一种蝴蝶兰脱毒及快繁技术

摘要

本发明涉及蝴蝶兰种苗繁育技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰脱毒快繁方法。本发明通过摸索初代培养，茎尖伸长培养，脱毒培养，壮苗、生根培养，获得一套利用物理方法结合化学试剂进行二次蝴蝶兰脱毒的方法及快繁途径。创新点在于摸索出茎尖伸长培养的方法、生长点切取大小结合化学试剂提高成活率及脱毒率、二次脱毒提高脱毒率的方法，建立了蝴蝶兰脱毒及快繁途径。该方法具有成活率、脱毒率高的优点，成活率达80.13％，脱毒率达92.67％，具有很好的技术效果和推广前景。

说明书

(一)技术领域：

本发明涉及蝴蝶兰种苗繁育技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰脱毒快繁方法。

(二)背景技术：

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp)属热带或亚热带的气生兰，又称蝶兰，因其姿态优美、色泽艳丽、花期持久，素有“兰花皇后”之美称,是室内绿化美化重要的观赏花卉,国内外市场对其需求量大。蝴蝶兰的病毒病是当今困扰兰界的一大难题。

目前，在蝴蝶兰上分离到的病毒超过25种，其中危害最重、分布最广的是建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)。感病植株主要造成花叶、坏死、畸形、花瓣变形等症状,导致植株生长不良，花小而少,花期缩短,严重影响其观赏价值和经济价值。而国内关于蝴蝶兰脱毒的研究中成活率不高于30％，脱毒率不高于80％，因此，研究一种成活率高、脱毒效果好，操作简便的方法有着重要的现实意义。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种蝴蝶兰脱毒及快繁技术，它包括以下几个步骤：

1)材料的选择及初代培养：

选用生长健壮、开花3-5朵、经检测后携带病毒的蝴蝶兰开花株，切取花梗，3-5cm一节，每节包含1-2个饱满腋芽，在超净工作台上用75％的酒精表面消毒30-40s，再用用0.1％的HgCl₂震荡消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，用尖头镊剥去腋芽苞叶，再0.1％的HgCl₂震荡消毒2-3min，用无菌水冲洗5-8次，切除受HgCl₂毒害的两端，接种于50mL诱导培养基上先暗培养7-10天，后转入光照培养2-3个月，待两片真叶展开形成丛生芽即可；

所述的诱导培养基为1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8；

光照培养时，培养条件为：温度25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时长8-10小时/天；

2)茎尖伸长培养：

将步骤1)所诱导出的展叶的丛生芽转入50ml促茎尖伸长培养基，培养40-60天，待第三片或第四片叶成熟即可，得幼苗；

促茎尖伸长培养基为：1/3MS+GA₃1～2mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0～6.5g/L，pH5.4～5.8；

培养条件为：温度25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时长8～10小时/天；

3)第一次脱毒培养：

将步骤2)获得的幼苗，置于10X的冷光源解剖镜下用解剖针剥取一个微凸、穹形、发亮的生长点，迅速切下置于30mL脱毒培养基表面，进行暗培养7-15天后转入光培养2-3个月，中间可进行1-2次转接，防褐化死亡，每瓶培养基可接种3-5个含生长点的茎尖，茎尖切取大小为1-2mm，留取1个叶原基；

脱毒培养基为：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.2-0.3mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8；

培养条件为：温度25±2℃，光照强度为1000～1500lx，光照时长8～10小时/天；

4)第二次脱毒培养：

将步骤3)获得的脱毒茎尖，待其长出1或2片成熟小叶后，进行二次脱毒培养，10X冷光源解剖镜下剥取1-2mm大小生长点后，迅速接于30mL脱毒培养基表面，每瓶培养基接种3-5含生长点的茎尖，进行暗培养7-15天后转入光照培养2-3个月，每月进行一次转接，更换培养基，防止褐化死亡。

脱毒培养基为：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.2mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8；

培养条件为：温度25±2℃，光照强度为1000～1500lx，光照时长8～10小时/天；

5)脱毒苗的增殖培养：

将步骤4)获得的脱毒苗，检测后进行增殖培养，切除叶片及褐化部分接于盛100mL培养基的兰花瓶，每瓶接种5株(待数量增大以后，视生产情况可增至21-35株/瓶)；培养2-3个月后，生长健壮，增殖系数达2-4，即得脱毒分化苗；

增殖培养基为：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3-5mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8；

培养条件同1)。

6)脱毒苗的壮苗培养：

待步骤5)获得的脱毒分化苗长至株高2-3cm，两叶一心后转入盛120mL壮苗培养基的兰花瓶后进行壮苗培养，每瓶转接16株；培养45-60天后，株高达3-5cm，两叶一心壮苗完成。

壮苗培养基为：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。

培养条件:温度25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时长8～10小时/天；

7)脱毒苗的生根培养：

将步骤6)获得的壮苗后植株，接于150mL生根培养基的兰花瓶中进行生根培养，每瓶转接11-13株；培养3-4个月后，待植株长至3-4片叶，根系达3条以上，健壮有活力，即可移入温室驯化移栽。

生根培养基：1/2MS+NAA1.0mg/L+香蕉30g/L+土豆40g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。

培养条件:温度25±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时长8～10小时/天。

本发明通过摸索初代培养，茎尖伸长培养，脱毒培养，壮苗、生根培养，获得一套利用物理方法结合化学试剂进行二次蝴蝶兰脱毒的方法及快繁途径。创新点在于摸索出茎尖伸长培养的方法、生长点切取大小结合化学试剂提高成活率及脱毒率、二次脱毒提高脱毒率的方法，建立了蝴蝶兰脱毒及快繁途径。该方法具有成活率、脱毒率高的优点，成活率达80.13％，脱毒率达92.67％，具有很好的技术效果和推广前景。

具体实施方式

实施例1

所述的蝴蝶兰脱毒及快繁技术，具体步骤如下：

第一、选用生长健壮、开花3-5朵、经检测后携带病毒的的蝴蝶兰开花株，切取花梗截段3cm/节，每节1个饱满腋芽。75％的酒精表面消毒30s，0.1％的HgCl₂震荡消毒8min(外植体表面震荡后无气泡为止)，无菌水冲洗3次，用尖头镊剥去腋芽苞叶，再0.1％的HgCl₂震荡消毒3min，用无菌水冲洗5次，切除受HgCl₂毒害的两端，接种于诱导培养基上进行诱导培养。

第二、将展叶的丛生芽，分株接于促茎尖伸长培养基，培养45天后，第三片叶成熟。促茎尖伸长培养基为：1/3MS+GA₃1.0mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。培养条件同1)。

第三、将幼苗切除叶片后，置于10X的冷光源解剖镜下用解剖针剥取茎尖，快速切下置于脱毒培养基表面，进行暗培养7天后转入光培养2个月，中间进行1次转接。每个培养基可接种4个茎尖，茎尖切取大小为1.0mm，留取1个叶原基。脱毒培养基为：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.2mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。待长出两片叶片后，进行二次脱毒。

第四、无毒检测后将无毒苗进行增殖培养。增殖培养基为：

1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培养条件同1)。

第五、待脱毒分化苗长至株高2-3cm，两叶一心后进行壮苗培养，壮苗培养基为：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培养条件同1)。

第六、待壮苗植株长至株高3-5cm，两叶一心后进行生根培养，培养3-4个月后，植株长至3-4片叶，根系达3条以上，健壮有活力，即可移入温室驯化移栽。

实施例1中蝴蝶兰启动培养中二次消毒成活率为89.7％，较一次性消毒成活率81％，提高10.7％。茎尖脱毒60天后，成活率达64.74％，脱毒率达94％。

实施例2

所述的蝴蝶兰脱毒及快繁技术，具体步骤如下：

第一、选用生长健壮、开花3-5朵、检测后携带病毒的的蝴蝶兰开花株，切取花梗截段4cm/节，每节1个饱满腋芽。75％的酒精表面消毒30s，0.1％的HgCl₂震荡消毒9min(外植体表面震荡后无气泡为止)，无菌水冲洗3次，用尖头镊剥去腋芽苞叶，再0.1％的HgCl₂震荡消毒2min，用无菌水冲洗5次，切除受HgCl₂毒害的两端，接种于诱导培养基上进行丛生芽诱导培养。

第二、将展叶的丛生芽，分株接于促茎尖伸长培养基，培养50天后，第三片叶成熟。促茎尖伸长培养基为：1/3MS+GA₃1.5mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。培养条件同1)。

第三、将幼苗切除叶片后，置于10X的冷光源解剖镜下用解剖针剥取茎尖，快速切下置于脱毒培养基表面，进行暗培养7天后转入光培养2个月，中间进行1次转接。每个培养基可接种4个茎尖，茎尖切取大小为1.5mm，留取1个叶原基。脱毒培养基为：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.25mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。待长出两片叶片后，进行二次脱毒。

第四、无毒检测后将无毒苗进行增殖培养。增殖培养基为：

1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培养条件同1)。

第五、待脱毒分化苗长至株高2-3cm，两叶一心后进行壮苗培养，壮苗培养基为：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培养条件同1)。

第六、待壮苗植株长至株高3-5cm，两叶一心后进行生根培养，培养3-4个月后，植株长至3-4片叶，根系达3条以上，健壮有活力，即可移入温室驯化移栽。

实施例2中蝴蝶兰启动培养中二次消毒成活率为93％，较一次性消毒成活率81％，提高14.8％。茎尖脱毒60天后，成活率达68.74％，脱毒率达93.1％。

实施例3

所述的蝴蝶兰脱毒及快繁技术，具体步骤如下：

第一、选用生长健壮、开花3-5朵、检测后携带病毒的的蝴蝶兰开花株，切取花梗截段5cm/节，每节2个饱满腋芽。75％的酒精表面消毒30s，0.1％的HgCl₂震荡消毒10min(外植体表面震荡后无气泡为止)，无菌水冲洗3次，用尖头镊剥去腋芽苞叶，再0.1％的HgCl₂震荡消毒3min，用无菌水冲洗5次，切除受HgCl₂毒害的两端，接种于诱导培养基上进行丛生芽诱导培养。

第二、将展叶的丛生芽，分株接于促茎尖伸长培养基，培养50天后，第三片叶成熟。促茎尖伸长培养基为：1/3MS+GA₃2.0mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。培养条件同1)。

第三、将幼苗切除叶片后，置于10X的冷光源解剖镜下用解剖针剥取茎尖，快速切下置于脱毒培养基表面，进行暗培养7天后转入光培养2个月，中间进行1次转接。每个培养基可接种4个茎尖，茎尖切取大小为2.0mm，留取1个叶原基。脱毒培养基为：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.3mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。待长出两片叶片后，进行二次脱毒。

第四、无毒检测后将无毒苗进行增殖培养。增殖培养基为：

1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培养条件同1)。

第五、待脱毒分化苗长至株高2-3cm，两叶一心后进行壮苗培养，壮苗培养基为：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培养条件同1)。

第六、待壮苗植株长至株高3-5cm，两叶一心后进行生根培养，培养3-4个月后，植株长至3-4片叶，根系达3条以上，健壮有活力，即可移入温室驯化移栽。

实施例3中蝴蝶兰启动培养中二次消毒成活率为93.2％，较一次性消毒成活率81％，提高15.1％。茎尖脱毒60天后，成活率达76.74％，脱毒率达87.3％。

结论：通过使用本发明进行蝴蝶兰脱毒及快繁时，在蝴蝶兰启动培养中成活率、脱毒成活率、脱毒成功率都较高。脱毒后的蝴蝶兰在后期养护过程中，发病率较低，花朵较大，花期长，不易落苞，叶片褪绿、畸形现象改善，大大提高了其观赏价值及经济价值。