一锅法在短时间内就可以制备得到该复合纳米材料，因此易于在生物医药行业领域内推广。

附图说明

图1为本发明实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备流程图。

图2为本发明实施例使用Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料对蛋白混合体系中糖蛋白的捕获和分离流程图。

图3为本发明实施例Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的结构表征示意图，其中(A)、(D)和(G)为Fe₃O₄纳米粒子的扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图和尺寸分布图(DLS)，(B)、(E)和(H)为Fe₃O₄/Polymer纳米粒子的扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图和尺寸分布图(DLS)，(C)、(F)和(I)为Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图和尺寸分布图(DLS)。

图4为本发明实施例Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的Zeta电位图。

图5为Fe₃O₄纳米粒子(A)、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子(B)、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料(C)的能量弥散X射线(EDX)能谱图。

图6为本发明实施例PVP(a)、PEI(b)、PBA(c)、Fe₃O₄纳米粒子(d)、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子(e)、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料(f)在波数4000～500(cm^-1)之间的红外图谱。

图7为本发明实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的氮气的吸附-解吸附等温曲线(A)以及根据氮气吸附-解吸附等温曲线利用Barrett–Joyner–Halenda(BJH)估算的Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的孔径尺寸分布曲线。

图8为本发明实施例PVP(a)、PBA(b)、Fe₃O₄纳米粒子(c)、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子(d)、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料(e)、MOFs(f)的X射线光衍射(XRD)图谱；其中最下方标识的是Fe₃O₄的标准XRD衍射峰(JCPDS号19-06290)。

图9为本发明实施例PVP(a)、PBA(b)、Fe₃O₄纳米粒子(c)、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子(d)、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料(e)的热重分析(TGA)图。

图10为本发明实施例Fe₃O₄纳米粒子(a)、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子(b)、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料(d)的磁滞回线图(A)以及所得磁滞回线在低场区域的展开图(B)。

图11为本发明实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料对无磁铁状态以及有磁铁响应的状态图。

图12为本发明实施例分子量标样(marker)，蛋白混合液(Mix)与Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在pH＝7环境下孵育前后的蛋白混合液的标样(Mix)、上层清液(S)、键合蛋白的材料(C)，以及在pH＝7或pH＝9环境下洗脱后的洗脱液(E)、洗脱后的材料(C)的SDS-PAGE分析图；其中，孵育过程用I表示，洗脱过程用E表示。

图13为分子量标样(marker)、蛋白混合样品(Mix)与商用磁珠在pH＝7环境下孵育前后的蛋白混合液的标样(Mix)、上层清液(S)、键合蛋白的材料(C)，以及在pH＝7或pH＝9环境下洗脱后的洗脱液(E)、洗脱后的材料(C)的SDS-PAGE分析图；其中，孵育过程用I表示，洗脱过程用E表示。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。

实施例1制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

本实施例中，高分子层为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，金属有机框架以硝酸铁为金属源，以1,4-对苯二硼酸(PBA)作为有机配体。

图1给出了Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备流程图，首先利用溶剂热法制备表面显负电性的Fe₃O₄纳米粒子；再依据静电作用、范德华力等相互作用，在制得的Fe₃O₄纳米粒子表面包覆一层高分子层，得到高分子层包覆的Fe₃O₄纳米球(Fe₃O₄/Polymer纳米粒子)；然后将硝酸铁为金属源、1,4-对苯二硼酸(PBA)作为有机配体，与Fe₃O₄/Polymer纳米粒子一起通过一锅法制备得到Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料。

结合上述流程，本实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄纳米粒子

将原料1.157g六水合氯化铁、1.0g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有57mL溶剂乙二醇的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至180℃，反应15小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用去离子水对产物重复洗涤五次(10mL×5)得到Fe₃O₄纳米粒子；

(2)配制Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液

将步骤(1)所得洗涤后的Fe₃O₄纳米粒子分散到18.75ml去离子水中，配制Fe₃O₄纳米粒子浓度为40mg/mL的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液；将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于去离子水中，配制PVP浓度为55mg/ml的高分子水溶液；

(3)制备Fe₃O₄/Polymer纳米粒子

取步骤(2)配制的6.25mlFe₃O₄纳米粒子悬浮液和12.5ml高分子水溶液加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应8小时得第一反应液，然后用磁铁收集第一反应液中的固体产物，再依次用去离子水对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用乙醇对产物重复洗涤五次(10mL×5)和用N,N-二甲基甲酰胺对产物洗涤五次(10mL×5)得到Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；

(4)制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs

将步骤(3)所得洗涤后的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散到2.45ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液；将6ml乙腈和6ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液加入到第一混合液中，并搅拌至Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散均匀得到第二混合液；在搅拌下，向第二混合液中加入202mgFe(NO₃)₃·9H₂O和160mg>3O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料。

实施例2制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

本实施例中，高分子层为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚醚酰亚胺(PEI)，金属有机框架以硝酸铁为金属源，以1,4-对苯二硼酸(PBA)作为有机配体。

本实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄纳米粒子

将原料1.157g六水合氯化铁、0.4g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有60mL溶剂乙二醇的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄纳米粒子；

(2)配制Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液

将步骤(1)所得洗涤后的Fe₃O₄纳米粒子分散到15ml去离子水中，配制Fe₃O₄纳米粒子浓度为50mg/mL的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液；将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚醚酰亚胺(PEI)按照质量比1：0.4溶于去离子水中，配制PVP和PEI总浓度为70mg/ml的高分子水溶液；

(3)制备Fe₃O₄/Polymer纳米粒子

取步骤(2)配制的5mlFe₃O₄纳米粒子悬浮液和20ml高分子水溶液加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应12小时得第一反应液，然后用磁铁收集第一反应液中的固体产物，再依次用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)和用N,N-二甲基甲酰胺对产物洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；

(4)制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

将步骤(3)所得洗涤后的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散到2ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液；将8ml乙腈和8ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液加入到第一混合液中，并搅拌至Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散均匀得到第二混合液；在搅拌下，向第二混合液中加入320mgFe(NO₃)₃·9H₂O和160mg>3O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料。

实施例3制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

本实施例中，高分子层为聚多巴胺(PDA)和聚丙烯酸(PAA)，金属有机框架以氯化铁为金属源，以3-羧基苯硼酸作为有机配体。

本实施例Fe3O4/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄纳米粒子

将原料1.157g六水合氯化铁、0.7g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有60mL溶剂乙二醇的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至220℃，反应17小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(20mL×3)得到Fe₃O₄纳米粒子；

(2)配制Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液

将步骤(1)所得洗涤后的Fe₃O₄纳米粒子分散到9.4ml去离子水中，配制Fe₃O₄纳米粒子浓度为80mg/mL的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液；将聚多巴胺(PDA)和聚丙烯酸按照质量比1：1溶于去离子水中，配制PVP和PEI总浓度为85mg/ml的高分子水溶液；

(3)制备Fe₃O₄/Polymer纳米粒子

取步骤(2)配制的3.5mlFe₃O₄纳米粒子悬浮液和21ml高分子水溶液加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应24小时得第一反应液，然后用磁铁收集第一反应液中的固体产物，再依次用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)和用N,N-二甲基甲酰胺对产物洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；

(4)制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

将步骤(3)所得洗涤后的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散到2ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液；将16ml乙腈和16ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液加入到第一混合液中，并搅拌至Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散均匀得到第二混合液；在搅拌下，向第二混合液中加入650mgFeCl₃和332mg>3O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料。

实施例4制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

本实施例中，高分子层为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚醚酰亚胺(PEI)，金属有机框架以硝酸铁为金属源，以4-羧基苯硼酸作为有机配体。

本实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄纳米粒子

将原料1.157g六水合氯化铁、0.4g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有60mL溶剂乙二醇的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄纳米粒子；

(2)配制Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液

将步骤(1)所得洗涤后的Fe₃O₄纳米粒子分散到15ml去离子水中，配制Fe₃O₄纳米粒子浓度为50mg/mL的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液；将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚醚酰亚胺(PEI)按照质量比1：0.3溶于去离子水中，配制PVP和PEI总浓度为70mg/ml的高分子水溶液；

(3)制备Fe₃O₄/Polymer纳米粒子

取步骤(2)配制的5mlFe₃O₄纳米粒子悬浮液和15ml高分子水溶液加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应10小时得第一反应液，然后用磁铁收集第一反应液中的固体产物，再依次用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)和用N,N-二甲基甲酰胺对产物洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；

(4)制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

将步骤(3)所得洗涤后的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散到2ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液；将10ml乙腈和10ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液加入到第一混合液中，并搅拌至Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散均匀得到第二混合液；在搅拌下，向第二混合液中加入404mg>3)₃·9H₂O和166mg>3O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料。

实施例5制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

本实施例中，高分子层为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚丙烯酸(PAA)，金属有机框架以氯化铁为金属源，以间苯二硼酸作为有机配体。

本实施例Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的制备步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄纳米粒子

将原料1.157g六水合氯化铁、0.4g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有60mL溶剂乙二醇的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄纳米粒子；

(2)配制Fe₃O₄纳米粒子悬浮液和高分子水溶液

将步骤(1)所得洗涤后的Fe₃O₄纳米粒子分散到15ml去离子水中，配制Fe₃O₄纳米粒子浓度为50mg/mL的Fe₃O₄纳米粒子悬浮液；将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚丙烯酸(PAA)按照质量比1：0.5溶于去离子水中，配制PVP和PAA总浓度为70mg/ml的高分子水溶液；

(3)制备Fe₃O₄/Polymer纳米粒子

取步骤(2)配制的5mlFe₃O₄纳米粒子悬浮液和25ml高分子水溶液加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应14小时得第一反应液，然后用磁铁收集第一反应液中的固体产物，再依次用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)和用N,N-二甲基甲酰胺对产物洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄/Polymer纳米粒子；

(4)制备Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料

将步骤(3)所得洗涤后的Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散到2ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液；将8ml乙腈和8ml>3O₄/Polymer纳米粒子悬浮液加入到第一混合液中，并搅拌至Fe₃O₄/Polymer纳米粒子分散均匀得到第二混合液；在搅拌下，向第二混合液中加入160mg>3和160mg间苯二硼酸并搅拌均匀得到第三混合液；在搅拌下将第三混合液升温至120℃，反应6小时得到第二反应液，之后用磁铁收集第二反应液中的固体产物，再依次用N,N-二甲基甲酰胺对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)和用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料。

对比例

本对比例是制备无Fe₃O₄的金属有机框架材料，首先将320mgFe(NO₃)₃·9H₂O和160mg>

实验例1结构表征

为了探究高分子层以及金属框架MOFs已经成功复合到Fe₃O₄纳米粒子上，本实验例对实施例2给出的Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料制备过程中得到的Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子和Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的形貌尺寸和微观结构进行了表征如图3至图8所示。

(1)形貌与尺寸分布

从图3(A)-(F)可以看出，Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料均为球形，大小均一，数据表面所包裹的高分子层及MOF层并没有对Fe₃O₄纳米粒子的形貌和尺寸产生过多影响；Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料平均粒径为300nm～500nm；通过动态光散射检测得到Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的平均粒径峰值分别为299±4nm,317±22nm，340±61nm(图3G-I)，此结果与扫描电镜和透射电镜结果一致。

(2)微结构研究

如图4所示，Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在去离子水中的zeta电位分别为-15mV(由于Fe₃O₄纳米粒子表面附着的柠檬酸钠存在羧基，从而使Fe₃O₄纳米粒子显负电)、+34mV(由于Fe₃O₄纳米粒子包裹PVP和PEI后，PEI存在大量氨基，从而使Fe₃O₄/Polymer纳米粒子显正电)和-12mV(由于MOFs层中有机配体PBA存在硼酸基团，从而使Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料显负电)；这种电荷翻转进一步证明了高分子层及MOFs层已成功被合成到Fe₃O₄纳米粒子和Fe₃O₄/Polymer纳米粒子上。

如图5所示，通过能量弥散X射线(EDX)检测得出，Fe₃O₄纳米粒子中，C元素重量百分比为10.04％、原子百分比为21.69％，O元素重量百分比为31.59％、原子百分比为51.21％，Fe元素重量百分比为58.36％、原子百分比27.10％；Fe₃O₄/Polymer纳米粒子中，C元素重量百分比为8.20％、原子百分比为14.92％，N元素重量百分比为12.04％、原子百分比为18.80％，O元素重量百分比为35.94％、原子百分比为49.12％，Fe元素重量百分比为43.82％、原子百分比17.16％；Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料中，B元素重量百分比为9.55％、原子百分比为16.02％，C元素重量百分比为12.20％、原子百分比为18.42％，N元素重量百分比为13.98％、原子百分比为18.10％，O元素重量百分比为32.88％、原子百分比为37.27％，Fe元素重量百分比为31.39％、原子百分比10.19％。从上述检测结果可以看出，Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料中存在N元素和B元素，进一步证明高分子层(高分子层中PEI中含有氨基，氨基中含有N元素)和MOFs层(MOFs层中的有机配体PBA含有B元素)已经成功在Fe₃O₄纳米粒子表面形成。

本实验例采用PE spectrometer型傅里叶转换红外光谱仪(FTIR)分别检测PVP、PEI、PBA、Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在500-4000cm^-1波数范围内的红外吸收光谱，检测步长为4cm^-1，检测结果如图6所示，Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的吸收峰含有Fe-O(600cm^-1)、C-N(1436cm^-1)和PBA(633cm^-1)的特征吸收峰，说明高分子层和MOFs层已经成功在Fe₃O₄纳米粒子表面形成。然而，C-N和PBA的特征峰较弱，可能是因为PVP、PEI和PBA的含量较少的原因。

如图7所示，通过获得的N₂吸附/解吸附等温曲线表明Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的Langumir表面积及孔容分别为159m²/g、0.6cm³/g，根据Barrett–Joyner–Halenda(BJH)估算的Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料孔径约为11.8埃～27.3埃，这种多孔的性质说明在Fe₃O₄/Polymer纳米粒子表面形成了网络结构；而且产物的颜色从原始的黑色变为红棕色，证明这种网络结构确实是由Fe³⁺和PBA共同形成的金属有机框架结构(MOFs)，而非无色的仅有PBA自身脱水形成的共价有机框架(Covalent>

本实验例采用X’Pert Pro MPD型X射线衍射(XRD)仪分别检测了Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的X射线衍射图谱，如图8所示，Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料均与标准Fe₃O₄的衍射峰位置一致，说明Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料保留了Fe₃O₄纳米粒子的晶体结构；同时，Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在25°出现了一个新的宽的衍射峰，而对比例3所得到无Fe₃O₄的金属有机框架产物的XRD在25°同样存在一个衍射峰，这说明该衍射峰是由于受所制备MOFs壳层的影响而出现的，实施例2所得产物表面的MOFs层是由Fe³⁺和PBA通过不规则的配位而形成的无定型的金属有机框架结构。

综上所述，Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的壳层具有金属有机框架结构，且该结构并没有明显影响复合纳米材料的磁晶体结构，这种独特的MOFs壳层将有利于在糖蛋白捕获和释放中的应用。

实验例2磁性能研究

为了探究Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的磁性能，本实验例采用STA>3O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在氮气保护下从35℃升温到850℃的重量损失，结果如图9所示；通过热重分析数据计算得出Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的质量百分含量(磁含量)分别约为83％，82％，81％，说明Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料均具有较好的磁性能，有助于提高后续蛋白分离速率。

进一步的，本实验例采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)分别检测了Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在-18000到18000Oe范围内的磁滞回线(见图10(A))和所得磁滞回线在磁场-100～100Oe之间的扩展图(见图10(B))，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料都具有超顺磁性，且所制备的Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer纳米粒子、Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料磁饱和强度分别为64emu/g，63emu/g，38emu/g，因此Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料具有较好的磁响应性，10s内即可完成磁分离(如图11所示)。

应用例糖蛋白分离研究

本应用例所使用的Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料按照以下方法处理备用：将实施例2得到的Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料分散到1.0mL去离子水中得到Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料浓度为30mg/mL的悬浮液，备用。

转铁蛋白(transferrin，TRF)为单链糖蛋白，其含糖量约6％，是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁；在血液中不正常的转铁蛋白含量与许多疾病有关，例如心脏衰竭、缺铁性贫血、营养不良、转铁蛋白缺乏症等。因此，本应用例中，以转铁蛋白为模型靶向糖蛋白，牛血清白蛋白(BSA)为模型非糖蛋白来研究材料对糖蛋白的选择性分离研究。

利用Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料在pH＝7的含乙腈(体积浓度为20％)的BR(Britton-Robinson)缓冲溶液(作为孵育液)中捕获混合蛋白体系中的TRF和在pH＝9的BR缓冲溶液中释放TRF的过程参见图2，操作过程为：将转铁蛋白(TRF)、牛血清白蛋白(BSA)分别溶于pH＝7的含乙腈(体积浓度为20％)的BR缓冲溶液中，制得两种浓度为1000μg/mL的相应蛋白溶液，并把每种蛋白溶液等体积混匀得到蛋白混合液(TRF+BSA)；取所得30μL>3O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的悬浮液和30μL蛋白混合液，将两者于反应容器中混合并在震荡条件下于室温孵育60min，然后用磁铁进行分离，分别收集上层清液及沉淀，再将沉淀用孵育液洗涤三次(每次100μL)，得到沉淀材料。

将沉淀材料分散到20μL孵育液中得到沉淀悬浮液，分别取12μL孵育前的蛋白混合液、上层清液和沉淀悬浮液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图12所示。

将上述键合了蛋白质的沉淀材料分别分散到40μL pH＝7和pH＝9的BR缓冲溶液中在震荡条件下于室温洗脱60min，然后用磁铁进行分离，分别收集洗脱液和洗脱后得到的沉淀材料，并对洗脱液和洗脱后得到的沉淀材料进行SDS-PAGE分析，结果如图12所示。

如图12所示，上层清液中只有BSA残余，且键合了蛋白的材料只展示了TRF条带，说明溶液中的TRF已被选择性吸附到Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料表面。当用pH＝4的孵育液洗脱蛋白质，被吸附到材料表面的糖蛋白TRF并不能被洗脱下来，说明TRF和Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料的结合作用是比较强的特异性结合作用。然而，当pH调至9时，蛋白质很容易地从材料表面洗脱下来，说明Fe₃O₄/Polymer/MOFs复合纳米材料能够pH响应性地可逆得捕获和释放TRF。

作为对比，将900μg羧化的商用磁珠加入到30μL蛋白混合液，将两者于反应容器中混合并在震荡条件下于室温孵育60min，然后用磁铁进行分离，分别收集上层清液及沉淀，再将沉淀用孵育液洗涤三次(每次100μL)，得到沉淀材料。然后将沉淀材料分散到20μL孵育液中得到沉淀悬浮液，分别取12μL孵育前的蛋白混合液、孵育后磁分离后的上层清液和沉淀悬浮液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图13所示。再将上述沉淀材料分别分散到40μL pH＝7和pH＝9的BR缓冲溶液中在震荡条件下于室温洗脱60min，然后用磁铁进行分离，分别收集洗脱液和洗脱后得到的沉淀材料，并对洗脱液和洗脱后得到的沉淀材料进行SDS-PAGE分析，结果如图13所示。

如图13所示，当采用羧化的商用磁珠时，上清液和键合了蛋白的材料上均包括TRF和BSA条带，且键合了蛋白的材料对应的条带更明显，说明商用磁珠已经捕获了蛋白质，但没有表现出任何的选择性；而当用pH＝7和pH＝9的BR缓冲溶液对键合了蛋白的材料进行洗脱时，两种洗脱液均不能将TRF或BSA从商用磁珠上洗脱下来，说明商用磁珠没有表现出pH响应性能。

本应用例中的转铁蛋白可以替换为辣根过氧化物酶(HRP)或甲胎蛋白(AFP)等糖蛋白；牛血清白蛋白(BSA)可以替换为溶菌酶(LYZ)、糜蛋白酶(CTP)，细胞色素C(Cyt C)等非糖蛋白，且上述糖蛋白和非糖蛋白可以以任意比例搭配。

本应用例中采用的pH＝7的含乙腈(体积浓度为20％)的BR缓冲溶液可以替换为pH＝7的含乙腈(体积浓度为20％)的磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液，或pH＝7的含乙腈(体积浓度为20％)的磷酸氢二钾–磷酸二氢钾缓冲液；采用的pH＝9的BR缓冲溶液可以替换为pH为8～9的甘氨酸–氢氧化钠缓冲液，或Tris–盐酸缓冲液。

总之，所制备的Fe₃O₄/CMCS/PAAPBA纳米球在生物样本中可以pH响应地对糖蛋白的选择性捕获，富集和释放，展示了其在诊断和蛋白组学中的应用潜力。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。