鬼臼毒素在激活BMP信号通路中的用途

摘要

本发明提供了鬼臼毒素在激活BMP信号通路中的用途。本发明通过荧光素酶活性筛选发现，鬼臼毒素对hID1(human ID1)和SBE(Smad‑binding element)有显著的激活作用，EC50分别为：88nM和14nM。在原代人骨髓间充质干细胞成骨实验检测，发现鬼臼毒素最低4nM即可有促进碱性磷酸酶的活性。因此，鬼臼毒素能够用于制备治疗成骨分化相关疾病的药物，具有良好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及鬼臼毒素的新用途，特别是鬼臼毒素在制备促进成骨分化药物中的新用途。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是转化因子(transforming growth factor，TGF-β)超家族的成员之一，是非常重要的促进骨形成和诱导成骨细胞分化的细胞外信号分子。BMPs可结合并激活靶细胞膜上的特异性受体，通过Smads传递特异性信号。当BMP激活Smads后，激活的Smads可将TGF-β信号从细胞膜转至细胞核，进而诱导核内成骨基因表达。ID1是细胞增殖和分化的关键调控蛋白，是BMP/Smads信号通路的直接靶基因。因此ID1及Smads蛋白的变化是检测BMP信号通路的重要手段。

骨形成蛋白-2(BMP-2)是调控成骨细胞分化最重要的介导因子之一，也是FDA认证可用于临床治疗骨缺损的蛋白质，但是BMP-2的临床应用有很大局限性，如：半衰期短、容易降解，成本高，有一定的副作用等。因此，近年来，越来越多的研究关注发展小分子药物用于骨修复或骨损伤的治疗。

鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物——华鬼臼(又称鸡苔素)的根和茎中提取到的木脂类化合物，前期的研究侧重于其抗肿瘤和抗病毒生物活性。鬼臼毒素的膏剂和酊剂临床上用于疱疹病毒、尖锐湿疣等；其衍生物依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)是临床上常用的抗癌药。目前没有鬼臼毒素用于治疗骨质疏松症，骨折愈合，骨损伤修复等相关疾病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的小分子药物，用于骨修复或骨损伤的治疗。

为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

鬼臼毒素在制备BMP信号通路激活剂中的应用。

进一步地，所述的鬼臼毒素能够激活BMP信号通路中的ID1及Smads蛋白。

鬼臼毒素在制备人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性促进剂中的应用。

鬼臼毒素在制备促进成骨分化药物中的应用。

鬼臼毒素在制备治疗成骨分化相关疾病的药物中的应用。

进一步地，所述的成骨分化相关疾病为骨质疏松症，骨折愈合或骨损伤修复。

本发明还提供了一种治疗成骨分化相关疾病的药物，其特征在于，由鬼臼毒素组成或含有鬼臼毒素和至少一种载体。

进一步地，所述的治疗成骨分化相关疾病的药物的剂型为溶剂、稀释剂、片剂、胶囊、可分散粉末或颗粒剂。

所述的鬼臼毒素的结构式如(I)所示：

本发明涉及的鬼臼毒素在制备治疗成骨分化相关药物中的用途属于首次公开，由高通量筛选发现，不存在其他化合物给出任何启示的可能。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过荧光素酶活性筛选发现，鬼臼毒素对hID1(human ID1)和SBE(Smad-binding element)有显著的激活作用，EC50分别为：88nM和14nM。在原代人骨髓间充质干细胞成骨实验检测，发现鬼臼毒素最低4nM即可有促进碱性磷酸酶的活性。因此，鬼臼毒素能够用于制备治疗成骨分化相关疾病的药物，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为实施例1中的高通量筛选结果图。

图2为实施例2中的化合物浓度梯度检测图；图2A Human ID1，图2B Smads。

图3为实施例3中的成骨分化标志物碱性磷酸酶活性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：高通量筛选评价化合物

1、化合物的配制：

小分子化合物库为申请人所有，储存在100％二甲基亚砜中，浓度为1mM。

2、实验材料：

Free-Style 293-F细胞悬浮培养表达系统购自Invitrogen公司，包括Free-Style 293-F细胞(货号R790-07)、转染试剂293fectin(货号12347500)、培养液Free-Style 293Expression Medium(货号：12338001)。

荧光素酶报告基因检测试剂盒neolite Reporter Gene Assay System购自PerkinElmer公司，货号6016711。

质粒pGL4.33Luc2P/hID-1购自Promega。

Opti-MEM购自Thermo Fisher公司，货号11058021。

96孔细胞培养板购自PerkinElmer公司，货号005182。

荧光素酶检测试剂盒购自Promega，货号：E2510。

Envision酶标仪，购自PerkinElmer公司。

3、实验方法：

步骤1：pGL4.33Luc2P/hID-1质粒瞬转293F细胞的方法为：

转染前将细胞密度调整为1×10⁶个/mL，且吹散使细胞无结团，采用锥虫蓝染色测定细胞存活率需＞95％。

转染步骤：分别将100微克pGL4.33Luc2P/hID-1质粒及200微升Free-Style293-F细胞脂质体转染试剂293fectin用Opti-MEM稀释至3.33毫升，静置5min后将上述质粒与转染试剂缓慢混合，室温反应20min，形成DNA-fectin混合物后加入93.3mL Free-Style293-F细胞(密度1×10⁶个/毫升)中至终体积为100mL，在37℃、8％CＯ₂和200rpm/min的条件下摇瓶培养。

步骤2：化合物对转染后h1D1/293F活性的测定及筛选

转染后的细胞24h后进行96孔板铺板，1x10⁴/孔，99微升/孔。种板后将待筛选化合物及DMSO对照加入96孔板中，1微升/孔(化合物筛选工作浓度10uM)。加入化合物24小时后利用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测待测化合物活性，具体步骤参见操作说明书，使用前将试剂平衡至室温，底物及底物溶解缓冲液按照1∶1进行溶解，溶解后轻柔混匀室温静置5min。将检测试剂与细胞培养上清按照1∶1加入96孔待检测孔板中，充分混匀后15min～25min后在Envision酶标仪下进行化学发光检测。

4、实验结果：

如图1所示，筛选结果显示鬼臼毒素(12D8，图中方框标示)在10uM浓度下可以显著激活BMP信号通路报告基因human ID1活性。

实施例2：BMP信号通路激活浓度梯度检测

1、化合物的配制：

将鬼臼毒素(12D8)溶于二甲基亚砜，起始浓度点为100uM，作3倍浓度梯度稀释，10个浓度点，浓度分别为100uM、33.3uM、11.1uM、3.7uM、1.23uM、0.41uM、0.137uM、45.6nM、15.23nM、5.07nM，对照组为等体积的二甲基亚砜。

2、实验材料：

Free-Style 293-F细胞悬浮培养表达系统购自Invitrogen公司，包括Free-Style 293-F细胞(货号R790-07)、Free-Style 293-F细胞脂质体转染试剂293fectin(货号12347500)、培养液Free-Style 293Expression Medium(货号：12338001)。

荧光素酶报告基因检测试剂盒neolite Reporter Gene Assay System购自PerkinElmer公司，货号6016711。

质粒pGL4.33Luc2P/hID-1购自Promega。

Opti-MEM购自Thermo Fisher公司，货号11058021。

96孔细胞培养板购自PerkinElmer公司，货号005182。

荧光素酶检测试剂盒购自Promega，货号：E2510。

Envision酶标仪，购自PerkinElmer公司。

pGL4 33luc2P SRE质粒(购自Promega)。

3、实验方法：

步骤1：转染前将细胞密度调整为1×10⁶个/mL，且吹散使细胞无结团，采用锥虫蓝染色测定细胞存活率需＞95％。

转染步骤：分别将100微克pGL4.33Luc2P/hID-1质粒或者pGL4 33luc2P SRE质粒及200微升Free-Style 293-F细胞脂质体转染试剂293fectin用Opti-MEM稀释至3.33毫升，静置5min后将上述质粒与转染试剂缓慢混合，室温反应20min，形成DNA-fectin混合物后加入93.3mL Free-Style293-F细胞(密度1×10⁶个/毫升)中至终体积为100mL，在37℃、8％CO₂和200rpm/min的条件下摇瓶培养。

转染后的细胞24h后进行96孔板铺板，1x10⁴/孔，99微升/孔。

步骤2：24小时后加入用不同浓度梯度的化合物(浓度参见化合物配置)或者加入对照分子人源BMP2分子(购自Sigma公司，货号H4791-10UG)1微升于细胞上清，加入化合物24小时后利用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测待测化合物活性，具体步骤参见操作说明书，使用前将试剂平衡至室温，底物及底物溶解缓冲液按照1∶1进行溶解，溶解后轻柔混匀室温静置5min。将检测试剂与细胞培养上清按照1∶1加入96孔待检测孔板中，充分混匀后15min～25min后在Envision酶标仪下进行化学发光检测。

3、实验结果：

如图2所示，Human ID1的上调表达和Smads的上调表达都是BMP信号通路激活的标志基因。经过化合物浓度梯度检测，鬼臼毒素(12D8)对hID1基因(human ID1)和SBE(Smad-binding element)基因都有显著的激活作用，EC₅₀分别为：88nM(附图2A)和14nM(附图2B)。

实施例3：成骨分化标志物碱性磷酸酶活性检测

1、化合物的配制：

将鬼臼毒素(12D8)溶于二甲基亚砜，起始浓度点为10uM，作2倍浓度梯度稀释，8个浓度点，对照组为等体积的二甲基亚砜。

2、实验材料：

α-MEM培养液购自Thermo Fisher，货号11095-072。

普通试剂抗坏血酸、β-磷酸甘油和地塞米松等购自Sigma公司。

DEA溶液(50mmol/L甘氨酸和1mmol/L氯化镁，pH 10.5)，甘氨酸和氯化镁购自国药集团。

PNPP溶液购自Sigma-Aldrich，货号：N7653。

BCA试剂溶液A购自Pierce公司，货号#23228。

BCA溶液B购自Pierce公司，货号#185907。

Envision酶标仪，购自PerkinElmer公司。

人源骨髓间充质干细胞(hBMSC)由上海交通大学医学院骨科实验室提供，干细胞的采集系患者在知情的情况下自愿捐赠，并经上海交通大学伦理委员会批准。捐赠的患者为骨不愈合患者或骨折患者，无感染，未使用激素及抗生素类药物。

3、实验方法：

2个患者的人源骨髓间充质干细胞(hBMSC)培养在含有成骨诱导培养基(在每孔200微升α-MEM培养液中添加50微摩尔抗坏血酸，10毫摩尔β-磷酸甘油和100纳摩尔地塞米松)的96孔板中，每孔10⁴个细胞，加入2微升不同浓度梯度的鬼臼毒素，4天后用0.25％的胰酶消化细胞并通过三次反复冻融裂解细胞。

裂解的细胞在4摄氏度12000rpm下离心10分钟后去掉沉淀。

检测相对碱性磷酸酶活性：

(1)96孔板内每孔加入100微升DEA溶液(50mmol/L甘氨酸和1mmol/L氯化镁，pH 10.5)，加入50微升细胞裂解上清，和50微升的PNPP溶液，37摄氏度孵育15分钟，随后加入100微升浓度为1当量的氢氧化钠溶液终止反应，采用Envision酶标仪上于405nm检测光吸收，获得的数据作为孔内碱性磷酸酶活性的指标。

(2)BCA法用于检测蛋白含量，200微升BCA试剂溶液A，加入20微升细胞裂解液上清和4微升的溶液B，于37摄氏度孵育30分钟，Envision酶标仪上562nm检测光吸收。

将步骤(1)中405nm处检测到的光吸收数据与步骤(2)中562nm处检测到的光吸收数据的比值作为单位蛋白含量内相对碱性磷酸酶活性的值。

4、实验结果：

如图3所示，与对照OM组相比，不同浓度梯度的鬼臼毒素(12D8)可以促进干细胞成骨分化标志物人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的表达及活性上升。在本实验中观察到4nM鬼臼毒素即可促进碱性磷酸酶表达，与对照组有明显区别。