苦参碱和氧化苦参碱衍生物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一类苦参碱和氧化苦参碱衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的苦参碱和氧化苦参碱衍生物，其结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ。本发明利用微生物转化技术，对苦参碱和氧化苦参碱成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及苦参碱和氧化苦参碱衍生物及其制备方法以及该衍生物的医药用途。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，研究和开发抗肿瘤药物一直是医药领域的重要研究内容。天然产物一直是人类寻找有效活性成分的源泉，在新药开发过程中，一方面具有良好活性的天然产物可以直接被用于临床；另一方面，以天然活性成分为先导化合物，通过有机合成、结构改造等方法寻找和开发新的高效低毒药物，是被实践证明最行之有效的开发新药的途径之一。

苦参碱与氧化苦参碱是豆科植物苦参的有效成分。传统医学认为苦参具有清热燥湿、杀虫、利尿的作用，现代药理研究认为苦参的有效成分具有抗肿瘤、抗心律失常、抗病毒、升白细胞的功效。近年来国内外对苦参碱与氧化苦参碱的研究活跃，探索了其多方面的药理活性及临床功能，尤其在抗肿瘤方面引起了广泛的关注。

微生物转化的实质是由微生物体系代谢过程中产生的酶作用的催化反应。生物体系中的酶能催化多种生化反应，并且催化速度超出想象，催化反应不仅能在体内进行，更能在体外促进天然化合物以及人工合成化合物的多种转化反应。

发明内容

本发明的目的是提供一系列苦参碱与氧化苦参碱衍生物及其制备方法。

本发明具体技术方案如下：

一种具有13位羟基取代的苦参碱衍生物：13-羟基苦参碱，具有式Ⅰ结构：

一种具有13位，14位羟基取代的苦参碱衍生物：13,14-二羟基苦参碱，具有式Ⅱ结构：

一种具有12位羟基取代的苦参碱衍生物：12-羟基苦参碱，具有式Ⅲ结构：

一种具有13位羰基取代的苦参碱衍生物：13-羰基苦参碱，具有式Ⅳ结构：

一种具有12位羰基取代的苦参碱衍生物：12-羰基苦参碱，具有式Ⅴ结构：

一种具有13位羟基取代的氧化苦参碱衍生物：13-羟基氧化苦参碱，具有式Ⅵ结构：

一种具有13位，14位羟基取代的氧化苦参碱衍生物：13,14-二羟基氧化苦参碱，具有式Ⅶ结构：

一种具有12位羟基取代的氧化苦参碱衍生物：12-羟基氧化苦参碱，具有式Ⅷ结构：

一种具有13位羰基取代的氧化苦参碱衍生物：13-羰基氧化苦参碱，具有式Ⅸ结构：

一种具有12位羰基取代的氧化苦参碱衍生物：12-羰基氧化苦参碱，具有式Ⅹ结构：

本发明还提供了上述苦参碱与氧化苦参碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)发酵培养微生物，向培养基中加入苦参碱或氧化苦参碱接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为小克银汉霉(Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，共头霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)属的菌株；2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣；3)将所述转化物残渣以凝胶柱纯化，收集合并组分；4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，优选制备条件为半制备用色谱柱Kromasil 100-5-NH2，5μm，10.0×250mm(Sweden)，甲醇-水(80:20，V/V)，流速3.0mL/min，检测波长220nm得到结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的化合物。

其中，微生物优选为小克银汉霉(Cunninghamella)属菌株，更优选短刺小克银汉霉。上述方法步骤1)中培养基中苦参碱与氧化苦参碱的浓度为2-2000μg/mL。

上述方法步骤2)中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选二氯甲烷。

本发明的另一目的是提供本发明人参三醇衍生物式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的化合物的用途。

本发明通过实验证实，本发明的苦参碱与氧化苦参碱衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。

这些抗肿瘤药物的活性成分可以是选自结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的化合物中的一种或几种。

在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明利用微生物转化技术，对苦参碱与氧化苦参碱成功地进行了结构修饰，获得了一类新的苦参碱与氧化苦参碱衍生物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

图1为本发明所述苦参碱衍生物的HPLC液相色谱图。

图2为本发明所述氧化苦参碱衍生物的HPLC液相色谱图。

具体实施方式

实施例1、结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的化合物的制备

本发明采用微生物转化方法，分别以苦参碱与氧化苦参碱为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括：小克银汉霉(Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，共头霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)属的微生物；其中转化能力较强的是小克银汉霉(Cunninghamella)属的菌株。这些菌株均可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)或中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心(CICC)，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。真菌培养基选用马铃薯培养基，细菌培养基选用LB培养基。

马铃薯培养基的配制(PDA培养基)：取200g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中，煮沸后80℃保温1h。用双层纱布过滤后取滤液，加入20g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000mL。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3％琼脂。

以短刺小克银汉霉Cunninghamella blaksleana AS 3.970为例，制备结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的化合物的过程如下：

1)发酵、转化以及萃取

将短刺小克银汉霉Cunninghamella blaksleana AS 3.970接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，分别以苦参碱或氧化苦参碱为反应底物，向每个摇瓶中加入20mg苦参碱或氧化苦参碱(0.2mL，100mg/mL无水乙醇溶液)，共用500mg苦参碱或500mg氧化苦参碱。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的二氯甲烷萃取3次，萃取液减压浓缩至干，各得到转化物残渣约1.6g。

2)凝胶柱纯化

分别将所得苦参碱或氧化苦参碱转化物残渣溶于少量甲醇，加至装有100g LH-20凝胶的色谱柱顶，用甲醇洗脱，收集洗脱组分，分别采用TLC分析方法(硅胶G薄层板，二氯甲烷–甲醇(10:1)展开，碘-碘化钾溶液喷雾显色)将所得到的相似洗脱组分合并。

3)高效液相色谱纯化

合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱Kromasil 100-5-NH2，5μm，10.0×250mm(Sweden)，甲醇-水(80:20，V/V)，流速3.0mL/min，检测波长220nm。得到结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ5个苦参碱转化产物，色谱图如图1所示，以及式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ5个氧化苦参碱转化产物，色谱图如图2所示。

化合物Ⅰ，13-羟基苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)265.1924[M+H]⁺(calculated>15H₂₅N₂O₂,[M+H]⁺,265.1916)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅱ，13,14-二羟基苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)281.1817[M+Na]⁺(calculated>15H₂₅N₂O₃,[M+Na]⁺,281.1865)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅲ，12-羟基苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)265.1926[M+Na]⁺(calculated>15H₂₅N₂O₂,[M+Na]⁺,265.1916)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅳ，13-羰基苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)263.1767[M+Na]⁺(calculated>15H₂₃N₂O₂,[M+Na]⁺,263.1759)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅴ，12-羰基苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)263.1765[M+Na]⁺(calculated>15H₂₃N₂O₂,[M+Na]⁺,263.1759)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅵ，13-羟基氧化苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)281.1869[M+Na]⁺(calculated>15H₂₅N₂O₃,[M+Na]⁺,281.1865)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅶ，13,14-二羟基氧化苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)297.1818[M+Na]⁺(calculated>15H₂₅N₂O₄,[M+Na]⁺,297.1814)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅷ，12-羟基氧化苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)281.1817[M+Na]⁺(calculated>15H₂₅N₂O₃,[M+Na]⁺,281.1865)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅸ，13-羰基氧化苦参碱，，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)279.1714[M+Na]⁺(calculated>15H₂₃N₂O₃,[M+Na]⁺,279.1709)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

化合物Ⅹ，12-羰基氧化苦参碱，白色无定形粉末：HR-ESI-MS(m/z)279.1713[M+Na]⁺(calculated>15H₂₃N₂O₃,[M+Na]⁺,279.1709)。其¹³C-NMR数据如表1所示。

表1.式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的碳谱数据(CDCl₃)

Position式Ⅰ式Ⅱ式Ⅲ式Ⅳ式Ⅴ式Ⅵ式Ⅶ式Ⅷ式Ⅸ式Ⅹ257.657.557.557.557.568.268.268.168.368.3321.321.321.321.321.317.117.217.117.217.2427.127.127.127.127.026.126.127.026.026.0535.435.335.335.335.234.534.534.634.624.5663.863.863.963.863.866.766.766.766.766.7742.442.442.242.242.442.442.442.442.042.3826.226.226.326.226.224.424.424.424.424.3920.720.720.620.720.717.117.217.217.117.21057.357.457.457.457.469.369.369.369.269.31152.752.165.252.365.252.752.165.252.365.21242.141.575.241.6211.442.141.675.241.6211.61367.369.134.2210.234.267.369.134.2210.234.21447.071.531.545.331.646.971.531.545.331.615169.8170.2169.5169.3168.9169.8170.2169.3169.3168.91743.443.443.243.343.343.443.443.343.343.3

以上结果表明，所得化合物结构正确。

实施例2本发明结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ、式Ⅶ、式Ⅷ、式Ⅸ和式Ⅹ的化合物抗肿瘤活性。

1)实验材料

仪器与试剂：CO₂培养箱(Jouan>

测试用肿瘤细胞株：Hela细胞(人宫颈癌细胞)、K562细胞(人白血病细胞)、K562/ADR细胞(人白血病耐药细胞)、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)、Du-145(人前列腺癌细胞)、HePG2细胞(人肝癌细胞)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)，购于中国医学科学院肿瘤研究所。

测试样品：实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–Ⅹ，纯度在90％以上；同时，选取顺铂为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

2)实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC₅₀值：取对数生长期的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPM>5/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入RPM>2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0..1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定570nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS>50)。

3)实验结果

根据MTT法测试结果，计算本发明化合物Ⅰ–Ⅹ对上述细胞的IC₅₀值，结果如表2所示。

表2.测试样品体外细胞毒活性筛选结果

结果表明，本发明的化合物Ⅰ–Ⅹ具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分。