一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法

摘要

一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法，涉及基因工程技术领域，先构建在fur毒力基因的启动子中插入araC PBAD结构的自杀载体，再依次构建减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008和rSC0009突变株，然后将rSC0009突变株中引入Δasd 突变基因，得基于fur基因的含有ΔmanA，ΔrelA::araC PBADlacI TT，ΔPfur::TT araCPBADfur和ΔasdA突变的猪霍乱沙门氏菌减毒载体rSC0012。本发明作为幼龄动物疫苗载体具有更高的安全性，本发明可在制备递送猪病原的疫苗载体方面应用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌的研究和应用领域。

背景技术

基因工程方法致弱的鼠伤寒沙门氏菌作为载体表达外源基因，广泛用于肿瘤、病毒病、细菌病、寄生虫病等的治疗研究，已取得了良好效果。但是在许多研究报道中的沙门氏菌载体，要么使减毒载体过度减毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性，但是载体菌株却减毒不够，缺乏安全性而不能作为疫苗。因此迫切需要研制这样的一种疫苗载体，既要使疫苗载体足够减毒，保证动物完全的安全，又要使疫苗载体和其携带的外源抗原能够诱导出优秀的保护性抗体，抗击相关病原的感染。

猪霍乱沙门氏菌是猪的重要病原菌，关于以猪霍乱沙门氏菌为载体递送猪的其他病原抗原的研究，在国内外已有少量报道。而用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌毒力基因的表达和缺失的报道却是鲜少。发明人在前期研究过程中发现，用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的crp毒力基因所产生的载体菌可以诱导出对成年Balb/c小鼠较好的免疫原性，但是疫苗株的减毒不够，作为疫苗株的安全性可能存在一定的风险，如中国专利文献CN104498418A。

猪链球菌病是一种重要人畜共患传染病，不仅影响着养猪业健康发展，还严重危害着人类的健康。目前我国的猪用商品化链球菌疫苗还存在着诸多不完善的方面，因此我们选择大多数猪链球菌血清型菌株都有的的Sao（surface antigen one)）作为减毒株的异源抗原，对本研究中构建的可调控的延迟减毒的猪霍乱沙门氏菌疫苗候选株的相关特性和免疫效率进行了评价，以其为猪病的防控提供新的思路。

重组减毒沙门氏菌疫苗可以诱导机体产生显著的粘膜免疫和细胞免疫，因此具备递送外源抗原的载体特性。已有明确的研究显示沙门氏菌载体对其所携带的外源基因有较多有利作用，例如，可以诱导出针对沙门氏菌本身和外源蛋白的细胞和黏膜免疫应答。研究还发现，有很多减毒沙门氏菌载体因为宿主的免疫压力或者自身有限的定植能力，很难达到野生型菌株那样的免疫原性；而一些减毒沙门氏菌虽然获得足够的免疫应答，但是菌株本身减毒不够，不能作为疫苗载体。此外,沙门氏菌载体作为胞内菌诱导的免疫应答主要是以细胞和黏膜免疫为主，对于大多数病原感染所需要的体液免疫应答显得苍白无力。

沙门氏菌crp基因编码腺苷酸环化酶受体蛋白，是细菌在哺乳动物宿主中摄取cAMP的唯一途径；如果使沙门氏菌缺失crp基因，就使其丧失了代谢碳水化合物、氨基酸和小肽能力从而降低其毒力。在前期研究过程中发现（如CN104498418A），用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的crp毒力基因所产生的载体菌可以诱导出对成年BALB/c小鼠较好的细胞和黏膜免疫原性，但是疫苗株的减毒不够，诱导的体液免疫应答偏弱，作为对仔猪疫苗株的安全性可能依然存在一定的风险，需要继续筛选更加减毒的基因，构建安全的猪霍乱沙门菌疫苗载体。而沙门氏菌诱导的以细胞免疫为主的特性，对于需要体液免疫应答的病原仍然是一个缺陷，迫切需要寻找到平衡细胞免疫和体液免疫的技术和方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种安全性较高、较平衡的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答的基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌。

本发明所述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌是缺失ΔmanA、ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur、ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT和ΔasdA四种基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌，命名为rSC0012。

rSC0012(ΔmanA、ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur、ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT和ΔasdA)保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日为2016年6月20日，保藏编号为CGMCC>Salmonella>。

本发明优越性体现在：

1、减毒株的安全性更高：rSC0012株比拥有ΔP_crp::TT>BADcrp突变的rSC0011减毒株更加减毒，作为幼龄动物疫苗载体具有更高的安全性。

2、减毒株诱导出平衡的细胞和体液免疫应答：携带猪链球菌2型的SaoA蛋白的rSC0012(pS-SaoA)可以诱导出更加平衡的细胞、体液和黏膜免疫应答，并可以100%抵抗野生型猪链球菌2型的攻击。结果证明延迟缺失fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体对于幼龄动物的疫苗开发具有实践意义。本发明可在制备递送猪病原的疫苗载体方面应用。

本发明另一目的是提出以上猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌rSC0012的构建方法。

本发明的技术方案如下：

1）构建在fur毒力基因的启动子中插入araC>BAD结构的自杀载体：

以减毒猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，分别使用引物P1和P2、P3和P4、以及P5和P6进行PCR扩增后，得到扩增产物片段1、片段2以及片段3，将片段1依次与片段3和片段2连接，产生ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur>结构序列；再将ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur>结构序列连接至自杀载体pRE112，获得自杀载体质粒；然后将自杀载体质粒转化至大肠杆菌χ7213中，取得fur毒力基因的启动子中插入araC>BAD结构的自杀载体，命名为χ7213(pS005)；

所述的引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分别如下：

P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG- 3’；

P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA- 3’；

P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG- 3’；

P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG- 3’；

P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT- 3’；

P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG- 3’；

2）构建减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008：

在猪霍乱沙门氏菌C78-3中分别插入突变ΔmanA和ΔrelA::araC>BADlacI>

3）构建rSC0009突变株：

将减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008引入所述fur毒力基因的启动子中插入araC>BAD结构的自杀载体，得rSC0009突变株；

4）构建基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌：

将rSC0009突变株中引入Δasd>突变基因，得基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌。

本发明利用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的铁吸收调节蛋白(ferric uptakeregulator, Fur)延迟缺失，控制猪霍乱沙门氏菌毒力基因缺失的时机，使猪霍乱沙门氏菌对铁的代谢发生紊乱而减毒，同时影响沙门氏菌在淋巴系统的定居能力，导致缺失Fur蛋白的减毒沙门氏菌诱导的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫的水平发生变化，以其获得足够减毒，最终使减毒株能够像野生型猪霍乱沙门氏菌那样高效率入侵宿主淋巴系统，诱导出比较平衡的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答，获得足够安全和平衡的免疫应答的仔猪霍乱沙门氏菌载体菌。

本发明是在猪霍乱沙门氏菌C78-3上构建的，使用araC>P_{BAD>激活启动子技术在猪霍乱沙门氏菌的编码铁吸收调节蛋白(ferric uptake regulator, Fur)的fur>araC>PBAD基因，使基因fur在菌体染色体中的表达受到阿拉伯糖的调控，以使得沙门氏菌毒力基因延迟缺失和表达，构建猪霍乱沙门氏菌fur>fur}::TTaraC>P_BADfur>结构序列的自杀载体。本发明使猪霍乱沙门氏菌C78-3获得ΔmanA、ΔrelA::araC>BAD lacI>TT、ΔP_fur::TT>BADfur>和ΔasdA>突变（优选地，通过同源重组方法获得这些突变），构建成含有ΔmanA，ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT，ΔP_fur::TT>BADfur>asdA>突变的猪霍乱沙门氏菌减毒载体rSC0012。

本发明的构建技术的有益效果：

1、本发明在构建载体的设计中是使用阿拉伯糖启动子基因araC>P_BAD调控猪霍乱沙门氏菌fur毒力基因的表达，即：利用动物体内没有阿拉伯糖的特性，在体外人工培养载体菌时可以人为加入一定浓度的阿拉伯糖，载体菌的fur毒力基因能完全被表达，使载体菌在入侵宿主的初期具有像野生型菌株一样的入侵能力，定植在宿主的淋巴系统，诱导出像野生菌诱导的免疫应答；而在载体菌进入宿主体内，随着细菌的复制，体外人工加入的阿拉伯糖浓度不断被稀释，载体菌表达的Fur蛋白浓度也不断减少，使细菌逐渐减毒获得作为疫苗载体的安全性；本方法是首次用于猪霍乱沙门氏菌fur毒力基因的构建。

2、本发明采用无抗性标记的自杀载体作为构建猪霍乱沙门氏菌载体的方法，可以避免使用抗生素标记的载体，避免减毒载体产生耐药性。

3、本发明还采用了平衡-致死的细菌/载体系统法。其中平衡-致死的细菌/载体系统法是删除了细菌的asd基因，强制性地使细菌的生长需要人为加入二氨基庚二酸（是细菌细胞壁肽聚糖层的一种基本成分），同时在表达外源抗原质粒载体上加入野生型细菌的asd基因。然后将asd⁺的质粒电转化到asd^-的细菌载体上形成互补，可以保证只有携带外源抗原的疫苗株才能在生产疫苗和免疫的宿主体内存活，提高疫苗的免疫效率。

附图说明

图1是ΔP_fur::TT>BADfur基因缺失构建图。

图2是ΔP_fur::TT>BADfur自杀载体图。

图3是ΔmanA缺失株阳性菌的表型鉴定的LPS胶银染色图。图中，>manA缺失株无甘露糖；泳道B：ΔmanA缺失株有甘露糖；泳道C：C78-3野毒株。

图4是阿拉伯糖调控LacI蛋白的表达的Western blot图。图中，泳道1～5分别为χ0008在营养培养液中传的代次，LacI.38 kD；泳道M为蛋白marker。

图5是ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur缺失株阳性菌的PCR电泳图鉴定的电泳图。泳道M：DL2000>

图6是ΔasdA突变株的PCR电泳图鉴定的电泳图。泳道M：DL2000>asd阳性结果。

图7是rSC0012(ΔmanA，ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT，ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur，ΔasdA)的PCR电泳图鉴定。泳道M：DL2000>fur::TT>araC>P_BADfur阳性结果；泳道2：ΔmanA阳性结果；泳道3、4：ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT 前后单交换阳性结果；泳道5：Δ>阳性结果。

图8是无甘露糖时rSC0012失去O抗原，有甘露糖时恢复O抗原的电泳图。泳道A：C78-3强毒株；泳道B：rSC0018弱毒株；泳道C：rSC0012菌株(-mannose)；泳道D：rSC0012菌株(+mannose)。

图9是阿拉伯糖调控SaoA蛋白的表达的Western blot图。泳道M：蛋白marker；泳道1～5：分别为rSC0012(pS-SaoA)在NB培养液中盲传的代次。

图10是阿拉伯糖调控Fur蛋白的表达的Western blot图。泳道M：蛋白marker；泳道1～5：分别为rSC0012(pS-SaoA)在NB培养液中盲传的代次。

图11是rSC0012在含DAP和不含DAP的LB液体培养基中生长状态的比较图。左侧试瓶：rSC0012在不含DAP的LB液体培养基中不生长；右侧试瓶：rSC0012在含DAP的LB液体培养基中正常生长。

图12是SaoA基因的扩增电泳图。泳道M：DL2000>SaoA基因。

图13是纯化SaoA蛋白的Western Blot鉴定图。泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化SaoA蛋白；泳道2：BL21(pET28a-SaoA)菌体蛋白。

图14是asd⁺的未插入外源基因的质粒pYA3493的结构示意图。

图15是asd⁺的插入SaoA基因的质粒pS-SaoA的结构示意图。

图16是减毒株在6周龄BALB/c小鼠肝脏中定植能力比较图。

图17是减毒株在6周龄BALB/c小鼠脾脏中定植能力比较图。

图18是减毒株在6周龄BALB/c小鼠肠道派伊尔氏淋巴小结中定植能力比较图。

图19是减毒株在21d BALB/c小鼠肝脏中的定植能力比较图。

图20是减毒株在21d BALB/c小鼠脾脏中的定植能力比较图。

图21是减毒株在21d BALB/c小鼠肠道派伊尔氏淋巴小结中定植能力比较图。

图22是pS-SaoA质粒在rSC0012(pS-SaoA)中传10-50代PCR结果的鉴定电泳图。泳道M：DL10000>SaoA)的第10～50代。

图23是pS-SaoA质粒在rSC0012(pS-SaoA)中传 10-50代酶切结果结果的鉴定电泳图。泳道M：DL10000 DNA marker；泳道1～5：分别为rSC0012(pS-SaoA) 的第10～50代。

图24是减毒株免疫6周龄BALB/c小鼠诱导的抗SaoA 的IgG图。

图25是减毒株免疫6周龄BALB/c小鼠诱导的抗沙门氏菌减毒株外膜蛋白OMPs的IgG图。

图26是减毒株免疫6周龄BALB/c小鼠诱导的抗SaoA IgA水平图。

图27是减毒株免疫6周龄BALB/c小鼠诱导IFN-γ水平图。

图28是减毒株免疫6周龄BALB/c小鼠诱导IL-4水平图。

图29是减毒株免疫21dBALB/c小鼠诱导的抗SaoA IgG图。

图30是减毒株免疫21dBALB/c小鼠诱导的抗沙门氏菌减毒株OMPs的IgG图。

图31是减毒株免疫21dBALB/c小鼠诱导的抗SaoA IgA的图。

图32是减毒株免疫21d BALB/c小鼠诱导IFN-γ水平的图。

图33是减毒株免疫21d BALB/c小鼠诱导IL-4水平的图。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

一、构建减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0012。

1、构建在fur毒力基因的启动子中插入araC>BAD结构的自杀载体（ΔP_fur::TTaraCP_BADfur）：

在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的fur基因及其上游启动子序列，在fur基因启动子的左右侧设计同源臂引物序列，删除fur基因启动子区的238个核苷酸，然后插入转录终止子（TT）和araC>BAD激活启动子序列1335bp，其删除和插入的系统为：fur基因上游fldA部分序列、删除fur基因启动子区238bp后右侧的序列、插入的转录终止子（TT）和araC>BAD激活启动子序列1335bp、删除fur基因启动子238bp后左侧序列，全称为ΔP_fur::TT>BADfur（P表示启动子，TT表示转录终止子）（如图1所示。

具体步骤如下：

以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，用引物P1和P2经PCR扩增得到fldA同源臂区，命名为片段1(330>

以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，用引物P3和P4经PCR扩增得到删除fur基因启动子区的238>fur基因中的同源臂，命名为片段2(356>

以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，用引物P5和P6经PCR扩增得到TT>araC>P_BAD结构序列，命名为为片段3。

取22.8 µL 灭菌蒸馏水（SW）、0.6 µL上游引物、0.6 µL 下游引物、1 µL模板和25µL Supermix组成总体积为50 µL的PCR反应体系，反应条件为：94 ℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度为58℃ 1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

随后，将片段1与片段3经平端连接，再将连接产物连接至pGEM-TEasyVector克隆载体（promega公司）；将连接产物酶切后，再与片段2经平端连接；将连接产物再连接至pGEM-TEasyVector克隆载体，产生ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur结构序列，经Takara公司测序，证明已获得正确的ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur结构阳性质粒序列。

将上述阳性质粒经SphI和Xmal酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和蔗糖筛选标记的自杀载体pRE112 （由Dr.Curtiss Roy III惠赠，Arizona State University）中，获得的质粒称为pS005；通过酶切和测序双重鉴定，将含有正确的ΔP_fur::TT araC>P_BADfur结构的自杀载体质粒pS005通过电转化至大肠杆菌χ7213中，取得在fur毒力基因的启动子中插入araC>BAD结构的自杀载体，如图2所示，命名为χ7213(pS005)，保存于-20℃环境中。

引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分别如下：

P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG- 3’。

P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA- 3’。

P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG- 3’。

P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG- 3’。

P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT- 3’。

P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG- 3’。

2、构建rSC0008（ΔmanA和ΔrelA::araC>BADlacI>

在猪霍乱沙门氏菌C78-3中分别插入突变ΔmanA和ΔrelA::araC>BADlacI>manA基因缺失后，在沙门氏菌的代谢过程中，6-磷酸果糖生成6-磷酸甘露糖的过程中缺少了磷酸甘露糖异构酶，manA基因缺失菌就不能合成LPS>manA突变的细菌可以合成LPS>manA缺失株无甘露糖时失去O抗原。

在ΔrelA::araC>BAD>lacI基因的表达。即当有阿拉伯糖存在时，lacI基因被表达，表达的lacI蛋白就抑制沙门氏菌突变株携带的原核表达载体表达外源蛋白；反之，当在没有阿拉伯糖存在的动物机体内，lacI基因不能被表达，沙门氏菌突变株携带的原核表达载体就能更高效地表达外源蛋白。因此在培养突变株χ0008第一代时，加入0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖；从第二代培养开始，就不加阿拉伯糖和甘露糖，这样连续传代培养10代。随着传代代数的增加，细菌中阿拉伯糖的含量逐渐减少，lacI基因表达成蛋白的量就不断减少，见图4阿拉伯糖调控LacI蛋白的表达。

3、构建含有ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur突变的rSC0009突变株（C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC>BADlacI>fur::TT>araC>P_BADfur）：

在受体菌rSC0008(C78-3ΔmanA,>relA::araC>BADlacI>fur::TT>araC>P_BADfur结构的自杀载体χ7213(pS005)，构建rSC0009突变株：

具体步骤如下：

1）供体菌和受体菌的结合：

受体菌液的制备：在1mL LB培养基中加入rSC0008（C78-3ΔmanA,>relA::araCP_BADlacI>

供体菌的制备：在含有50mg/mL的2,6-二氨基庚二酸（2,6-diaminopimelic acid，DAP），25mg/mL的氯霉素（chloramphenicol，Cm）的1mL LB培养液中加入自杀载体χ7213（pS005）37℃培养10-12小时，得供体菌液。

然后将受体菌液和供体菌液混合，使受体菌和供体菌发生结合，取得结合的菌落。

2）ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur缺失株的筛选：

将结合的菌落在含氯霉素的LB固体培养板上划单菌落；取生长的单菌落在1mL LB培养液中培养，37℃摇震培养至菌液浓度混浊；每个菌液按照10倍稀释至10^-3，涂布于含5%蔗糖的LB固体培养板上培养出单菌落，并将其命名为rSC0009突变株。

3）rSC0009(C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC>BADlacI>fur::TT>araC>P_BADfur)突变株的PCR鉴定：

将在5%蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但是在含氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，用引物P1和P4进行PCR鉴定，ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur缺失株阳性菌的PCR片段大小为2015>

4、构建猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012。

在rSC0009突变株（ΔmanA>ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT ΔP_fur::TT>BADfur）中引入Δasd突变，具体步骤如下：

1）供体菌和受体菌的结合：

受体菌液的制备：在1mL LB培养基中加入受体菌rSC0009（C78-3ΔmanA,>relA::araC>BADlacI>fur::TT>BADfur>

供体菌液的制备：在含有50 mg/mL的2,6- 二氨基庚二酸（2,6-diaminopimelicacid，DAP），25mg/mL的氯霉素（chloramphenicol，Cm）的1mL LB培养液中加入χ7213（pS004）(Δasd的自杀载体，由本实验室构建，具体方法见Ji>

将受体菌液和供体菌液混合，使受体菌和供体菌发生结合，取得结合的菌落。

2）Δasd缺失株的筛选：

将结合的菌落在含氯霉素和DAP的LB固体培养板上划单菌落；取生长的单菌落在含有DAP的1mL LB培养液中培养，37℃摇震培养至菌液浓度混浊；每个菌液按照10倍稀释至10^-3，涂布于含5%蔗糖的LB固体培养板上培养出单菌落。

3）猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012 (C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC>BADlacI>fur::TT>araC>P_BADfur，Δasd)突变株的PCR鉴定：

将在5%蔗糖和DAP的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板、含有DAP的LB固体培养板，和同时含有DAP和氯霉素的LB固体培养板上划线；将只在含有DAP得LB固体培养板上生长，但是在LB固体培养板、同时含有DAP和氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，用引物P7（5’-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3’）和P8（5’-TCCCCCGGGTATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3’）进行PCR鉴定，Δasd阳性菌的PCR片段大小633bp，阴性菌的PCR片段大小为1719bp。如图6所示。

将rSC0009（ΔmanA>ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT ΔP_fur::TT>BADfur）+Δasd突变株命名为减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0012。

减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0012保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日为2016年6月20日，保藏编号为CGMCC>Salmonella>。

二、对构建的含fur基因启动子修饰的减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0012进行表型鉴定：

1、PCR鉴定rSC0012减毒猪霍乱沙门氏菌中的突变：

由引物P9（ΔmanA）和P10（ΔmanA）对rSC0012株中的ΔmanA突变进行PCR扩增。

由引物P11（ΔrelA）和P12（ΔrelA）对rSC0012株中的ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT突变进行PCR扩增。

由引物P13（ΔP_fur）和P14（ΔP_fur）对rSC0012株中的ΔP_fur::TT>BADfur突变进行PCR扩增。

由引物P15（ΔasdA）和P16（ΔasdA）对rSC0012株中的ΔasdA突变进行PCR扩增。

以上各引物序列见下：

P9（ΔmanA）：5’-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3’。

P10（ΔmanA）：5’->

P11（ΔrelA）：5’->

P12（ΔrelA）：5’->

P13（ΔP_fur）：5’->

P14（ΔP_fur）：5’->

P15（ΔasdA）：5’->

P16（ΔasdA）：5’->

其中，每个突变片段的PCR的反应体系和条件分别如下：

1）ΔmanA>PCR扩增体系的总体积为 25µL，包括：15.7µL SW、2.5µL 10x buffer、3ulMgCl₂、1µL>

2）ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT>2、1µL>

3）ΔP_fur::TT>BADfur>2、1µL>

4）ΔasdA>PCR扩增体系的总体积为 25 µL，包括：15.7µL SW、2.5µL 10x buffer、3µL MgCl₂、1µL>

图7反映了4个突变的PCR片段的结果，可见：该菌株上的4个突变的PCR片段大小与预期的结果完全符合。

2、rSC0012突变株的表型鉴定：

1）ΔmanA突变的表型鉴定：

将野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3（购自中监所）、中国猪霍乱沙门氏菌标准弱毒疫苗株C500（购自中监所）作为对照；设rSC0012中加入和不加入甘露糖（mannose）组，进行银染色实验。由于ΔmanA导致突变株的LPS-O抗原侧链缺失，LPS胶呈现光滑性(如图8中泳道C所示)。而在培养基中添加甘露糖后，突变株能够正常合成LPS-O抗原，LPS胶恢复条带(如图8中泳道D所示)。而对照组C78-3、C500的LPS胶皆呈现有条带，且C78-3的条带颜色更深。图8显示，泳道A为C78-3株，泳道B为C500株（rSC0018弱毒株），泳道C为没有加甘露糖的rSC0012株，泳道D为加入甘露糖的rSC001株的LPS银染色图。

2）ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT突变的表型鉴定：

在ΔrelA::araC>BADlacI>lacI基因的表达。即当有阿拉伯糖存在时，lacI基因被表达，表达的lacI蛋白就抑制沙门氏菌突变株携带的原核表达载体表达外源蛋白；反之，当在没有阿拉伯糖存在的动物机体内，lacI基因不能被表达，沙门氏菌突变株携带的原核表达载体就能更高效地表达外源蛋白。因此本实验需要突变菌株携带能表达外源蛋白原核表达载体的配合，因此使用rSC0012(pS-SaoA)作为验证ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT表型的菌株。

rSC0012(pS-SaoA)随着阿拉伯糖浓度的稀释，原核载体pS-SaoA表达的外源蛋白SaoA逐渐增加。具体方法如下：

取rSC0012(pS-SaoA)单菌落于2mL NB培养基中，于37℃恒温摇床220rpm振荡培养，以培养时间12h为一代，将菌液按体积比1:100接种5mL NB培养基传单培养。在培养第一代时，向正常情况下不含阿拉伯糖的NB培养基中添加0.2 %阿拉伯糖，而从第二代培养开始不添加阿拉伯糖，如此盲传10代。经过蛋白表达最佳条件的摸索后，挑取每代单菌落于含有LB液体培养基，于37℃恒温培养箱静置培养过夜；按1:50接种50mL含有卡那霉素的LB液体培养基(含25 µg/mL Kan)，于37℃恒温摇床220 rpm培养至菌液OD₆₀₀为0.6～1.0，加入1%>

在ΔrelA::araC>BADlacI>lacI基因的表达受到阿拉伯糖的控制。如果培养条件中有阿拉伯糖，菌株就会表达lacI基因，而沙门氏菌突变株所携带原核表达载体的外源蛋白的表达则受到抑制。相反，如果培养条件是动物机体内（这里没有阿拉伯糖），lacI基因就不能被表达，沙门氏菌突变株就能表达所携带原核表达载体的外源蛋白。

随着盲传代数的增加，培养基中首次加入的阿拉伯糖的含量逐渐减少，lacI基因的表达受到抑制，沙门氏菌突变株携带原核表达载体的外源抗原SaoA蛋白的表达量就逐渐增高。Western>

3）ΔP_fur::TT>araC>P_BADfur>

fur基因是沙门氏菌对铁进行代谢的调控基因。在实验设计时在fur基因的启动子中加入了araC>BAD基因（由阿拉伯糖调控），使fur基因所表达的蛋白受到阿拉伯糖的调控。因此对fur基因缺失的表型鉴定也可以用以上rSC0012突变株的表型鉴定中对ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT突变的表型鉴定的方法，即在体外培养第一代rSC0012菌株的NB培养基中加入阿拉伯糖，随后的连续传代培养，都不加阿拉伯糖。随着菌株的分裂，培养基中可利用的阿拉伯糖浓度逐渐下降，而随着培养基中阿拉伯糖浓度逐渐下降，菌株中的fur基因所表达的蛋白也就逐渐减少，直至缺失。图10中泳道1～5分别为rSC0012(pS-SaoA)在NB培养液中盲传至1～5代时的阿拉伯糖调控Fur蛋白的表达条带，由图10可知，随之菌株传代次数的增多，阿拉伯糖的浓度逐渐减少，Fur蛋白的表达量也逐渐减少。

4）ΔasdA>的表型鉴定：

挑取rSC0012单菌落分别接种5mL LB液体培养基和含DAP的LB液体培养基(含50µg/mLDAP)中，于37 ℃恒温摇床220rpm振荡培养过夜，观察该菌在两种不同营养条件中培养的生长状态。

二氨基庚二酸(DAP)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。asd基因编码的天冬氨酸脱氢酶是DAP生物合成途径中的必须酶。所以Δasd突变株的生长依赖于在培养条件下额外添加DAP。结果表明，rSC0012菌株在含有DAP的LB液体培养基中可以正常生长（见图11中右侧试瓶），而在普通LB液体培养基中无法生长（见图11中左侧试瓶）。

三、选择大多数猪链球菌血清型菌株都有的SaoA（surface antigen one)蛋白作为减毒株的异源抗原，对本研究中构建的可调控的延迟减毒的猪霍乱沙门氏菌疫苗候选株的相关特性（如：毒力（LD₅₀）、定植能力和稳定性等）进行了评价，以其为猪病的防控提供新的思路。

1、构建递送猪链球菌SaoA蛋白的猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012平衡-致死系统：

1）猪链球菌2型saoA基因的克隆和表达：

猪链球菌2型是猪的重要疫病，为检测本申请中构建的延迟缺失fur基因猪霍乱沙门氏菌的免疫效率，选择猪链球菌2型SaoA蛋白作为减毒猪霍乱沙门氏菌递送的异源抗原。经SaoA-F（ATGGATCGCAACCTGATGGAAGAC）、SaoA-R（GGGTCGAGCATTGCTACCTTAGAG）引物PCR，经过胶回收、BamHI和SalI双酶切处理，在T4连接酶作用下与同样经过双酶切处理的原核表达载体pET-28a相连接，化学转化法转化至表达菌株BL21中，得到BL21(pET28a-SaoA)菌株。将酶切鉴定阳性的菌株送南京金斯瑞测序。结果可知，酶切后获得了5639bp的载体pET28a的片段和777bp的SaoA片段，长度为789bp，测序后获得的基因序列见下：

ggatcccaac ctgatggggg acaggctact tcaaaggcgg ttaatgtcaa aataccagca 60

gtagtacgac tatttggtcg tgagcttcta gaaaatgaat ttaaatttga gcttagagaa 120

gcgaatggcg aggaactccc tgtccttgat acagctcaaa atacaaaaga gggtcaagtt 180

agatttaaaa atctatcatt cgataagcct ggcaaatact ggtatacaat ttcagaagta 240

aaagatgagc ttggtggtat tgagtatgat tcgaaatata ttgtagcaaa aataactgta 300

gaagatcgaa acgggcaatt acaggcaatg atcgaattta ttgataatga caatgtcttt 360

aacaatttct atacacctgc tccagctgct gctagtcttt cgataaaaaa agtcctcgag 420

ggacgtacct taaacaccgg tgaattcgaa tttgttttaa aaaatgaaaa aggcgatgaa 480

atcgaaaagg taagcaatca agcagatggt tctgtaaact ttagtgccct aacatttaca 540

aaagagggaa cctataccta cactgtttca gaagttgatg gtggacttgg cgatattatc 600

tatgacaaat cagatattaa ggccactgtt actgtgaaag ataacaatca cggacaacta 660

gtctcaacag tgacttatga aaatagcgat caaatcttcg agaatatttt gaatcctggg 720

aagttaatag cgccaaccac ggatagcgtt attactgata atgaagtctc taaggaagca 780

ctggtcgac 。

将以上酶切产物777bp的SaoA片段测序后获得的基因序列与标准猪链球菌的SaoA序列比较，证明酶切的777bp的SaoA序列完全正确。

检测BL21(pET28a-SaoA)中的SaoA蛋白表达结果见图13所示：BL21(pET28a-SaoA)能够有效表达外源插入的SaoA蛋白片段，条带大小为35kD），与预期相符。

2）猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012平衡-致死系统的构建：

为避免使用含抗性基因的质粒载体，保证减毒沙门氏菌中的质粒载体在宿主体内的稳定性，本专利中我们构建的减毒猪霍乱沙门氏菌载体rSC0012是缺失了asd基因的（asd^-），这是为了使asd^{->的载体与asd+>的原核表达载体（pYA3493）形成互补。即：当缺失asd基因的菌株在体外培养时可以通过加入二氨基庚二酸（diaminopimelic>asd}基因后细菌不能生长的缺陷。但是由于动物机体内没有二氨基庚二酸，缺失asd基因的沙门氏菌在动物体内就不能存活，而原核表达载体pYA3493为asd^{+>的质粒，在pYA3493中插入猪链球菌2型的SaoA基因后的pS-SaoA也是asd+>的质粒（见图14和图15所示）；然后将pYA3493或pS-SaoA转化入asd-的减毒沙门氏菌rSC0012中，asd+>的质粒与asd-的细菌就形成互补，从而使缺失asd基因的沙门氏菌在动物体内可以存活的同时，避免因使用抗性基因质粒载体而造成载体菌的耐药。}

因此本实施首先将突变菌株rSC0012（C78-3>manA>ΔrelA::araC>P_BADlacI>TTΔP_fur::TT>BADfur>Δasd）制作成感受态。具体步骤是：挑取单菌落rSC0012用含有50mg/mL>600≈0.6，冰浴10>

3）猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0011或rSC0018平衡-致死系统的构建：

以公布于2015年(Zhenying Jib, Jing Shangb, Yuan Li, Shifeng Wang, HuoyingShi, Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccinevectordisplaying regulated delayed attenuation and regulateddelayed antigensynthesis to confer protection againstStreptococcus suis in mice, Vaccine 33(2015) 4858–4867)的不含有ΔsopB>的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TT>>BAD、ΔrelA::araC>BADlacI>asdA）和rSC0018（C500ΔasdA）作为对照减毒株的准备：

猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0018平衡-致死系统的构建：

rSC0018（C500ΔasdA）菌株是本实验室在前期的研究中，以中国猪霍乱沙门氏菌标准弱毒疫苗株C500为模板，引入ΔasdA突变，命名为rSC0018株。然后挑取单菌落rSC0018用含有50mg/mL>

2、猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)与野毒株C78-3、减毒株rSC0011(pS-SaoA)、弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)的毒力比较：

为测定猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)的毒力，取猪霍乱沙门氏菌野毒株C78-3，中国现用猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)、含有crp基因缺失的减毒株rSC0011(pS-SaoA)和含有fur基因缺失的减毒株rSC0012(pS-SaoA)株进行半数致死量（LD₅₀）的测定和比较。

1）在6周龄BALB/c 小鼠中的LD₅₀的测定：

具体实施为，从-70℃超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37℃静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37℃静置培养18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培养液中；用于培养突变株的LB培养液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等细菌浓度达到OD值为0.8～0.9时，取出菌株培养液，离心，将细菌浓度调节到10¹⁰CFU/ml后，用PBS>

首先用腹腔注射途径进行攻毒。120只雌性6周龄 BALB/c鼠随机分成12小组，每小组10只小鼠。3小组用于野毒株C78-3的LD₅₀的测定，稀释度分别是10^-1，10^-2和10^-3；3小组用于中国现用弱毒疫苗株rSC0018的LD₅₀的测定，稀释度分别是10^-6>-7>-8>50的测定，稀释度分别是10^-6>-7和10^-8；3小组用于猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀的测定，稀释度分别是10^-6>-7和10^-8；每只小鼠用100μL细菌悬液腹腔注射，连续观察30日，计算小鼠的死亡数。实验结果显示野毒株C78-3的LD₅₀是2.2×10²；>50是2.6×10⁷；减毒株rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀是1.4×10⁷,>50是1.1×10⁸（见下表）。结果表明，减毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀比强毒株C78-3降低了5×10⁵倍，比商用中国沙门氏菌疫苗株rSC0018的LD₅₀低4.2倍，>crp::TT>araC>P_BADcrp突变的减毒沙门氏菌rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀低7.9倍。证明猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)比中国现用弱毒疫苗株rSC0018和rSC0011(pS-SaoA)还要减毒。

通过口服方式进行LD₅₀的测定。70只雌性6周龄>50的测定，稀释度分别是10^-3，10^-4和10^-5；而中国现用弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)，猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0011(pS-SaoA)和猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)分别使用2小组，稀释度为10^-8和10^-9；以上各组小鼠经口服途径攻毒，攻毒后连续观察30日，每日记录死亡小鼠。结果显示，C78-3的LD₅₀为5.5×10⁴；rSC0018(pS-SaoA)，rSC0011(pS-SaoA)和rSC0012(pS-SaoA)在攻毒剂量大于10⁹时，小鼠都存活。说明口服途径这3株减毒株都不能致死6周龄>50与C78-3比较差异显著（>50比rSC0011(pS-SaoA)株的LD₅₀减毒7.8倍，差异显著（##：>

2）在21日龄BALB/c 小鼠中的LD₅₀的测定：

具体实施为，从-70℃超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37℃静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37℃静置培养18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培养液中；用于培养突变株的LB培养液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等细菌浓度达到OD值为0.8～0.9时，取出菌株培养液，离心，将细菌浓度调节到10¹⁰CFU/ml后，用PBS>

通过口服方式进行LD50的测定。120只雌性21日龄 BALB/c鼠随机分成9小组，每小组10只小鼠。3小组用于野毒株C78-3的LD₅₀的测定，稀释度分别是10^-3，10^-4和10^-5；而中国现用弱毒疫苗株rSC0018，猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0011(pS-SaoA)和猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)的分别使用3小组，稀释度为10^-7、10^-8和10^-9；以上各组小鼠经口服途径攻毒，攻毒后连续观察30日，每日记录死亡小鼠。结果显示，C78-3的LD₅₀为9.5×10²；rSC0018(pS-SaoA)和rSC0012(pS-SaoA)在攻毒剂量大于10⁹时，小鼠都存活（见下表）。说明口服途径这2株减毒株都不能致死小鼠，而rSC0011(pS-SaoA)组的小鼠在口服剂量为1.0×10⁹>

实验菌株在不同年龄段BALB/c鼠中的LD₅₀对比表：

3、猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012的定植能力评价：

在前期研究中发现，含有crp基因延迟缺失的减毒猪霍乱沙门氏菌毒株rSC0011(pS-SaoA)经口服21日龄仔猪时，可引起部分仔猪饮食下降，说明rSC0011的减毒能力不够，因此我们设计了基因调控延迟缺失猪霍乱沙门氏菌毒力基因fur的减毒株rSC0012，拟使其成为更加安全的疫苗候选株。因此本实施比较了含有fur基因缺失的减毒株rSC0012（pYA3493），和含有crp基因缺失的减毒株rSC0011（pYA3493），中国商用弱毒疫苗株rSC0018（pYA3493）（弱毒的对照组）和野毒株C78-3在6周龄和21d>

1）猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012在6周龄BALB/c小鼠中的定植能力：

从-70℃超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37℃静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37℃静置培养18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培养液中；用于培养突变株的LB培养液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等细菌浓度达到OD值为0.8～0.9时，取出菌株培养液，离心，将细菌浓度调节到10¹⁰CFU。

60只6周龄BALB/c小鼠随机分成20小组，每小组3只小鼠。5小组用于野毒株C78-3的定植实验；5小组用于疫苗株rSC0018的定植实验；5小组用于含有crp基因缺失的减毒株rSC0011（pYA3493）的定植实验；5小组用于含有fur基因缺失的减毒株rSC0012（pYA3493）的定植实验；每只小鼠口服10⁹>

实验结果显示，由于猪霍乱野毒株C78-3是强毒株，BALB/c小鼠在口服10⁹>9>

在肝脏，rSC0012（pYA3493）株只在攻毒后第3d能分离到，rSC0018（pYA3493）株在攻毒后第3-7d能分离到，但是rSC0011（pYA3493）株却是在攻毒后第3-21d都能分离到，并且在接种rSC0011（pYA3493）株后第7-21d，其分离到的菌量都显著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（见图16，##，p<0.01）；rSC0018（pYA3493）株在第7d的定植菌量也显著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（见图16，**，p<0.01）；表明含有fur缺失的菌株rSC0012的毒力显著弱于含有crp缺失菌株rSC0011。

在脾脏，rSC0012（pYA3493）株在攻毒后第3-7d能分离到，rSC0018（pYA3493）株只在攻毒后第3 d能分离到，但是rSC0011（pYA3493）株却是在攻毒后第3-21d分离到,并且在接种rSC0011（pYA3493）株后第3-21d，其分离到的菌量都显著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（见图17，##，p<0.01）；结果表明，含有fur基因缺失的rSC0012（pYA3493）株对6周龄小鼠脾脏的入侵能力显著弱于含有crp基因缺失的rSC0011（pYA3493）株，但是强于化学致弱毒株rSC0018（pYA3493）的入侵能力。表明rSC0012（pYA3493）株的毒力弱于rSC0011（pYA3493）株，强于rSC0018（pYA3493）株。

在肠道派伊尔氏淋巴小结，在攻毒后第3-28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力没有差异；但是在攻毒后第7,21d ,28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力都显著高于化学致弱株rSC0018（pYA3493）株的定植能力（见图18，**，P<0.01）；表明在肠道派伊尔氏淋巴小结，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力相似；并在感染后期都显著强于化学致弱株rSC0018（pYA3493）株。

2）猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)在21d BALB/c小鼠中的定植能力：

复苏和扩增菌株方法同猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012在6周龄BALB/c小鼠中的定植能力。

将60只21日龄BALB/c小鼠随机分成20小组，每小组3只小鼠。5小组用于野毒株C78-3的定植实验；5小组用于疫苗株rSC0018的定植实验；5小组用于减毒株rSC0011（pYA3493）的定植实验；5小组用于减毒株rSC0012（pYA3493）的定植实验。每只小鼠口服10^{9>CFU/20μL（当剂量为109>CFU/20μL时，接种rSC0011（pYA3493）组小鼠出现颤抖，被毛粗糙等症状）；每菌株分别在接种后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝脏、脾脏和肠道的派伊尔小结（payer s patches），经称重和无菌研磨，涂布于麦康凯培养基中分离细菌。实验结果显示，由于猪霍乱野毒株C78-3是强毒株，BALB/c小鼠在口服109>9>}

在肝脏，rSC0012（pYA3493）只在攻毒后第3-7d能分离到； rSC0018（pYA3493）株在攻毒后第3-14d分离到；而rSC0011（pYA3493）株在攻毒后的第3-21d都能分离到菌株，且分离的菌量都显著高于rSC0012（pYA3493）株（图19， #，P<0.05;##, P<0.01）；表明rSC0012（pYA3493）株的毒力弱于rSC0018（pYA3493）株(图19， **,P<0.01)，更弱于rSC0011（pYA3493）株。

在脾脏，rSC0012（pYA3493）和rSC0018（pYA3493）株一样，都只在攻毒后第3d能分离到，二者的分离菌量没有差异，攻毒后第7-28d就分离不到菌株，而rSC0011（pYA3493）株在攻毒后的3-28d都能分离到菌株，分离的菌量显著高于rSC0012（pYA3493）株（图20，##，p<0.01）；表明rSC0011（pYA3493）株对21d小鼠的入侵能力显著强于rSC0012（pYA3493）和rSC0018（pYA3493）株。

但是在肠道派伊尔氏淋巴小结中，只在接种后第7d，rSC0011（pYA3493）株的定植能力高于rSC0012（pYA3493）（图21，#，p<0.05），其余时间段没有差异；在接种后第14-28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力都显著高于rSC0018（pYA3493）株（图21，**：P< 0.01）；表明在21d的BALB/c小鼠中，含有fur的基因缺失株在21d的小鼠肠道派伊尔氏淋巴小结的入侵能力与含有crp基因缺失株rSC0011（pYA3493）的侵袭能力相似，无显著差异。

4、递呈异源抗原pS-SaoA的减毒猪霍乱沙门氏菌株载体rSC0012的稳定性：

挑取经过PCR、双酶切、测序鉴定完全正确的rSC0012(pS-SaoA)单菌落接种于2mL LB液体培养基，于37 ℃恒温摇床振荡培养。按培养12h为一代，将菌液按照1:100接种新鲜的LB液体培养基，如此连续传至50代。取整10代单菌落进行PCR鉴定，结果显示有777 bp的SaoA基因的阳性条带（如图22所示）。对菌株rSC0012(pS-SaoA)进行抽提质粒，经双酶切后出现原核表达载体pYA3493和目的基因SaoA的条带（777>

四、对携带外源抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)进行在BALB/c小鼠中的免疫效果评价：

1、携带外源抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)在6周龄BALB/c小鼠的免疫保护性实验：

为检测rSC0012和rSC0011、rSC0018在递送异源抗原诱导免疫原性能力的差异，用6周龄BALB/c小鼠比较了rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0018(pS-SaoA)作为猪链球菌疫苗抵抗野毒株猪链球菌2型（SS2）攻击的保护性差异。本实验重复2次，实验结果为2次结果的综合。

挑取实验株rSC0018(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0012(pYA3493)、rSC0012(pS- SaoA)、rSC0011(pYA3493)和rSC0011(pS-SaoA)于5 mL的LB液体培养基，于37℃震荡培养8h，按体积比1:100接种于50mL的LB液体培养基，于37℃恒温摇床上振荡培养至菌液的OD₆₀₀值为0.9左右，离心收集菌体，加入PBS重悬沉淀，连续10倍稀释。取100μL连续10倍稀释至合适的稀释度并于麦康凯培养基上计数，另外一部分菌液用于免疫小鼠。

用105只雌性6周龄BALB/c小鼠分成7组，每组15只小鼠。其中1组口服PBS作为阴性对照组，另外6组分别口服免疫10⁹CFU/20μL的疫苗株rSC0018(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0012(pYA3493)、rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pYA3493)、rSC0011(pS-SaoA)菌液。首免后3周加强免疫一次。在加强免疫后7d，>

结果显示，除了PBS对照组(control)，首次免疫和加强免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的血清抗体IgG都显著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗体IgG（如图24，**，P＜0.01）；各免疫组的小鼠均产生抗猪霍乱沙门氏菌外膜蛋白OMPs的IgG抗体，且加强免疫后抗体水平显著增加，各组无明显差异（如图25所示）；首次免疫和加强免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA都显著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA（如图26，**，P＜0.01）；在首免后第3周，免疫rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA显著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA（如图26，**，P＜0.01），但是到加强免疫后2周，免疫rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠和免疫rSC0011(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA没有区别（如图26所示）。

细胞因子检测结果显示，rSC0011(pS-SaoA)及rSC0012(pS-SaoA) 免疫组肺脏和脾脏中细胞因子IFN-γ及IL-4的浓度均显著高于rSC0018(pS-SaoA)免疫组（如图27、28所示，**，P＜0.01）。rSC0011(pS-SaoA)免疫组肺脏及脾脏中IFN-γ水平均显著高于rSC0012(pS-SaoA)（图27，*，P＜0.05），而rSC0012(pS-SaoA)免疫组肺脏及脾脏中IL-4水平均显著高于rSC0011(pS-SaoA)免疫组（图28，*，P＜0.05；**，P＜0.01），表明含有延迟减毒fur突变比含有延迟减毒的crp突变的猪霍乱沙门氏菌减毒载体能诱导出更好的体液免疫水平应答。

在加强免疫后2周，通过腹腔注射，对实验鼠进行SS2的攻毒。结果表明，在rSC0011(pS- SaoA)接种组，经5×LD₅₀，或者15×LD₅₀的猪链球菌2型菌攻毒后，在攻毒后的96h内，有部分小鼠的皮毛蓬乱，但随后恢复正常，连续观察28天后，实验小鼠的存活率为100%（见下表：不同攻毒剂量下疫苗对6周龄BABL/C小鼠的保护效率比较表）。在rSC0012(pS-SaoA)接种组，用5×LD₅₀的SS2攻毒后，连续观察28d，小鼠表现为健康，存活率为100%；而当用15×LD₅₀的猪链球菌2型菌攻毒后，部分小鼠有精神萎靡，在攻毒后第5d，有2/20小鼠死亡，小鼠存活率为90%；在rSC0018(pS-SaoA)接种组，用5×LD₅₀的>50的SS2攻毒后，小鼠精神萎靡，在攻毒后第5d，所有小鼠死亡，小鼠存活率为0%；而空载体组rSC0011（pYA3493）、rSC0012（pYA3493）、rSC0018（pYA3493）以及PBS对照组，在攻毒后96小时内所有小鼠死亡。结果表明（见表4），rSC0012(pS-SaoA)加强免疫后能诱导小鼠产生更高的体液免疫应答（IL-4）。

不同攻毒剂量下疫苗对6周龄BABL/C小鼠的保护效率比较表：

**： 与PBS免疫组和空载体免疫组的比较，差异显著。

2、携带外源抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)在21d BALB/c小鼠的免疫保护性实验：

为检测rSC0012、rSC0011和rSC0018递送猪链球菌SaoA蛋白在幼鼠体内诱导免疫原性的差异，本实施比较了用rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0018(pS-SaoA)株在21d小鼠中的免疫应答。本实验重复2次，实验结果为2次结果的综合。

具体实施方法同携带外源抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012(pS-SaoA)在6周龄BALB/c小鼠的免疫保护性实验，区别是实验动物使用21日龄的BALB/c小鼠。结果显示，除了PBS对照组（control），首次免疫和加强免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的血清抗体IgG都显著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗体IgG（图29，*，P＜0.05；**，P＜0.01）,并且首免后rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的血清抗体IgG显著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗体IgG（图29，*，P＜0.05）；各免疫组的小鼠均产生抗猪霍乱沙门氏菌外膜蛋白OMPs的IgG抗体，且加强免疫后抗体水平显著增加，各组无明显差异（图30）；首次免疫和加强免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA都显著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA（图31，**，P＜0.01）；首次免疫和加强免疫后，免疫rSC0012(pS-SaoA)组的小鼠产生的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA均显著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗体IgA（图31，**，P＜0.01），表明在21d BALB/c小鼠中，缺失fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒株比缺失crp基因的减毒株能诱导出更强大的黏膜免疫应答。

细胞因子检测结果显示，rSC0011(pS-SaoA)及rSC0012(pS-SaoA) 免疫组肺脏和脾脏中细胞因子IFN-γ及IL-4的浓度均显著高于rSC0018(pS-SaoA)免疫组（如图32、33，**，P＜0.01）。rSC0011(pS-SaoA)免疫组肺脏及脾脏中IFN-γ水平均与免疫rSC0012(pS-SaoA)组没有显著差异（见图32），而rSC0012(pS-SaoA)免疫组肺脏及脾脏中IL-4水平均显著高于rSC0011(pS-SaoA)免疫组（图33，**，P＜0.01），表明在21d小鼠中，含有延迟减毒fur突变比含有延迟减毒的crp突变的猪霍乱沙门氏菌减毒载体能诱导出更好的体液免疫水平应答。

在加强免疫后2周，通过腹腔注射，对实验鼠进行SS2的攻毒。结果表明，在rSC0011(pS-SaoA)接种组，经10×LD₅₀，或者15×LD₅₀的SS2菌攻毒后，在攻毒后的96h内，有部分小鼠的皮毛蓬乱，但随后恢复正常，连续观察28天后，实验小鼠的存活率为100%（见下表：不同攻毒剂量下疫苗对21日龄BABL/C小鼠的保护效率对比表）。在rSC0012(pS-SaoA)接种组，用10×LD₅₀的SS2攻毒后，连续观察28d，小鼠表现为健康，存活率为100%；而当用15×LD₅₀的猪链球菌2型菌攻毒后，部分小鼠有精神萎靡，在攻毒后第5d，有2/20小鼠死亡，小鼠存活率为90%；而空载体组rSC0011（pYA3493）、rSC0012（pYA3493）试验以及空白对照组在攻毒后96小时内所有小鼠死亡。结果表明，在用10×LD₅₀剂量的SS2攻毒后，免疫rSC0012(pS-SaoA)与rSC0011(pS-SaoA)提供的保护效率相同；当加大SS2的攻毒剂量后，免疫rSC0012(pS-SaoA)提供的保护效率要稍低于rSC0011(pS-SaoA)>

不同攻毒剂量下疫苗对21日龄BABL/C小鼠的保护效率对比表：

**： 与PBS免疫组和空载体免疫组的比较，差异显著。

综上所述，本申请利用延迟减毒猪霍乱沙门氏菌的毒力基因fur的方法，成功地获得了一株猪霍乱沙门氏菌减毒株rSC0012（C78-3>manA>ΔrelA::araC>BAD lacI>TTΔP_fur33::TT araC>BAD>）。动物实验证明，本申请的减毒菌株rSC0012在BALB/c小鼠上的LD₅₀比减毒菌株rSC0011（ΔmanA，ΔP_crp::TT>BADcrp，ΔrelA::araC>P_BADlacI>TT，ΔasdA）要低7.9倍，比现有的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗标准株低4.2倍，而比野生型菌株>5倍；结果表明，在相同基因背景的减毒菌株下，fur延迟缺失的菌株要比crp延迟缺失的菌株毒力低7.9倍。在6周龄BALB/c小鼠的定植实验结果显示，在接种菌株后28d，rSC0012株在派伊尔氏淋巴小结中的定植能力与减毒株rSC0011株的定植能力没有显著差异；而在21d>fur基因缺失的毒株的毒力显著低于阿拉伯糖调控的crp基因缺失的毒株的毒力。动物保护性实验结果显示，携带猪链球菌2型SaoA蛋白的fur基因缺失减毒株rSC0012(pS-SaoA)株在6周龄21d的的BALB/c小鼠的肺脏和脾脏中，能诱导出更好的体液免疫应答水平，同时能获得很高的保护效率。

<110> 扬州大学

<120> 一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法

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<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

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tgcgagctcg tgtaaatctt tcgaagagcc aa

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cctggtacct aggcctctag ataaataaaa gcagtttaca actcctagaa ttgt

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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gggggtacct acggcgacgg acacatgttc gct

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<212> DNA

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cgggtacccc agatattttc cagatcttca c

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acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

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tgctctagat gtgcatggca atcgcccaac

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<212> DNA

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tcccccgggt atctgcgtcg tcctaccttc

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<213> 人工合成的SaoA片段

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ggatcccaac ctgatggggg acaggctact tcaaaggcgg ttaatgtcaa aataccagca 60

gtagtacgac tatttggtcg tgagcttcta gaaaatgaat ttaaatttga gcttagagaa 120

gcgaatggcg aggaactccc tgtccttgat acagctcaaa atacaaaaga gggtcaagtt 180

agatttaaaa atctatcatt cgataagcct ggcaaatact ggtatacaat ttcagaagta 240

aaagatgagc ttggtggtat tgagtatgat tcgaaatata ttgtagcaaa aataactgta 300

gaagatcgaa acgggcaatt acaggcaatg atcgaattta ttgataatga caatgtcttt 360

aacaatttct atacacctgc tccagctgct gctagtcttt cgataaaaaa agtcctcgag 420

ggacgtacct taaacaccgg tgaattcgaa tttgttttaa aaaatgaaaa aggcgatgaa 480

atcgaaaagg taagcaatca agcagatggt tctgtaaact ttagtgccct aacatttaca 540

aaagagggaa cctataccta cactgtttca gaagttgatg gtggacttgg cgatattatc 600

tatgacaaat cagatattaa ggccactgtt actgtgaaag ataacaatca cggacaacta 660

gtctcaacag tgacttatga aaatagcgat caaatcttcg agaatatttt gaatcctggg 720

aagttaatag cgccaaccac ggatagcgtt attactgata atgaagtctc taaggaagca 780

ctggtcgac

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<213> 人工合成的SaoA片段

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