一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记及其应用

摘要

本发明属于鱼类分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记及其应用。所述的分子标记由团头鲂NLRC3‑like基因中克隆得到，位于NLRC3‑like基因外显子中，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的100位碱基处存在一个等位基因突变(C/T)，该突变引起氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸。利用本发明筛选的分子标记对团头鲂抗病性状进行了关联分析。本发明筛选的分子标记可在团头鲂抗病性状辅助选择中应用。

说明书

技术领域

本发明属于鱼类分子标记制备领域，具体涉及一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记及其应用，所述的分子标记可在团头鲂抗病性状辅助选择中应用。

背景技术

团头鲂(Megalobrama amblycephala)隶属于鲤形目Cypriniformes、鲤科Cyprinidae、鲇亚科Culterinae、鲂属Megalobrama，俗称武昌鱼，是分布于长江中下游大中型湖泊的较大型经济鱼类(陈宜瑜，1998)。由于其具有食性广、生长快、疾病少、易捕捞、繁育简便、成活率高、肉嫩味鲜等优点，深受生产和消费者的欢迎。但是，随着养殖集约化程度的提高，近亲繁殖导致的经济性状退化，鱼药的滥用以及养殖环境的恶化等，团头鲂养殖过程中的病害也越来越严重。常见的疾病有小瓜虫病、车轮虫病、锚头蚤病、细菌性败血症、细菌性烂鳃病等(王为民，2009)，其中，由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症，可导致鱼体全身各部位充血、溃疡、肠道出血、肝脏发白、腹腔积水、溃烂等症状，这种病一旦发病，很难用药物来进行控制和治疗，最终会导致团头鲂大量死亡，影响着团头鲂养殖业的发展。

鱼类是非特异性免疫和特异性免疫并存的脊椎动物，但是，与哺乳类相比，其特异性免疫系统还不够发达、不完善，在抵御病原微生物入侵时主要依赖非特异性免疫发挥作用。非特异性免疫是通过胚系基因编码的模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)识别侵入体内的外源分子的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns,PAMP)，从而启动固有免疫反应，为机体提供直接、快速的免疫应答，PRR是整个固有免疫应答研究的枢纽(Sha et al，2009)。PAMP是病原体的一些结构，如细菌的细胞壁成分脂多糖、肽聚糖、纤毛、鞭毛蛋白及细菌特有DNA或RNA结构，病毒的非包裹双链和单链RNA等，PRR通过与这些配体特异性结合来激活下游通路上基因的表达，为机体提供直接、快速的免疫应答，在感染早期发挥重要作用(敖敬群和陈新华，2012)。NOD样受体(NOD likereceptors,NLRs)是一类重要的胞质区PRR，在免疫应答的调控和抵抗病原体入侵的过程中发挥着重要的作用(Biswas and Kobayashi，2013)。很多研究表明，NLRs中某些分子的异常会导致多种疾病的发生，列如NOD2基因的突变与个体对Crohn’s病的易感性密切相关(Ogura et al 2001)，NALP3基因的SNP突变也与很多疾病相关(Pontillo et al，2010)。目前NLRs基因多态性与疾病的关联性分析方面的研究多集中在人身上，对水产动物的研究较少。

单核苷酸多态(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起DNA序列的多态性。由于其具有数量多、分布广泛、适用于快速、规模化筛查。同时由于等位基因频率容易估计和易于基因分型等优点，目前SNP已经成为继微卫星之后的第三代遗传标记。许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。SNP多态性已广泛应用于经济动物育种过程中。如在构建高密度遗传连锁图谱、目标性状与分子标记的关联分析、连锁不平衡与单体型分析、标记辅助选择育种、群体遗传结构及系统发育分析、品种鉴定等方面都表现出良好的应用前景。又由于高分辨率熔解曲线技术(highresolution melting，HRM)是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法，具有高通量、低成本、准确性高等优点而被广泛运用(Wittwer et al2003)。

目前尚未见到有关从NLRC3-like基因中筛选到与团头鲂抗病性状相关的SNP分子标记及其应用的报道。

发明内容

本研究目的在于克服现有技术的缺陷，筛选得到一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记及其应用，从NLRC3-like基因筛选得到与团头鲂抗病抗病相关性状尤其是与团头鲂抗嗜水气单胞菌感染性状相关的SNP分子标记，为团头鲂抗病品种的培育提供有用的遗传标记。

本发明的技术方案如下所述：

本发明通过用嗜水气单孢菌感染团头鲂,提取基因组DNA，采用引物设计、PCR扩增测序、SNP位点筛选获得SNP位点，然后通过高分辨率熔解曲线法对SNP位点进行分析，利用SPSS软件对抗性组和易感组的基因型频率进行差异显著性分析，寻找抗病相关位点。在NLRC3-like基因中发现1个与团头鲂抗病相关的SNP位点100C/T。通过卡方检验分析及抗病关联分析发现，该位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗性组中差异极显著(P<0.01)。

申请人通过基因克隆技术，获得团头鲂免疫相关基因NLRC3-like基因cDNA序列，首次证实1个与团头鲂抗病相关的基因NLRC3-like多态性SNP分子标记，并利用HRM法来进行通量分析所述的分子标记，得到一个团头鲂NLRC3-like基因外显子上的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1(该序列的100位碱基处的碱基是突变后的碱基T))所示，在该序列的100位碱基处存在一个等位基因突变(C/T)。

具体地，申请人筛选到一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：

CACGGGAAGAGACAACACGCTACATTAATAAGAAAATAAAAGAAGGCCACTTCCCAGAAAAACATGAGACCCTTTTGCGGTGCATTGATGAACTTAACGR(C/T)ACACTGACGTGTTGGTTAAAAGAGTCTCATGATGAACTTCTGAGAGTGATGCTATTGCATTGTTTCTTGCCAAAAGAGAAGTGGTAGAAATATAATCTACCATCAACAATCTTG

上述序列的100位碱基处的R是C或T的突变(该突变位于基因外显子部分)，该突变引起氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸。

申请人设计了检测一种与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记以及检测NLRC3-like基因分型的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物F：CACGGGAAGAGACAACACGC，

反向引物R：CAAGATTGTTGATGGTAGATTAT。

本发明所述的SNP位点采用常用的HRM方法筛选得到。

本发明制筛选的SNP分子标记可用于检测团头鲂免疫性状相关基因NLRC3-like多态性，能有效辅助选择抗病性状相关基因型。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明筛选的与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记的核苷酸序列(长度214bp)，突变位点(C/T)位于该序列的100位碱基处。

序列表SEQ ID NO：2是扩增团头鲂NLRC3-like基因100C/T位点的上游引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是扩增团头鲂NLRC3-like基因100C/T位点的下游引物序列。

序列表SEQ ID NO：4是本发明克隆的团头鲂NLRC3-like基因完整cDNA序列。序列全长为2863bp，该序列的2364-2577位的序列是本发明的与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记。

图1：团头鲂DNA提取结果电泳图。附图标记说明:泳道M:Marker；A区段(泳道1-11):抗病个体；B区段(泳道1-11)。

图2：本发明的实施例中团头鲂NLRC3-like基因100C/T位点不同基因型的测序峰图。

图3：本发明的实施例中团头鲂NLRC3-like基因100C/T位点不同基因型的HRM结果。附图标记说明：图3中两种颜色表示只有两种基因型。

图4：是本发明筛选的与与团头鲂抗病性状相关SNP分子标记的直观序列。在该序列的100位发生一个等位基因突变,以R(C/T)表示。

具体实施方式

实施例1

1.试验对象(试验材料)

实验所用团头鲂均采自湖北百容水产良种有限公司，所用团头鲂为一龄团头鲂，共1500尾。从池塘打捞上来后先在桶里暂养至稳定后，对其注射嗜水气单胞菌人工诱发感染，嗜水气单胞菌的注射浓度为1×10⁷cfu/mL，水温保持在27-29℃。分别采集12h内最先死亡的鱼(易感组)以及5d后仍然存活的鱼(抗性组)的鳍条样本，放在无水乙醇中保存，带回实验室置于-20℃下保存，作为提取基因组DNA的样本。

2.试验方法

2.1利用酚-氯仿法提取团头鲂基因组DNA，具体步骤如下所述：

(1)取0.2g团头鲂的鳍条放入2mL离心管中，加入600μL细胞裂解液(商购)，用消过毒的剪刀将鳍条剪碎，加入6μL蛋白酶K(20mg/μL)，60℃水浴消化至澄清(2-4h)。

(2)用等体积(600μL)酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)提取2次，4500r/min离心20min，取上清至1.5mL离心管中。

(3)加入2倍体积预冷的无水乙醇进行沉淀，-20℃静置30min左右。

(4)4℃，12500r/min离心20min，弃上清。

(5)用70％乙醇洗涤沉淀2次，4℃，12500r/min离心10min。

(6)将沉淀晾干，加入50-100μL ddH₂O溶解沉淀，静置过夜，待其充分溶解后于-20℃保存。

2.2获取SNP位点

从团头鲂转录组中钓取NKLC-like基因序列，设计RACE引物克隆该基因序列，并与团头鲂基因组库(结果未发表)比对，获得团头鲂NKLC-like基因组序列，在易感组和抗性组中各随机选择5个样本DNA作为模板。

，用Primer premier 5.0软件设计PCR引物(见表1)分别对10个模板进行PCR扩增(表2)，将扩增产物送武汉擎科创新生物科技有限公司进行纯化测序。用DNAstar软件对测序结果进行分析，通过序列比对和峰图分析，筛选出候选SNP位点。

表1本发明用于SNPs扩增的引物序列

PCR反应程序：94℃预变性5min后进入循环体系94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min。将产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，成像保存。

2.3 SNP分型及与抗病性的关联性分析

采用高分辨率熔解曲线法(HRM)对团头鲂NLRC3-like基因SNPs位点进行分型，反应体系(高分辨率熔解曲线法)见表3；分型所用引物见表4；用SPSS软件对分型结果进行统计分析。

表3高分辨率溶解曲线法体系

SNP分型程序：

预变性：95℃，5min

扩增(45个循环)：95℃，1min；60℃，10sec；72℃，15sec(搜集荧光值)

高分辨率溶解曲线：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1sec；95℃连续搜集荧光值，25次/℃，温度变化率0.02℃/sec。

表4本发明设计的用于基因型分型的引物序列

3结果分析

3.1用SPSS软件对SNP位点在易感群体和抗病群体中的基因型频率和等位基因的频率进行了统计，得到如表5所述的结果。

表5团头鲂NLRC3-like基因核苷酸多态性位点基因型分布

通过卡方检验分析发现100位碱基处C/T位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗性组中差异极显著(P<0.01),基因型为CC个体比基因型为CT的个体更加抗病。

参考文献

1.陈宜瑜.中国动物志硬骨鱼纲鲤形目(中卷)，科学出版社，北京，1998.

2.王为民.团头鲂养殖产业现状，科学养鱼，2009，44-46.

3.敖敬群等，鱼类模式识别受体的研究进展，生命科学，2012，24.

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5.Biswas A,Kobayashi KS.Regulation of intestinal microbiota by theNLR protein family.Int Immunol.2013,25:207-214.

6.Ogura Y,Bonen D K,Inohara N,et al.A frameshift mutation inNOD2associated with susceptibility to Crohn's disease[J].Nature,2001,411:603-606.

7.Ogura Y,Bonen DK,Inohara N,Nicolae DL,Chen FF,Ramos R,Britton H,Moran T,Karaliuskas R,Duerr RH,Achkar JP,Brant SR,Bayless TM,Kirschner BS,Hanauer SB, G,Cho JH.A frameshift mutation in NOD2associated withsusceptibility to Crohn's disease.Nature.2001,411:603-606.

8.Pontillo A,Brandao L,Guimaraes R,Segat L,Araujo J,Crovella S.TwoSNPs in NLRP3gene are involved in the predisposition to type-1diabetes andceliac disease in a pediatric population from northeastBrazil.Autoimmunity.2010,43:583-589.

9.Wittwer CT,Reed GH,Gundry CN,Vandersteen JG,Pryor RJ.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen.ClinChem.2003,49:853-860。

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