生产乙醇的重组酿酒酵母菌株、其构建方法以及利用该菌株生产乙醇的方法

摘要

本发明提供了一种生产乙醇的重组酿酒酵母菌株、构建该菌株的方法、以及利用该菌株生产乙醇的方法。本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株以野生型酿酒酵母菌株为出发菌株，向其中引入XI木糖代谢途径并增强PPP途径中四个关键基因的表达，同时敲除醛糖还原酶基因GRE3以及任选敲除硝基苯磷酸酶基因PHO13，并通过膜定位基团的膜定位作用将外源引入的XI蛋白和XK蛋白定位于酵母细胞膜上。本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株能够高效地进行木糖代谢，从而实现C5糖和C6糖的共发酵，并由此实现更高的乙醇转化率。

说明书

技术领域

本发明涉及由生物质生产乙醇的重组酵母菌株。具体而言，本发明涉及能够同时利用五碳糖和六碳糖来高效生产乙醇的共发酵重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株、构建该菌株的方法、以及利用该菌株生产乙醇的方法。

背景技术

近年来，诸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源，特别是生物燃料受到越来越多的关注，并带来巨大的商机和社会意义。有“绿色石油”和“液体黄金”之称的乙醇是一种新型的清洁可再生液体燃料，许多国家已经开始使用添加了一定比例乙醇的汽油—汽油醇，以减少汽油的消耗。这种新型燃料既能缓解石油的消耗速率，又可以减少汽车尾气污染，因此具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起开始推广使用汽油醇，目前汽油醇占汽油类燃料总消耗量的约20％，并处于逐年增长的势头。因此，利用农产物、农林废弃物等生物质作为原料来生产乙醇的策略越来越受到各国政府及研究人员的重视。

具体而言，生物质能源由于具有储量大、分布广、可再生等特点而被人们开发为煤、石油、天然气等化石燃料的替代能源，其中，将木质纤维素转化为燃料乙醇是生物质能源开发利用的一个重要方向。木质纤维素一般是指以木质素、纤维素以及半纤维素作为主要组成成分的生物质，相比淀粉和糖类等传统乙醇生产原料而言，木质纤维素十分廉价且容易获得，因而成为了目前生物质能源研究的主要材料。

目前，使用含木质纤维素的生物质进行的生物燃料生产属于先进生物燃料技术范畴。利用含木质纤维素的原料生产乙醇通常采用生物化学转化的工艺，此类生物化学转化工艺一般包括预处理、水解、发酵和回收等步骤。纤维素、半纤维素和木质素之间通过共价键和非共价键结合形成致密的结构，阻碍了酶对木质纤维素的降解，因此在将木质纤维素水解发酵之前通常需要进行预处理，经过预处理，提高了酶和木质纤维素原料的可接近性，从而提高了原材料的可利用性及水解效率。水解(包括酶解)以后，半纤维素主要分解为五碳糖(C5糖，例如木糖)，而纤维素主要分解为六碳糖(C6糖，例如葡萄糖)。由于半纤维素的无定型结构，其更容易被水解为C5糖。在大多数木质纤维素水解物中，木糖是含量仅次于葡萄糖的一种单糖，因而，如果能够充分利用木质纤维素水解物中的木糖来发酵生产乙醇，将会大大提高木质纤维素的利用率及乙醇生产效率。在预处理阶段和水解(包括酶解)阶段，通常会得到部分发酵抑制物，例如甲酸、乙酸、糠醛等，因而在水解液发酵前需要进行脱毒处理，以消除这些抑制物对发酵的抑制作用。

在天然微生物中，存在两种将木糖代谢为木酮糖的途径(参见图1)。在细菌(如密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、少数真菌(如梨囊鞭菌属(Piromyces)和根囊鞭菌属(Orpinomyces))以及植物(如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)和水稻(Oryza sativa))等中，通过木糖异构酶(xylose isomerase，XI)的作用，仅需一步反应即可将木糖直接异构化为木酮糖。而在大多数可以进行木糖代谢的天然真菌(如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))，尤其是酵母(如树干毕赤酵母(P.stipitis)、休哈塔假丝酵母(C.shehatae)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus))中，存在另一种木糖代谢途径，这一途径包含两步氧化还原反应：首先，NAD(P)H(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸))依赖型木糖还原酶(xylosereductase，XR)将木糖还原成木糖醇；随后，木糖醇被NAD⁺依赖性木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase，XDH)氧化为木酮糖。木糖转化为木酮糖后，再经由木酮糖激酶(xylulokinase，XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖，然后进入磷酸戊糖途径(pentose>

但是，利用天然微生物生产乙醇所面临的相应困境是，一方面，在天然微生物中，能高效产醇的微生物(例如酿酒酵母(Saccharomyce cerevisise))通常只能利用葡萄糖等C6糖来生产乙醇，并不能利用木糖等C5糖作为碳源；另一方面，少数能利用木糖产醇的微生物产醇能力均较低，不具备工业应用的前景，这极大限制了对自然界中丰富易得的木质纤维素资源的有效利用。所以，如何获得能高效利用木糖来生产乙醇的微生物菌株已成为使木质纤维素资源得以充分利用的关键问题之一。

针对这一问题，现有技术的一般思路为向已能高效代谢C6糖来生产乙醇的微生物中引入代谢C5糖的途径，由此获得能够同时利用C5糖和C6糖的共发酵菌株，以达到同时利用C5糖和C6糖来生产乙醇的目的。

在现有的共发酵菌株中，一般是通过向酵母中引入木糖代谢途径来实现C5糖和C6糖的共发酵。例如，通过向酵母中引入新发现的木糖异构酶基因来对酵母进行改造。举例来说，中国专利CN201110042170.2公开了一种编码木糖异构酶突变体的基因，该基因可在酵母中表达，从而使酵母获得木糖代谢能力；PCT国际公开WO2010/074577A1也公开了一种木糖异构酶基因，其赋予真核细胞将木糖直接转化为木酮糖的能力。另外，也可以直接利用现有基因对酿酒酵母进行改造。例如，Zhou H等，Xylose isomerase overexpression along withengineering of the pentose phosphate pathway and evolutionary engineering enablerapid xylose utilization and ethanol production by Saccharomyces cerevisiae，Metab Eng.，2012Nov；14(6)：611-22中描述了使现有的木糖异构酶在酿酒酵母中表达，从而获得了能够直接将木糖代谢为木酮糖的酿酒酵母。

然而，尽管现有技术中已通过向酵母中引入木糖异构酶基因、或者通过在酵母中上调木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因成功实现了共发酵C5糖和C6糖来产生乙醇，但这些重组酵母在木糖代谢能力、效率等方面均有较大提升空间。其中一个关键因素在于，糖类的代谢通常与相关基因的拷贝数线性相关，但是基因拷贝数过多势必又会带来代谢负担。在现有技术中，通常通过增加木糖异构酶基因的拷贝数来增强目标菌株代谢木糖的能力，但是，迄今为止，木糖异构酶基因拷贝数与代谢效果的具体关系仍然不够清晰明了，其中的平衡关系仍然有待进一步发掘。

另外，PPP途径被认为是影响由木糖代谢最终获得乙醇的下游瓶颈。发明人由此设想，如果能够增强PPP途径中的关键基因磷酸核酮糖差向异构酶基因RPE1、磷酸核酮糖异构酶基因RKI1、转醛酶基因TAL1和转酮酶基因TKL1(下文中也可将RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因这四个基因统称为“TTRR基因”)的表达，或许能够提高PPP途径的通量，从而提高相关微生物由木糖代谢最终获得乙醇的能力。

另外，发明人进一步设想，如果能够将外源引入的XI蛋白和XK蛋白定位到细胞膜上，或许能够在时间和空间上进一步加速酵母对木糖的消耗及转化能力，使得木糖得以迅速转化，从而实现木糖的高效转化。

由此，为了使酿酒酵母能高效地利用木糖，发明人优化了关键基因的拷贝数及其表达水平以提高乙醇产量；为了使酿酒酵母能快速地消耗木糖，发明人探索了XI蛋白和XK蛋白的细胞膜定位以提高乙醇产率。通过将上述两方面有机结合，发明人构建了优化的产乙醇工程菌株，实现了C5糖和C6糖的共发酵，期望同时获得高产高效的乙醇生成。

发明内容

本发明的一个目的在于提供能更高效地将木糖转化为乙醇的共发酵C5糖和C6糖的酿酒酵母菌株(下文也可将其称为“共发酵酿酒酵母菌株”或“重组酿酒酵母菌株”)。本发明人发现，通过以工业酿酒酵母菌株为出发菌株，向其中整合特定拷贝比例的XI基因和XK基因以及RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因(即，TTRR基因)来引入XI木糖代谢途径、使XK过表达并增强PPP途径，并将XI蛋白和XK蛋白定位于酿酒酵母细胞膜上，能够获得将木糖高效转化为乙醇的共发酵C5糖和C6糖的重组酿酒酵母菌株。另外，本发明人还发现，若进一步将上述重组酿酒酵母菌株中的醛糖还原酶基因GRE3以及任选的硝基苯磷酸酶基因PHO13敲除，能够带来更高效的乙醇转化。

由此，本发明提供了一种生产乙醇的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，相比于野生型酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母菌株中以2:2:1:1:1:1的拷贝数比例引入了外源XI基因、XK基因以及RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因；利用膜定位基团或蛋白将由所述外源XI基因和XK基因表达得到的XI蛋白和XK蛋白定位于所述重组酿酒酵母菌株的细胞膜上；以及，引入所述重组酿酒酵母菌株中的所述外源XI基因的拷贝数为2、4或6。

本发明的另一目的在于提供本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株的构建方法。由此，本发明提供了一种生产乙醇的重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，以2:2:1:1:1:1的拷贝数比例向野生型酿酒酵母菌株中引入外源XI基因、XK基因以及RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因；利用膜定位基团或蛋白将由所述外源XI基因和XK基因表达得到的XI蛋白和XK蛋白定位于所述重组酿酒酵母菌株的细胞膜上；以及，引入所述重组酿酒酵母菌株中的所述外源XI基因的拷贝数为2、4或6，从而得到所述重组酿酒酵母菌株。

本发明的再一目的在于提供利用本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株生产乙醇的方法。

在本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株中，通过以特定拷贝数比例引入木糖代谢途径中的XI基因和下游的XK基因以及PPP途径中的TTRR基因，并通过膜定位基团将由XI基因和XK基因表达得到的XI蛋白和XK蛋白定位于细胞膜上，使得该重组酿酒酵母菌株能够实现同时利用C5糖和C6糖的共发酵，从而获得了高效的木糖代谢；XI蛋白和XK蛋白的膜定位则在时间和空间上有利于酵母利用混合糖的初期过程中木糖的快速高效消耗；此外，发酵过程中磷酸戊糖途径中的关键基因RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因的协同优化表达还有利于使混合糖代谢在整个乙醇合成途径中的贡献最大化。

本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株能够在50小时内将酶解液中高达100-110g/L的葡萄糖和30-40g/L的木糖消耗完毕，葡萄糖-木糖混合糖转化为乙醇的总糖转化率高达83％，乙醇的终浓度可高达57g/L。

附图说明

图1为表示天然微生物中两种不同的木糖代谢途径的图。

图2为质粒pBS-XI-XK-1的结构示意图，其中，XI片段为XI-6m突变基因。

图3为质粒pBS-XI-XK-2的结构示意图，其中，XI片段为XI-6m突变基因。

图4为质粒5-FINAL的结构示意图。

图5为线性DNA片段pBS-141115-XI-XK-TTRR的结构示意图。

图6为线性DNA片段pBS-141116-XI-XK-TTRR1的结构示意图。

具体实施方式

下文描述了本发明的示例性实施方式，本领域技术人员应该明了的是，以下实施方式并不限制本发明的特定实施方式，应理解为包括本发明的精神和范围内的所有变体、等同物或替代物。多种调整和其它实施方式在本领域普通技术人员的能力范围内，并预期落入本发明的范围内。

除非另有说明，下文所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，例如可利用下列著作中描述的标准程序来实施：Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(1995)；以及CurrentProtocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等著，John Wiley and Sons，Inc.)。

除非另有说明，下文所使用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

在第一方面，本发明提供了一种生产乙醇的重组酿酒酵母菌株。

在本发明的重组酿酒酵母菌株中，所引入的XI基因可为来自任何物种的、能够在酿酒酵母中进行木糖代谢以将木糖转化为木酮糖的XI基因。例如，所引入的XI基因可选自于来自梨囊鞭菌属、根囊鞭菌属或Clostridiumphytofermentans的XI基因。优选地，所引入的XI基因为梨囊鞭菌属xylA基因(GenBank ID.JN900249.1，GI：381284042)的XI-6m突变基因，其中，由XI-6m突变基因编码的XI-6m突变体为具有E15D、E114G、E129D、T142S、A177T和V433I突变的xylA的突变体，所述XI-6m突变体的氨基酸序列为由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(参见Lee SM，Jellison T，Alper HS.Directedevolution of xylose isomerase for improved xylose catabolism and fermentation inthe yeast Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol.，2012Aug；78(16)：5708-16，以引用的方式将其内容整体并入本文)。编码XI-6m的核苷酸序列可为能够编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列，优选密码子经过优化的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)。

在本发明的重组酿酒酵母菌株中，所引入的XK基因可为来自任何物种的、能够在酿酒酵母中改善木糖代谢的XK基因。为了更好地在酿酒酵母中表达，优选引入酿酒酵母本身的XK基因(基因号398366094)。例如，所引入的XK基因的核苷酸序列可由SEQ ID NO：3表示。

在本发明的重组酿酒酵母菌株中，优选地，所引入的TTRR基因可来源于酿酒酵母或毕赤酵母(Pichia pastoris)，例如，来源于酿酒酵母的RPE1基因(基因号296145901)、RKI1基因(基因号296148095)、TAL1基因(基因号296146878)和TKL1基因(基因号296148717)。其中，来自酿酒酵母本身的上述四个基因的核苷酸序列例如可分别由SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：7表示。

在本发明的重组酿酒酵母菌株中，可采用本领域已知的方法将由外源XI基因和XK基因表达得到的XI蛋白和XK蛋白定位至细胞膜。例如，可通过融合表达膜定位蛋白来将XI蛋白和XK蛋白定位至重组酿酒酵母的细胞膜。在本发明的一个实施方式中，可通过融合表达转运蛋白XUT3来进行XI蛋白和XK蛋白的细胞膜定位。

此外，现有技术中尚未有利用CAAX四肽基序(下文也将其称为法尼基膜定位基团CAAX)的膜定位作用将感兴趣的目标蛋白定位于酵母细胞膜上的相关研究。CAAX四肽基序是存在于大多数Ras和Rho蛋白(均为小分子GTP酶Ras超家族成员)序列C末端的一个十分保守的序列，其中C代表半胱氨酸，A代表疏水性氨基酸，X代表任意氨基酸。在法尼基转移酶(farnesyltransferase，Ftase)的催化作用下，胆固醇合成途径中的中间体法尼基焦磷酸酯(farnesyl pyrophosphate，FPP)上的一个15碳的类异戊二烯基团，即法尼基(farnesyl)被转移到该CAAX四肽基序中的半胱氨酸残基上。此类异戊二烯修饰(法尼基化修饰)使得Ras超家族的成员能够最终定位于细胞膜上。

因此，在本发明中，也可使用法尼基膜定位基团CAAX将XI蛋白和XK蛋白定位于本发明的重组酿酒酵母菌株的细胞膜上。其中，在本发明的优选实施方式中，法尼基膜定位基团CAAX的序列可为由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列，即Cys-Ala-Ala-Ser。编码该法尼基膜定位基团Cys-Ala-Ala-Ser的核苷酸序列可为tgtgccgcctct(SEQ ID NO：9)。

在本发明的重组酿酒酵母菌株中，所引入的XI基因和XK基因可与相同或不同的膜定位基团融合表达，例如，所引入的XI基因和XK基因可分别与编码转运蛋白XUT3的核苷酸序列和编码法尼基膜定位基团CAAX的核苷酸序列中的一者或两者融合表达。

在本发明的重组酿酒酵母菌株中，所引入的XI基因和XK基因的拷贝数相同(即，二者拷贝数之比为1:1)；所引入的RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因的拷贝数相同(即，四者拷贝数之比为1:1:1:1)；同时，所引入的XI基因和XK基因的拷贝数为所引入的RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因的拷贝数的2倍(即，六者拷贝数之比为2:2:1:1:1:1)。其中，所引入的XI基因和XK基因的拷贝数可为2、4和6。本发明最优选引入4拷贝的外源XI基因和XK基因。

在本发明的重组酿酒酵母菌株的一些实施方式中，本发明的重组酿酒酵母菌株中引入了2拷贝的XI基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因(即，1拷贝的RPE1基因、1拷贝的RKI1基因、1拷贝的TAL1基因和1拷贝的TKL1基因)。在本发明的重组酿酒酵母菌株的优选实施方式中，本发明的重组酿酒酵母菌株中引入了2拷贝的XI-6m基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因。

在本发明的重组酿酒酵母菌株进一步优选的实施方式中，本发明的重组酿酒酵母菌株中引入了4拷贝的XI-6m基因和4拷贝的XK基因以及2拷贝的TTRR基因。在所引入的2拷贝的TTRR基因中，对于编码PPP途径的关键限速酶TAL1的TAL1基因，一拷贝可来自酿酒酵母本身，另一拷贝可来自毕赤酵母(由SEQ ID NO：10表示)。

在本发明的重组酿酒酵母菌株的另一些实施方式中，还可将其中的GRE3基因以及任选的PHO13基因敲除。通过敲除GRE3基因以及任选地敲除PHO13基因，同步协同提高XI基因的表达水平，能够加速木糖的消耗效率，从而有利于XI基因代谢途径更好地利用木糖。因此，优选地，在本发明的引入了外源XI基因和XK基因以及TTRR基因的重组酿酒酵母菌株中，可进一步将GRE3基因(基因号296145482)敲除，并任选地将PHO13基因(基因号296143138)敲除。

为了方便操作，可将所引入的XI基因和XK基因以及TTRR基因整合入GRE3基因和任选的PHO13基因的启动子区域、开放读码框区域的部分或全长序列中，或用所引入的XI基因和XK基因以及TTRR基因替换GRE3基因和任选的PHO13基因的启动子区域、开放读码框区域的部分或全长序列，从而使GRE3基因和任选的PHO13基因失活或缺失。优选地，用所引入的XI基因和XK基因以及TTRR基因替换GRE3基因和任选的PHO13基因的开放读码框区域的部分或全长序列，以使GRE3基因和任选的PHO13基因失活或缺失。

在本发明的重组酿酒酵母菌株的优选实施方式中，可用2拷贝的XI基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因替换GRE3基因的全长序列，其中，XI基因和XK基因分别连接有编码转运蛋白XUT3和/或法尼基膜定位基团CAAX的DNA片段。

在本发明的重组酿酒酵母菌株的最优选实施方式中，可用2拷贝的XI-6m基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因替换GRE3基因的全长序列；同时，用另外的2拷贝的XI-6m基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因替代PHO13基因的全长序列，其中，XI基因和XK基因分别连接有编码转运蛋白XUT3和/或法尼基膜定位基团CAAX的DNA片段。

在第二方面，本发明提供了上述生产乙醇的重组酿酒酵母菌株的构建方法。在本发明的实施方式中，所述构建方法可包括以下步骤：

质粒的构建

本发明中所用的目标基因可不受限制地通过以下方式获得：根据已在本领域公知的数据库上公布的相关的目标基因序列进行人工合成；或者利用PCR的方法从相应来源(例如，菌株)的基因组中扩增目标基因。

1.含有XI基因表达盒和/或XK基因表达盒的质粒的构建

1.1带有编码膜定位蛋白/基团的核苷酸片段的XI基因和/或XI-6m基因以及XK基因的获得

参考GenBank数据库中公开的xylA基因的序列(GenBank ID:JN900249.1，GI:381284042)，通过合成获得xylA基因。

参考Lee SM，Jellison T，Alper HS.Directed evolution of xylose isomerasefor improved xylose catabolism and fermentation in the yeast Saccharomycescerevisiae.Appl Environ Microbiol.2012Aug，78(16):5708-16.，通过合成获得XI-6m基因。

以酿酒酵母基因组DNA为模板，根据GenBank数据库中已知的XK基因(基因号398366094)序列设计引物，通过PCR方法扩增上述基因得到相应的基因片段。或者，通过合成得到酿酒酵母的XK基因。

编码XUT3的核苷酸序列通过扩增Scheffersomyces stipitis CBS 6054的基因组DNA得到。编码法尼基膜定位基团CAAX的核苷酸序列通过合成得到。可通过本领域已知的方法在XI基因和/或XI-6m基因以及XK基因的5’或3’端引入编码膜定位蛋白或法尼基膜定位基团CAAX的核苷酸序列。优选地，在XI蛋白和XK蛋白的N末端引入膜定位蛋白/基团。

1.2含有XI基因表达盒和/或XK基因表达盒的质粒的构建

在本发明中，可将XI基因和XK基因构建在同一质粒中，也可将这两种基因各自分别构建在两个质粒中。为了简化操作步骤，在本发明中优选将XI基因和XK基因构建在同一质粒中。

在一个实施方式中，将第一启动子、带有编码膜定位蛋白/基团的DNA序列的XI基因、以及第一终止子依次可操作地连接成XI基因表达盒；同时将第二启动子、带有编码膜定位蛋白/基团的DNA序列的的XK基因、以及第二终止子依次可操作地连接成XK基因表达盒；然后，将所得到的XI基因表达盒和XK基因表达盒串联克隆到克隆载体中，从而形成同时含有XI基因和XK基因的质粒。

克隆载体为可商购的克隆载体，也可为具有同等功能的任何克隆载体。在本发明中优选克隆载体pbluescript。

启动子可为在酿酒酵母中能够使用的任何启动子。优选地，在本发明中使用的启动子选自于由以下启动子所组成的组：pPGK、pADH1、pTDH3、pTEF2、pPDC1以及pTPI1。第一启动子和第二启动子可相同或不同，优选二者为不同的启动子。终止子可为在酿酒酵母中能够使用的任何终止子。优选地，在本发明中使用的终止子选自于由以下终止子所组成的组：PGK1t、ADH1t以及FBA1t。同样，第一终止子和第二终止子可相同或不同，优选二者为不同的终止子。

分别含有XI基因表达盒和XK基因表达盒的质粒也可通过上述相同的方法获得。该操作在本领域技术人员的能力范围内。

为了便于对XI蛋白和XK蛋白的定位进行检测，还可融合表达其它蛋白，例如，GFP。

2.串联含有TTRR基因的质粒(下文称为“5-FINAL质粒”)的构建

2.1RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因的获得

以酿酒酵母或毕赤酵母基因组DNA为模板，根据GenBank数据库中已知的RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因的序列设计引物，通过PCR方法扩增上述基因得到相应的基因片段。

或者，参考Xiong M，Chen G，Barford J.，Alteration of xylose reductasecoenzyme preference to improve ethanol production bySaccharomyces cerevisiaefrom high xylose concentrations.Bioresour Technol.，2011，102(19)：9206-15(以引用的方式将其内容整体并入本文)中所公开的引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到RPE1、RKI1、TAL1和TKL1基因片段。

2.25-FINAL质粒的构建

可通过本领域已知的连接方式将上述四个基因串联连接进克隆载体中。

在本发明中，优选参考Xiong M，Chen G，Barford J.，Alteration of xylosereductase coenzyme preference to improve ethanol production bySaccharomycescerevisiae from high xylose concentrations，Bioresour Technol.，2011，102(19)：9206-15中公开的方法来构建5-FINAL质粒。

3.用于同源整合和/或基因敲除的同源臂的获得

以酿酒酵母基因组DNA为模板，扩增整合位点上下游的序列作为同源臂。优选地，整合位点为GRE3基因和PHO13基因及其上下游位点。

3.1用于敲除GRE3基因的上下游同源臂的获得

以酿酒酵母基因组DNA为模板，根据GRE3基因(基因号296145482)和/或该基因的上下游序列设计引物，扩增得到GRE3-up和GRE3-down两个片段，同时扩增编码筛选标记1的基因序列，其中，GRE3-down片段为处于GRE3-up片段下游的片段；将GRE3-up片段和编码筛选标记1的基因序列拼接成用于敲除GRE3基因的上游同源臂，GRE3-down片段作为下游同源臂。

3.2用于敲除PHO13基因的上下游同源臂的获得

以酿酒酵母基因组DNA为模板，根据PHO13基因(基因号296143138)和/或该基因的上下游序列设计引物，扩增得到PHO13-up和PHO13-down两个片段，同时扩增编码筛选标记2的基因序列，其中，PHO13-down片段为处于PHO13-up片段下游的序列，筛选标记2与筛选标记1不相同；将PHO13-up片段和编码筛选标记2的基因序列拼接成用于敲除PHO13基因的上游同源臂，PHO13-down片段作为下游同源臂。

GRE3-up片段可处于GRE3基因的启动子部位和/或基因编码框部位。GRE3-up片段和GRE3-down片段在GRE3基因或启动子上可相邻或间隔，例如，GRE3-up片段和GRE3-down片段可间隔GRE3基因序列的10％以上，例如，25％以上、50％以上、75％以上、90％以上、95％以上，或间隔GRE3基因序列全长。同样，PHO13-up片段可处于PHO13基因的启动子部位和/或基因编码框部位。PHO13-up片段和PHO13-down片段在PHO13基因或启动子上可相邻或间隔，例如，PHO13-up片段和PHO13-down片段可间隔PHO13基因序列的10％以上，例如，25％以上、50％以上、75％以上、90％以上、95％以上，或间隔PHO13基因序列全长。

本发明所用的酿酒酵母基因敲除筛选标记可为本领域技术人员已知的任何筛选标记，只要敲除不同基因所使用的筛选标记彼此不同即可。在本发明中，优选使用抗性筛选标记来完成对GRE3基因和PHO13基因的敲除，所述抗性筛选标记例如为G418或HYG。

4.用于转化酿酒酵母的片段的构建

从上述步骤所构建的质粒中，扩增获得上述步骤1中的XI基因表达盒和XK基因表达盒、以及步骤2中的TTRR串联片段，然后，将这些片段与步骤3中得到的同源臂按照例如图5和/或图6的顺序进行连接得到XI-XK-TTRR片段，其中，所述XI-XK-TTRR片段中具有2拷贝的XI基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因。

在本发明的构建方法的实施方式中，DNA片段的拼接可采用本领域技术人员已知的各种拼接手段，例如，限制性内切酶方式、Overlap连接方式、GoldenGate Assembly(GGA)快速克隆技术等。所用的克隆载体也可为本领域常用的其它克隆载体。

重组菌株的制备

采用本领域已知的方法将XI-XK-TTRR片段通过同源重组整合进酿酒酵母的基因组中。其中，转化酿酒酵母的方法可使用本领域技术人员已知的各种转化方法，例如电转化法、醋酸锂化学转化法等。

在本发明的一个实施方式中，使用醋酸锂化学转化方法将图5中所示的XI-XK-TTRR片段转化进酿酒酵母出发菌株(野生型酿酒酵母菌株，没有经过基因改造的酿酒酵母工业菌株)，得到重组酿酒酵母菌株，命名为中粮-1工程菌株。在该重组酿酒酵母菌株中引入了2拷贝的XI基因和2拷贝的XK基因以及1拷贝的TTRR基因。采用该重组酿酒酵母菌株进行发酵，总糖(包括葡萄糖和木糖)到乙醇的转化率为81％。

在本发明的一个优选实施方式中，以相同的方式将图6中所示的XI-XK-TTRR片段整合进中粮-1工程菌株中，从而得到中粮-2工程菌株。该重组酿酒酵母菌株中引入了4拷贝的XI基因和4拷贝的XK基因以及2拷贝的TTRR基因。采用该重组酿酒酵母菌株进行发酵，总糖到乙醇的转化率进一步提升为83％。

在第三方面，本发明提供了利用本发明的生产乙醇的重组酿酒酵母菌株生产乙醇的方法。本发明的重组酿酒酵母菌株可用于本领域已知的采用酿酒酵母生产乙醇的方法。

实施例

以下实施例将对本发明作进一步的说明，但并不用于限制本发明。

在以下实施例和测试实施例中，克隆载体pbluescript购自Clotech公司。双酶切试剂购自New England Biolabs(NEB)公司或天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒；酵母基因组DNA提取试剂盒以及细菌质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，测序和全长基因片段的合成均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

实施例1重组酿酒酵母菌株中粮-1工程菌株的制备

出发菌株为来自安琪酵母公司的酿酒酵母工业菌株(酒用酵母)。

1.1质粒pBS-XI-XK-1的构建

将第一启动子pPGK1、3’端(终止密码子一端)带有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列(SEQ ID NO：9)的XI-6m基因、以及第一终止子PGK1t构建成XI-6m基因表达盒pPGK1-XI-6m-CAAX-PGK1t；同时将第二启动子pADH1、3’端带有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列(SEQ ID NO：9)的XK基因、以及第二终止子ADH1t构建成XK基因表达盒pADH1-XK-CAAX-ADH1t，将上述XI-6m基因表达盒和XK基因表达盒依次拼接到克隆载体pbluescript中，形成含有XI-6m基因表达盒和XK基因表达盒的质粒pBS-XI-XK-1(参见图2)。

质粒pBS-XI-XK-1的构建使用Golden Gate Assembly(GGA)方法进行。以下用于获得目的基因的引物的5’端均含有用于GGA的序列片段，进而所获得的目的基因片段的5’端和3’端含有用于GGA的序列片段，其中，所述用于GGA的序列包含保护碱基、Bsal限制性内切酶识别位点(GGTCTCA)、以及酶切位点的粘性末端(起始密码子端ATCG和AGGT；终止密码子端GAAT和GATG)。

用于构建质粒pBS-XI-XK-1的目的基因的获得

pbluescript载体骨架：通过引物pBS-R1(SEQ ID NO：11)和pBS-F1(SEQID NO：24)扩增克隆载体pbluescript而获得。

启动子pPGK1和pADH1以及终止子PGK1t和ADH1t片段：根据本领域公知的数据库中的序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成上述启动子和终止子的序列片段，然后分别通过引物TEFt-PGK1-F1(SEQ ID NO：12)、PGK1-R1(SEQ ID NO：13)、PGK1t-F1(SEQ ID NO：16)、PGK1t-R1(SEQ IDNO：17)、ADH1-F1(SEQ ID NO：18)、ADH1-R1(SEQ ID NO：19)、ADH1t-F1(SEQ ID NO：22)、以及TDH3-ADH1t-R1(SEQ ID NO：23)扩增而获得。

3’端带有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列(SEQ ID NO：9)的XI-6m基因：参考Lee SM，Jellison T，Alper HS.Directed evolution of xyloseisomerase for improved xylose catabolism and fermentation in the yeastSaccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol.2012Aug，78(16):5708-16.中公开的序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成获得XI-6m基因片段；根据由SEQ ID NO：9表示的法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列以及XI-6m基因序列，设计引物XI-F1(SEQ ID NO：14)和XI-R1(SEQ ID NO：15)，并用该引物扩增全合成的XI-6m基因片段，从而获得相应基因片段，其中，引物XI-R1具有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列。

3’端带有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列(SEQ ID NO：9)的XK基因：以出发菌株的基因组DNA为模板，通过引物XK-F1(SEQ ID NO：20)和XK-R1(SEQ ID NO：21)扩增获得，其中，引物XK-R1具有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列。

质粒pBS-XI-XK-1构建中具体使用的引物信息在表1中列出。

表1质粒pBS-XI-XK-1构建中使用的引物

将上述所获得的目的片段进行纯化，然后用琼脂糖凝胶电泳进行定量并保存，以用于进行GGA。GGA方法的反应体系见表2。

表2GGA方法的反应体系

DNA元件体积(μl)pbluescript载体骨架1μl(200ng)pPGK1启动子0.5μl带有CAAX的XI-6m基因1μlPGK1t终止子0.5μlpADH1启动子1μlXK基因0.5μlADH1t终止子0.5μl10×NEB T4buffer(NEB)1.5μl100×BSA*(NEB)0.15μlBsaI(NEB)1μlNEB T4Ligase(NEB)1μlddH₂O6.35μl(补足至15μl)总计15μl

GGA方法的反应条件如下：37℃3min，16℃4min，40个循环；50℃3min；80℃灭活10min。然后，将反应产物直接转化DH5α大肠杆菌并涂板，37℃倒置培养12-16h，挑取单菌落进行PCR验证并测序，从阳性菌株中提取获得质粒pBS-XI-XK-1。

1.2质粒pBS-XI-XK-2的构建

将第一启动子pTDH3、编码转运蛋白XUT3-XI-6m突变体(XI基因含有6个突变位点)蛋白融合蛋白的DNA序列、以及第一终止子PGK1t构建成XI-6m基因表达盒pTDH3-XUT3-XI-6m-PGK1t；同时将第二启动子pTEF2、编码绿色荧光蛋白GFP与3’端带有法尼基膜定位基团CAAX(SEQ ID NO：8)的XK蛋白的融合蛋白的DNA序列、以及第二终止子FBA1t构建成XK基因表达盒pTEF2-GFP-XK-CAAX-FBA1t，然后，将上述XI-6m基因表达盒和XK基因表达盒依次拼接到克隆载体pbluescript中，形成含有XI-6m基因表达盒和XK基因表达盒的质粒pBS-XI-XK-2(参见图3)。

同样，质粒pBS-XI-XK-2也使用GGA方法进行构建。

用于构建质粒pBS-XI-XK-2的目的基因的获得

pbluescript载体骨架：通过引物pBS-R2(SEQ ID NO：33)和pBS-F2(SEQID NO：50)扩增克隆载体pbluescript而获得。

启动子pTDH3和pTEF2以及终止子PGK1t和FBA1t片段：根据本领域公知的数据库中的序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成上述启动子和终止子的序列片段，然后分别通过引物ADH1t-TDH3-F(SEQ ID NO：34)、TDH3-R(SEQ ID NO：35)、PGK1t-F2(SEQ ID NO：40)、PGK1t-R2(SEQ IDNO：41)、TEF2-F(SEQ ID NO：42)、TEF2-R(SEQ ID NO：43)、FBA1t-F(SEQ ID NO：48)以及PGK1-FBA1t-R1(SEQ ID NO：49)扩增而获得。

编码XUT3-XI-6m突变体融合蛋白的DNA序列：参考Lee SM，Jellison T，Alper HS.Directed evolution of xylose isomerase for improved xylose catabolismand fermentation in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol.2012Aug，78(16):5708-16.中公开的序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成获得XI-6m基因，并用引物XUT3-XI-F(SEQ ID NO：38)和XI-R(SEQID NO：39)进行扩增全，从而获得XI-6m基因片段；其中，引物XUT3-XI-F具有与XUT3基因互补的序列；以Scheffersomyces stipitis CBS 6054的基因组DNA为模板，通过引物XUT3-F(SEQ ID NO：36)和XI-XUT3-R(SEQ ID NO：37)扩增获得XUT3基因(SEQ ID NO：59)片段，其中，引物XI-XUT3-R具有与上述扩增得到的XI-6m基因互补的序列；将上述获得的XI-6m基因片段和XUT3基因片段，通过重叠PCR进行连接，由此获得了编码XUT3-XI-6m突变体融合蛋白的DNA序列。

编码绿色荧光蛋白GFP与3’端带有法尼基膜定位基团CAAX(SEQ IDNO：8)的XK蛋白的融合蛋白的DNA序列：根据本领域公知的数据库中的GFP蛋白的编码序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，并用GFP-F(SEQ ID NO：44)和XK-GFP-R(SEQ ID NO：45)，其中，引物XK-GFP-R中具有XK基因的互补序列以用于进行重叠PCR；以出发菌株的基因组DNA为模板，通过引物GFP-XK-F(SEQ ID NO：46)和XK-R2(SEQ ID NO：47)扩增获得，其中，引物GFP-XK-F具有与上述获得的GFP基因互补的序列，以及引物XK-R2具有编码法尼基膜定位基团CAAX的DNA序列。

质粒pBS-XI-XK-2的构建中具体使用的引物在表3中列出。GGA方法的条件与质粒pBS-XI-XK-1的构建中所使用的条件相同。

表3质粒pBS-XI-XK-2构建中使用的引物

1.3质粒5-FINAL-1的构建

根据Xiong M，Chen G，Barford J.，Alteration of xylose reductase coenzymepreference to improve ethanol production bySaccharomyces cerevisiae from highxylose concentrations，Bioresour Technol.，2011，102(19)：9206-15中公开的方法，构建得到5-FINAL-1质粒(参见图4)。

1.4用于敲除GRE3基因的上下游同源臂的获得

用于敲除GRE3基因的上游同源臂：根据HYG抗性基因序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成该基因，然后，用引物GRE3up-pTEF(HYG)-F(SEQID NO：29)和TEFt(HYG)-pgk1-R(SEQ ID NO：30)对该HYG抗性基因进行扩增，其中，引物GRE3up-pTEF(HYG)-F具有与下述GRE3-up片段互补的序列，而引物TEFt(HYG)-pgk1-R具有与启动子PGK1互补的序列；以出发菌株基因组DNA为模板，用引物GRE3-up-F(SEQ ID NO：27)和pTEF-GRE3-up-R(SEQID NO：28)，扩增得到GRE3基因编码序列上游的GRE3-up片段，其中，引物RPE1-GRE3down-F具有与上述扩增的HYG抗性基因片段互补的序列；然后，使用引物GRE3-up-F和TEFt(HYG)-pgk1-R，通过重叠PCR将HYG抗性基因与GRE3-up片段连接，得到用于敲除GRE3基因的上游同源臂。

用于敲除GRE3基因的下游同源臂：以出发菌株基因组DNA为模板，用引物RPE1-GRE3down-F(SEQ ID NO：31)和GRE3-down-R(SEQ ID NO：32)，扩增得到GRE3基因编码序列下游的GRE3-down片段，作为用于敲除GRE3基因的下游同源臂，其中，引物RPE1-GRE3down-F具有与RPE1基因的3’末端互补的序列。

该步骤中所用的引物见表4。

表4用于敲除GRE3基因的上下游同源臂的获得中使用的引物

其中，获得用于敲除GRE3基因的上游同源臂和下游同源臂所采用的PCR体系列于表5中。

表5用于敲除GRE3基因的上下游同源臂的获得中的PCR扩增体系

成分体积ddH₂O14.7μl10×buffer2μldNTP1.6μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlTop taq(全式金)不加A0.2μl酿酒酵母基因组0.5μl(10ng)总计20μl

按上述体系等比扩大到200μl，分4管每管50μl扩增，反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃再延伸5min。

生成用于敲除GRE3基因的上游同源臂上游的重叠PCR的反应体系如下：

上述重叠PCR的反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃再延伸10min。

1.5XI-XK-TTRR-1片段的获得

XI-XK片段的获得：使用引物TEFt-PGK1-F1(SEQ ID NO：12)和TDH3-ADH1t-R1(SEQ ID NO：23)从步骤1.1构建的质粒pBS-XI-XK-1中扩增得到XI-XK-1片段；同时，使用引物ADH1t-TDH3-F(SEQ ID NO：34)和PGK1-FBA1t-R1(SEQ ID NO：49)从步骤1.2构建的质粒pBS-XI-XK-2中扩增得到XI-XK-2片段；由于引物TDH3-ADH1t-R1(SEQ ID NO：23)和引物ADH1t-TDH3-F(SEQ ID NO：34)具有相互补的序列，因此所获得的XI-XK-1片段的3’端与XI-XK-2片段的5’端相互补，使用引物TEFt-PGK1-F1(SEQ IDNO：12)和PGK1-FBA1t-R1(SEQ ID NO：49)通过重叠PCR将XI-XK-1片段和XI-XK-2片段连接，从而获得XI-XK片段。

TTRR-1片段的获得：使用引物TTRR-F0(SEQ ID NO：25)和TTRR-R0(SEQ ID NO：26)从步骤1.3构建的5-FINAL-1中扩增得到TTRR-1片段，其中，引物TTRR-F0具有与XI-XK片段的3’末端互补的序列，引物TTRR-R0具有与用于敲除GRE3基因的下游同源臂的5’末端互补的序列。引物TTRR-R0和TTRR-F0的具体信息见表6。

表6从质粒5-FINAL-1中扩增TTRR所使用的引物

引物名称序列(5’-3’)序列编号TTRR-F0ATCAATTAATTTGAATTAACaggcatttgcaagaaSEQ ID NO：25TTRR-R0CATATCGTCGTTGAGTATGttggttgacgcaagcgcSEQ ID NO：26

关于步骤1.4中获得的用于敲除GRE3基因的上游同源臂和用于敲除GRE3基因的下游同源臂以及步骤1.5中获得XI-XK片段和TTRR-1片段，通过本发明实施例1中的引物设计(具体见上述描述)，使得用于敲除GRE3基因的上游同源臂的3’末端与XI-XK片段的5’末端具有相互补的序列、XI-XK片段的3’末端与TTRR-1片段的5’末端具有相互补的序列、TTRR-1片段的3’末端与用于敲除GRE3基因的下游同源臂的5’末端互补的序列。从而，使用相应的引物，将上述四个片段依次连接，然后得到XI-XK-TTRR-1片段。

所获得的XI-XK-TTRR-1片段如图5所示。

1.6用XI-XK-TTRR-1片段转化酿酒酵母

通过醋酸锂转化法将XI-XK-TTRR片段转化进来自安琪酵母公司的酿酒酵母工业菌株中。具体包括如下步骤：

1.挑取来自安琪酵母公司的酿酒酵母工业菌株单菌落，在常规酿酒酵母培养基中振荡培养12h；2.用分光光度计测定菌液的OD₆₀₀值；3.以初始OD₆₀₀值为0.2将菌液转接到50ml的新鲜YPAD培养基(Yeast>600值达到0.8-0.9；5.100℃煮单体ssDNA；6.3000g离心5min收集菌体，并用25ml>2O洗涤两次；7.在无菌1.5ml离心管中用1ml>2O将酵母重悬；8.13000rpm离心30s收集菌体；9.用1ml水将酵母进行重悬，并以每管100μl菌液进行分装以用于转化，将分装的菌液在离心机上离心20s并弃上清，然后向其中加入如下转化体系(见表7)。

表7：醋酸锂转化体系配比

成分体积PEG3350(50％(w/v)，过滤除菌))240μlLiAc 1.0M(过滤除菌)36μlssDNA(2.0mg/ml)50μl目的DNA片段和ddH₂O34μl总计360μl

将混合好的转化体系与菌体混合均匀，在30℃培养箱中保温20min；42℃热击40min，然后涂布在含有潮霉素(HYG)的平板上，倒置放于30℃培养箱中培养3天，待转化子长出，挑选单克隆并提取基因组DNA进行测序验证，从而获得中粮-1工程菌株。

实施例2重组酵母菌株中粮-2工程菌株的制备

2.1质粒5-FINAL-2的构建

根据Xiong M，Chen G，Barford J.，Alteration of xylose reductase coenzymepreference to improve ethanol production bySaccharomyces cerevisiae from highxylose concentrations，Bioresour Technol.，2011，102(19)：9206-15中公开的方法，构建得到质粒5-FINAL-2。

2.2用于敲除PHO13基因的上下游同源臂的获得

用于敲除PHO13基因的上游同源臂：根据G418抗性基因序列由北京擎科新业生物技术有限公司全合该基因，然后，用引物PHO13up-G418-F(SEQ IDNO：54)和G418-pgk1-R(SEQ ID NO：55)对该G418抗性基因进行扩增，其中，引物PHO13up-G418-F具有与下述PHO13-up片段互补的序列，而引物G418-pgk1-R具有与启动子PGK1互补的序列；以出发菌株基因组DNA为模板，用引物PHO13-up-F(SEQ ID NO：52)和G418-PHO13-R(SEQ ID NO：53)扩增得到GRE3基因编码序列上游的GRE3-up片段，其中，引物G418-PHO13-R具有与上述扩增的G418抗性基因片段互补的序列；然后，使用引物PHO13-up-F和G418-pgk1-R，通过重叠PCR将G418抗性基因与PHO13-up片段连接，得到用于敲除PHO13基因的上游同源臂。

用于敲除PHO13基因的下游同源臂：以出发菌株基因组DNA为模板，用引物RPE1-PHO13down-F(SEQ ID NO：57)和PHO13-down-R(SEQ ID NO：58)，扩增得到PHO13基因编码序列下游的PHO13-down片段，作为用于敲除PHO13基因的下游同源臂，其中，引物RPE1-PHO13down-F具有与RPE1基因的3’末端互补的序列。

该步骤中所用的引物见表8。

表8用于敲除PHO13基因的上下游同源臂的获得中使用的引物

引物名称序列(5’-3’)序列编号PHO13-up-FGGACAATTTATTCATGGCATSEQ ID NO：52G418-PHO13-RttcgatactgcatgcTTTCCCGAGTTGTATSEQ ID NO：53PHO13up-G418-FATACAACTCGGGAAAgcatgcagtatcgaaSEQ ID NO：54G418-pgk1-RttcttgcaaatgcctgtttagcttgcctcgSEQ ID NO：55G418-PGK1-F2cgaggcaagctaaacaggcatttgcaagaaSEQ ID NO：56RPE1-PHO13down-FgcttgcgtcaaccaaAGGAGCAATGCAAAASEQ ID NO：57PHO13-down-RTAAATCGATTATTAATGGAASEQ ID NO：58

用于敲除GRE3基因的上游同源臂和下游同源臂所采用的PCR体系和条件与实施例1中的步骤1.4相同。

2.3XI-XK-TTRR-2片段的获得以及对中粮-工程菌的转化

以与实施例1中的步骤1.5类似的方式，获得XI-XK-TTRR-2片段(如图6所示)。

XI-XK片段的制备与实施例1中相同。

TTRR-2片段使用表9中列出的引物获得，其中，引物TTRR-R1(SEQ IDNO：51)具有与用于敲除PHO13基因的下游同源臂的5’末端互补的序列。

表9质粒5-FINAL-2构建中使用的引物

引物名称序列(5’-3’)序列编号TTRR-F0ATCAATTAATTTGAATTAACaggcatttgcaagaaSEQ ID NO：25TTRR-R1TTTTGCATTGCTCCTttggttgacgcaagcSEQ ID NO：51

2.4用XI-XK-TTRR-2片段转化中粮-1工程菌

采用与实施例1步骤1.6中相同的方法，将XI-XK-TTRR-2片段转化至实施例1中获得的中粮-1工程菌株中，然后通过在含有G418的平板上进行筛选，得到中粮-2工程菌株。

测试实施例1含纤维素原料酶解液的制备及检测

本测试实施例1引用专利申请CN201410548925.X中所述的方法进行含纤维素原料酶解液的制备，具体过程如下：

(1)含纤维素原料的前处理

将1333千克没有杂质的玉米秸秆(含水量10重量％)切成不超过1.2厘米×0.5厘米×1.0厘米的小段，在180℃下维持1.0兆帕的压力5分钟，然后泄压，完成蒸汽爆破。共得到4000千克蒸汽爆破产物(含水量为70重量％)。

所得固体蒸汽爆破产物中纤维素总重量和半纤维素总重量的测定：

取10克上述蒸汽爆破产物在45℃下烘干至恒重5克，称量300.0毫克该干燥后的蒸汽爆破产物，放置于重80克的100毫升干燥三角烧瓶内。向所述三角烧瓶内加入3.00毫升浓度为72重量％的硫酸溶液，搅拌1分钟。然后将三角烧瓶在30℃的水浴中放置60分钟，每隔5分钟搅拌一次以确保均匀水解。水解结束后，用去离子水使硫酸的浓度稀释到4重量％，然后用布氏漏斗过滤，共得到滤液84毫升。将20毫升滤液转移至干燥的50毫升三角瓶中。使用2.5克碳酸钙调节该滤液的pH值至5.5，静置5小时，收集上层清液。用0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，所得滤液用Biorad Aminex HPX-87P高效液相色谱(HPLC)分析。

HPLC条件：进样量20微升；流动相为0.2微米滤膜过滤并且超声振荡脱气的HPLC超纯水；流速为0.6毫升/分钟；柱温80-85℃；检测器温度80-85℃；检测器为折光率检测器；运行时间为35分钟。以0.1-4.0毫克/毫升浓度范围的D-(+)葡萄糖和0.1-4.0毫克/毫升浓度范围的D-(+)木糖作为标准样品。

HPLC分析显示，蒸汽爆破产物酸水解液中葡萄糖浓度为2.67毫克/毫升，计算可得1克所述蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.224克的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破产物中纤维素重量的1.11倍，即1克所述蒸汽爆破产物中含纤维素0.105克，则4000千克蒸汽爆破产物中共含纤维素420千克。

此外，HPLC分析显示，蒸汽爆破产物酸水解液中木糖浓度为0.667毫克/毫升，计算可得1克所述蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.055克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破产物中半纤维素重量的1.14倍，即1克所述蒸汽爆破产物中含半纤维素0.048克，则4000千克蒸汽爆破产物中共含半纤维素192千克。

(2)酶解

所述酶解分多阶段进行，所述多阶段包括连续进行的主酶解阶段以及主酶解阶段以后的间歇酶解阶段。所述主酶解阶段在主酶解装置中进行，将蒸汽爆破产物通过主酶解装置罐体顶部的含纤维素原料入口连续送入主酶解阶段的主酶解装置中，并调节pH值为5，将纤维素酶和半纤维素酶从罐体顶部的酶入口连续引入罐体中，使得经预混的含纤维素原料与酶的混合物沿罐体的高度方向从上到下依次从被隔板分隔的四个酶解空间经过。主酶解装置中的温度为50℃，所述经预混的含纤维素原料的加入量为300千克/小时，以含纤维素原料中的每克纤维素计，所述纤维素酶的用量为20酶活力单位(酶解阶段总酶用量为8.4×10⁶酶活力单位)，半纤维素酶的加入量为加入纤维素酶总重量的10％。所述主酶解阶段，酶的加入量为酶解过程酶的总用量的80％(主酶解阶段总酶用量为6.72×10⁶酶活力单位)，因此，连续加入主酶解装置中的纤维素酶的加入量为5.04×10⁵酶活力单位/小时。

经过多阶段的连续酶解之后，酶解产物从物料出口被连续从罐体中排出，将主酶解阶段的酶解产物取样(主酶解阶段的酶解时间为3小时)，用布氏漏斗过滤，将20毫升滤液转移至干燥的50毫升三角瓶中，离心收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，按照上述步骤(1)所述的高效液相条件进行HPLC分析，结果显示，在主酶解阶段的酶解产物中，单糖含量为78g/L，其中葡萄糖含量为37g/L，木糖含量为29g/L，阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖总含量为12g/L；以最终降解为葡萄糖含量计，可溶性葡聚糖含量为55g/L；以最终降解为木糖含量计，可溶性木聚糖含量为28g/L；粘度为300cp，平均粒径为40μm。

所述主酶解阶段的酶解产物从物料出口被连续从罐体中排出，分别依次连续送入与其连通的间歇酶解装置的4个并联的酶解罐中进行间歇酶解，并在每个酶解罐中加入纤维素酶，在间歇酶解阶段中，酶的加入量为酶解过程酶的总用量的20％，因此，间歇酶解阶段中纤维素酶的总量为1.68×10⁶酶活力单位(每个间歇酶解装置中纤维素酶的用量为0.42×10⁶酶活力单位)。在上述酶解条件下保温混合66小时进行间歇酶解，按照上文所述方法测得后续阶段的各个酶解罐的酶解终点的酶解产物中葡萄糖为105克/升，葡萄糖总量为384千克，将酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共345千克；测定并计算出酶解产物中的木糖总量为176千克，将酶解得到的木糖重量除以1.14，即蒸汽爆破产物中被酶解的半纤维素的重量共155千克。

表10待用酶解液主要成分含量表

项目重量(kg)葡萄糖384木糖176阿拉伯糖、半乳糖以及甘露糖75

测试实施例2.中粮-1工程菌株和中粮-2工程菌株及野生型菌株的发酵

本测试实施例2采用实施例1和实施例2中获得的重组酿酒酵母菌株中粮-1工程菌株和中粮-2工程菌株以及作为出发菌株的野生型酿酒酵母菌株进行发酵培养，并对各菌株的产乙醇性能进行了测试。

A、种子液培养步骤

配制YEPD培养基，将重组酿酒酵母菌体和野生型酿酒酵母菌体接种至YEPD培养基中，控制温度25℃、pH6.0、通气量0.2L/L/min、转速200rpm，培养12h，至上述菌种浓度为(0.1-0.5)×10⁹个/mL；

YEPD培养基：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH 6.5。

B、扩大培养(扩培)步骤

1)将培养的种子液按照10％(v/v)的接种量接入容积为50L的含有一级扩大培养基的一级扩培罐中，控制温度30℃、pH6.0、转速200rpm、通气量0.5L/L/min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹个/mL；

2)按照10％(v/v)的接种量，将扩培后的一级扩培液接种至500L的含有二级扩大培养基的二级扩培罐中，控制温度30℃、pH6.0、转速40rpm，通气量0.3L/L/min，培养14h至菌种浓度达到(0.2-0.3)×10⁹个/mL。

所述一级扩大培养基和二级扩大培养基均包含用水稀释至30wt％的含纤维素原料酶解液(测试实施例1中制备)、玉米浆(干物质含量40％)15g/L、KH₂PO₄>4)₂HPO₄>

C、发酵产乙醇步骤

取上述扩大培养结束后的扩培液，按照10％(v/v)的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，控制温度25℃、pH5、通气量0.1mL/L/min，间歇通气，通气时间为0.5h，间隔时间为5h，发酵72h或者至糖浓度降低至1-5g/l；获得发酵产物；检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。

所述发酵培养基包含用水稀释至30wt％的含纤维素原料酶解液(测试实施例1中制备)、玉米浆(干物质含量45wt％)7.5g/L、KH₂PO₄>4)₂HPO₄2g/L，发酵开始前调节pH为5.0。

D.菌株的产乙醇性能测试

采用测试实施例1步骤1中所用的HPLC方法测定最终获得的发酵液中的葡萄糖终浓度；木糖终浓度；纤维二糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖终浓度；甘油终浓度。同时，乙醇终浓度采用高效液相色谱方法进行检测，量取发酵后的样品，通过过滤以及稀释，经折算以后获得乙醇的浓度，具体的方法参照美国国家可再生能源实验室报告NREL/TP-510-42623。

随后，计算总糖醇转化率和木糖消耗率。结果如下表11所示。总糖醇转化率是指由葡萄糖和木糖组成的总糖转化为乙醇的转化率，具体算法如下：

总糖醇转化率＝乙醇终浓度/(总糖的初始浓度×51％)

其中，总糖的初始浓度为葡萄糖初始浓度与木糖初始浓度之和；51％是糖醇转化的理论最大值。

表11菌株产乙醇性能测试中的各项参数

从表11可以看出，相比野生型酿酒酵母菌株，本发明的重组酿酒酵母菌株中粮-1工程菌株和中粮-2工程菌株在保留了葡糖糖代谢的能力的情况下，能够高效代谢作为五碳糖的木糖(木糖消耗率分别为77％和93％；野生型酿酒酵母菌株则无木糖代谢能力)，从而大大提高了乙醇产量(相比野生型酿酒酵母菌株分别提高了27％和24％)。另外，还需要注意的是，相比野生型酿酒酵母菌株，本发明的重组酿酒酵母菌株中粮-1工程菌株和中粮-2工程菌株还使得发酵时间大大缩短。

测试实施例3.XI蛋白和XK蛋白的定位

通过对融合表达的GFP蛋白的显微镜检测，证实本发明所引入的外源XI蛋白和XK蛋白在重组酿酒酵母菌株的细胞膜上表达；而在野生型酿酒酵母菌株中未观察到这一结果。对细胞膜定位用显微镜观察验证，用以证实膜定位事件确实已经发生，从而确认细胞膜定位在一定程度上促进了木糖的高效利用及高浓度乙醇的获得。