一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用。通过实验证明：黄热病毒的RPA引物和探针可有效扩增靶基因，特异性达100％，灵敏度为1×10

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus)属于黄病毒科黄病毒属，可引起严重的出血热症状，传染性强，病死率为23％_～90％。以急性发热伴有严重出血为主要表现特征。黄热病主要流行于非洲，中国并非黄热病毒的流行区域，但随着全球贸易、旅游业的飞速发展，不同国家、不同地区的人类交流日益频繁，很多传染病已打破了地区、国界的限制，传播范围日益广泛，我国也多次面临输入性传染病的威胁。2016年3月，我国曾出现一例输入性黄热病毒感染。我国人口多，人口密度大，黄热病毒一旦在我国传播，后果不堪设想。为了应对今后可能出现的黄热病毒感染，极有必要研制黄热病毒快速检测试剂。

人类目前针对黄热病毒的检测主要依靠实时荧光定量PCR技术，需要昂贵的温控设备、特定的实验室场地和专业技术人员操作，且检测时间长，不适用于突发传染病的现场快速检测，因此，建立一种快速简便的核酸检测技术，对黄热病毒的及时发现和鉴别具有重要的意义和价值。

重组酶聚合酶等温核酸扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是由Piepenburg等人建立的一种新型核酸等温扩增技术，该技术主要依赖于三种酶：结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶UvsX、单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶，模拟体内DNA复制的酶反应过程对DNA模板进行扩增。在恒温37℃-42℃之间，核酸模板无需变性，20分钟之内即可完成整个扩增过程。同时，RPA技术操作简单，设备要求低，具有灵敏度高、特异性强等特点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种检测或辅助检测黄热病毒的成套引物。

本发明提供的检测或辅助检测黄热病毒的成套引物由引物1、引物2和探针组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；

所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：

d1)序列4所示的单链DNA分子；

d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套引物中，

所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔量比为7:7:2。

上述成套引物中，

所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基T为荧光基团修饰的碱基T；所述荧光基团可为FAM、6-FAM、FITC、HEX、JOE、Phosphate、Rhodamine Green、Rhodamine Red、RhodamineB、ROX、TAMRA、NBD、TET或DyLight 770，所述荧光基团具体为FAM；

所述DNA片段乙自5’端起第一位碱基T为淬灭基团修饰的碱基T；所述淬灭基团可为DABCYL、TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3；所述淬灭基团具体为BHQ1。

上述成套引物中，所述探针中的DNA片段乙的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端外切酶和聚合酶发挥作用。

本发明的第二个目的是提供一种检测或辅助检测黄热病毒的RPA试剂。

本发明提供的检测或辅助检测黄热病毒的RPA试剂包括上述成套引物。

上述RPA试剂中，

所述引物1和所述引物2在所述RPA试剂中的终浓度均为0.42μM；

所述探针在所述RPA试剂中的终浓度为0.12μM。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测黄热病毒的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测黄热病毒的试剂盒包括上述成套引物或上述RPA试剂。

本发明的第四个目的是提供上述成套引物或上述RPA试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述成套引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在如下1)-6)中任一种中的应用：

1)检测或辅助检测黄热病毒；

2)制备检测或辅助检测黄热病毒的产品；

3)检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒；

4)制备检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒的产品；

5)检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒；

6)制备检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒的方法包括如下步骤：用上述成套引物对待测样品进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

若RPA扩增产物满足如下条件：在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测样品感染或候选感染黄热病毒；

若RPA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测样品未感染或候选未感染黄热病毒。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒的方法包括如下步骤：用上述成套引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

若RPA扩增产物满足如下条件：在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测病毒为或候选为黄热病毒；

若RPA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测病毒不为或候选不为黄热病毒。

上述方法中，所述阈值为以RPA扩增起始2min内的荧光信号强度的平均值加上3倍的标准差。

上述方法中，所述RPA扩增的模板为待测样品或待测病毒的基因组RNA或DNA；所述RPA扩增的模板具体为待测样品或待测病毒的RNA。

本发明通过基因组序列分析，选取黄热病毒的特异核酸片段作为检测的靶基因，并针对靶基因序列设计了RPA检测引物和探针，制备了黄热病毒的RPA检测试剂盒，建立了检测黄热病毒的一步法RPA技术。通过实验证明：黄热病毒的RPA引物和探针可有效扩增靶基因，特异性达100％，灵敏度为1×10²copies/反应，且在临床模拟样本中可检测到的病毒滴度为10²TCID₅₀/mL，与荧光定量PCR的灵敏性也相当；与同属登革病毒、乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒核酸均无交叉反应。本发明的RPA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在37-42℃条件下，均可实现靶基因的有效扩增，不仅可用于黄热病毒感染核酸的现场快速检测，也为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。同时对于防止黄热病毒在中国的感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有重要意义。

附图说明

图1为黄热病毒RPA扩增系统的特异性检测。

图2为黄热假病毒核酸的RPA检测结果。其中，1-5分别代表不同浓度RNA模板的扩增效果，1-5反应管中的模板量分别为:10⁵copies、10⁴copies、10³copies、10²copies、10copies。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的含黄热病毒目的基因片段的假病毒阳性参考品(黄热假病毒)，滴度为2.0×10⁷copies/ml，在文献“曹雪锋，康晓平，冉鑫，霍耐凡，吴晓燕，李裕昌，杨银辉,含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备,军事医学,2016(40),713-717”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所处获得。

下述实施例中的One Step PrimeScript^TM>

下述实施例中的PureLink^TM>

下述实施例中的exo RT kit和便携式荧光扩增检测仪(Twista)是英国TwistDx公司的产品。

下述实施例中的黄热病毒17D(YFV-17D)在文献“彭文明,邓永强,于曼,范保昌,祝庆余,秦鄂德.黄热病毒的一步RT-PCR法检测.微生物学杂志,2003,23,8-10)”中公开过。

下述实施例中的登革病毒1型(DEN-1)GZ01株在文献“Epidemiological andVirological Characterizations of the 2014Dengue Outbreak in Guangzhou,China.Hui Zhao,Fu-Chun Zhang,Qin Zhu,Jian Wang,Wen-Xin Hong,Ling-Zhai Zhao,Yong-Qiang Deng,Shuang Qiu,Yu Zhang,Wei-Ping Cai,Wu-Chun Cao,Cheng-Feng Qin,PLOS ONE,2016June 3中公开过。

下述实施例中的乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株在文献“杨银辉，朱晓光，张永国，康晓平等。利用基因芯片技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志，2007，30(12)：1360－1363”中公开过。

下述实施例中的蜱传脑炎病毒(TBEV)森张株在文献“胡玉洋,杨银辉,刘洪,康晓平,朱晓光,司炳银,祝庆余,森林脑炎病毒(TBEV)实时定量TaqMan PCR检测方法的建立,解放军医学杂志2006,31,745-748”中公开过。

下述实施例采用invitrogen的DNA/RNA核酸提取试剂盒进行病毒核酸提取，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，得到病毒核酸。

实施例1、黄热病毒的RPA检测引物和探针及其检测方法

一、黄热病毒的RPA检测引物和探针的设计及合成

下载黄热病毒全基因序列，使用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件进行序列比对分析，选取种内保守、种间特异的核蛋白(NP)基因区段(长度为166bp)作为检测靶基因，按照如下设计要求设计黄热病毒的RPA检测引物和探针：(1)RPA引物长度为30-35个碱基，GC含量在40-60％之间，避免形成二级结构和发卡结构；引物中应避免出现长串的聚嘌呤或聚嘧啶等特殊序列；5’端前3-5个核苷酸应避免为聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶；(2)RPA探针长度为46-52个碱基，分别距离5’端大于30bp和距离3’端大于15bp处插入THF(四氢呋喃)作为外切酶exo的切断位点，在THF左右分别修饰荧光基团和淬灭基团；在3’端作封闭处理阻断序列延伸。引物和探针的序列尽可能不重叠，以避免出现引物和探针的二聚体结构和二级结构，扩增产物应少于500bp，最好为100-200bp之间，以达到最佳扩增效率。

根据上述引物设计要求，设计的引物如下：

F-GACTTATGCTCTGAACACCATCACCAACTTG(序列1)；

R-CATCCTCTTCAGTCTGTTACATCCGTGCTC(序列2)；

根据上述探针设计要求，设计的探针如下：CATGCCTCCAGCCTGGTCAGAACTGATTCATCACT(序列3)-THF-TAATCTTGAACATGTTGG(序列4)(C3-Block)。

上述探针中，序列3自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了FAM荧光报告基团胸腺嘧啶核苷酸(FAMdT)，序列4自5’端起第一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(BHQ1dT)；THF(四氢呋喃)作为外切酶exo的切断位点；C3-Block：序列4的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端外切酶和聚合酶发挥作用。

上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、黄热病毒的RPA检测方法

以待测样品的基因组RNA为模板，采用步骤一设计的RPA引物和探针进行RPA扩增，得到扩增产物并检测荧光信号强度。具体步骤如下：

在1.5ml EP管中配制反应混合溶液，其中每个RPA反应管的反应体系如下：Rehydration buffer(exo kit试剂盒中提供，exo kit试剂盒的货号为PFERT0205)29.5μl，上下游引物各2.1μl(10μM)，RPA探针0.6μl(10μM)、模板和dH₂O13.2μl。将反应混合溶液振荡混匀，然后将其移至含冻干粉的RPA反应管中使干粉融化并再次混匀，最后在每个反应管中加入2.5μl醋酸镁(280nM)溶液，混匀离心后迅速将反应管置于便携式荧光扩增检测仪中开始恒温(37-42℃)反应并检测荧光信号值。

便携式荧光扩增检测仪自带的软件Tubescanner可对扩增结果进行自动分析，以扩增起始2min内的荧光信号强度的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值，

若RPA扩增产物满足如下条件：在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测样品感染或候选感染黄热病毒；

若RPA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测样品未感染或候选未感染黄热病毒。

实施例2、黄热病毒的RPA检测和Real-time PCR检测的灵敏度比较

1、黄热病毒RPA检测

采用实施例1的步骤二中黄热病毒的RPA检测方法，以10倍梯度稀释的黄热假病毒RNA溶液作为模板(加入的模板量分别为：10⁵copies/反应、10⁴copies/反应、10³copies/反应、10²copies/反应、10copies/反应)进行RPA扩增。

2、黄热病毒Real-time PCR检测

以10倍梯度稀释的黄热假病毒的RNA溶液作为模板(加入的模板量分别为：10⁵copies/反应、10⁴copies/反应、10³copies/反应、10²copies/反应、10copies/反应)，采用表1中的引物和探针，利用一步法real>

表1、Real-time PCR引物和探针设计

注：FAM：荧光报告基团；Tamra：荧光淬灭基团。

表2、荧光定量PCR反应体系

将反应体系置于荧光定量PCR反应仪中(Roche LightCycler 2.0)进行反应，反应条件如下：

利用系统自带的分析软件进行结构分析，阴性对照和阳性对照均成立的前提下，待测样本的CP≤35可判为阳性。

RPA扩增结果如图1所示。两种检测方法的灵敏度比较结果如表3所示。经分析可得，黄热病毒的RPA扩增可达到与Real-time PCR相同的灵敏度，达到10copies/反应。

表3、RPA和Real-time PCR对黄热病毒核酸检测灵敏度的比较扩增结果

实施例3、黄热病毒的RPA引物和探针的特异性检测

分别以同属黄热病毒17D(YFV-17D，黄热假病毒)、登革病毒1型(DEN-1)GZ01株、乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株、蜱传脑炎病毒(TBEV)森张株的病毒核酸RNA为模板，采用实施例1的步骤二中黄热病毒的RPA检测方法检测本发明的RPA引物和探针的特异性。

结果如图2所示。实验结果表明RPA引物探针均可特异地扩增出靶基因而与其它同属的3个病毒(登革病毒1型、乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒)核酸均无交叉反应，说明本发明的黄热病毒的RPA引物和探针具有较好的特异性。

实施例4、本发明的方法在模拟临床样本的黄热病毒检测中的应用

分别用正常人血清和咽拭子对体外培养的黄热病毒17D(YFV-17D)疫苗株(滴度为10⁵TCID₅₀/mL)进行10倍系列稀释，分别得到不同浓度(10⁴TCID₅₀/mL、10³TCID₅₀/mL、10²TCID₅₀/mL)的黄热病毒17D血清模拟样本和咽拭子样本。并将不同浓度的黄热病毒17D血清模拟样本和咽拭子样本的核酸提取物(RNA)模拟临床样本作为模板，按照实施例2中的方法分别进行RPA检测和荧光定量PCR检测。

结果如表4所示。用体外培养的黄热病毒17D制备血清和咽拭子模拟临床样本，提取核酸后，用RPA检测和荧光定量PCR检测的方法均可检测到从10²TCID₅₀/mL病毒中提取的核酸，RPA检测和荧光定量PCR检测到的模拟临床样本的最低滴度均为10²TCID₅₀/mL。说明本发明的黄热病毒的RPA检测方法和荧光定量PCR检测的灵敏性相当。

表4、RPA和Real-time PCR对黄热病毒核酸检测结果

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用

<160>4

<210>1

<211>31bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gacttatgct ctgaacacca tcaccaactt g 31

<210>2

<211>30bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

catcctcttc agtctgttac atccgtgctc 30

<210>3

<211>35bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

catgcctcca gcctggtcag aactgattca tcact 35

<210>4

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

taatcttgaa catgttgg 18