一种怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖方法。本发明以怀集报春苣苔肥嫩叶片为外植体，在不定芽的诱导、丛生芽繁殖、壮苗生根和移栽等各阶段，选择适合怀集报春苣苔丛生芽诱导、繁殖、生根、移栽等各培养阶段的培养基配方和培养条件，实现怀集报春苣苔种苗的组织培养和快速繁殖，可在较短时间内繁育出大量优质种苗，其具有遗传稳定性高，出苗快，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等特点，为满足该物种的迁地保育与引种回归研究和资源开发利用提供优质种苗，实现怀集报春苣苔的资源保护和可持续利用。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养和快速繁殖技术领域，具体涉及一种怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖方法。

背景技术

怀集报春苣苔(Primulina huaijiensis Z.L.Ning&J.Wang)，是苦苣苔科报春苣苔属多年生草本，于2010年发现于广东省怀集县一个孤立喀斯特小石灰山洞穴内，2013年正式命名为怀集报春苣苔发表。怀集报春苣苔目前仅有一个野生分布居群，约200株，位于怀集县一个村庄附近。因其数量稀少，生境极易受到人为干扰破坏，属珍稀濒危植物；另外，其花冠上唇裂片具有2膜状附属物结构，是目前苦苣苔科植物中唯一具有这一形态特征的物种，该种对于开展报春苣苔属植物分类学、喀斯特特殊生境植物的起源演化等方面的研究具有重要意义。同时，怀集报春苣苔株型紧凑，叶形优美，叶片肉质并有银白色脉纹，具有较高的观赏价值和独特的耐荫性，适合作室内盆栽观赏，极有开发利用前景。

怀集报春苣苔自然条件下不结实，需昆虫或人工授粉，种子发芽率较低；而扦插繁殖速度慢，繁殖系数低，也会破坏极其珍贵的野生资源。

目前，国内外尚未有怀集报春苣苔的组织培养和种苗繁殖的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖方法。

本发明的怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖方法，包括以下步骤：

a.外植体的消毒和初代诱导培养：取怀集报春苣苔叶片为外植体，清洗消毒后，将叶片切成0.5～1.0cm×1.0～2.0cm小块，接种于初代诱导培养基上培养，诱导芽的形成，得到萌发幼芽的愈伤组织；所述的初代诱导培养基为：每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.5mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5；

b.芽的诱导和继代增殖：将萌发幼芽的愈伤组织切割成只带3～4个芽的小块，接种于增殖培养基上培养，诱导丛生芽的形成，得到继代培养苗；所述的增殖培养基为：每升含有6-BA 0.1～0.5mg、NAA 0.05～0.5mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5；

c.壮苗和生根培养：待继代培养苗长到3～4个叶片时，将继代培养苗切分出来接种到壮苗培养基上培养壮苗，然后转入生根培养基上培养，得到生根苗；所述的壮苗培养基为：每升含有活性炭0～2g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5；所述的生根培养基为：每升含有NAA 0.1～0.5mg、活性炭0～2g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH为6.5；

d.试管苗移栽：当生根苗长至7-8片叶子时，进行炼苗，然后洗掉生根苗根部培养基，栽入移栽基质中，置于遮阴、湿润的环境下培养；所述的移栽基质是将泥炭土和珍珠岩按体积比2:1混合均匀得到的；

所述的步骤a、b和c的培养条件均为：温度25±2℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d。

所述的步骤a的清洗消毒，是将叶片用洗洁精漂洗20min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％乙醇溶液浸泡30s，质量分数0.1％HgCl₂溶液消毒4～5min，用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水分。

所述的步骤d的炼苗，是把盖有瓶塞的培养瓶中的生根苗放置于阴棚里培养2-3d，然后打开瓶塞又继续培养3-4d。

优选，所述的初代诱导培养基为：每升含有6-BA>

优选，所述的增殖培养基为：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。

优选，所述的生根培养基为：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH为6.5。

所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法可参考书籍(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)，所述的1/2MS是将MS中的大量元素浓度减半，而其他成分浓度不变而形成的培养基。

本发明以怀集报春苣苔肥嫩叶片为外植体，在不定芽的诱导、丛生芽繁殖、壮苗生根和移栽等各阶段，选择适合怀集报春苣苔丛生芽诱导、繁殖、生根、移栽等各培养阶段的培养基配方和培养条件，实现怀集报春苣苔种苗的组织培养和快速繁殖，可在较短时间内繁育出大量优质种苗，为满足该物种的迁地保育与引种回归研究和资源开发利用提供优质种苗，实现怀集报春苣苔的资源保护和可持续利用。

本发明能成功地进行怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖，此发明生产出的怀集报春苣苔种苗具有遗传稳定性高，出苗快，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等特点。本发明方法投入少，产出高等优势，是利用植物组织细胞的全能性和植物组织培养等生物技术进行喀斯特特殊生境植物优质种苗的快速繁殖，具有操作简单实惠，切实可行，应用价值高等特点。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.外植体的消毒和初代诱导培养：在生长季节剪取怀集报春苣苔肥厚的嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗20min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％乙醇溶液浸泡30s，质量分数0.1％HgCl₂溶液消毒4min，用无菌水漂洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分后，将叶片切成1.0cm×2.0cm小块，接种于初代诱导培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。培养30d左右切块周围开始长愈伤组织并有少许芽萌发。继续培养38d左右愈伤组织上萌发很多幼芽。消毒成功率85％。所述的初代诱导培养基为：每升含有6-BA>

2.芽的诱导和继代增殖：将大量萌发幼芽的愈伤组织切割成只带3～4个芽的小块，接种于增殖培养基上培养，能促使丛生芽的形成，培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。继代周期为35d，增殖系数为3.8，由此得到继代培养苗。所述的增殖培养基为：每升含有6-BA 0.1mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。

3.壮苗和生根培养：待继代培养苗长到3～4个叶片时，将幼苗切分出来接种到壮苗培养基上培养40d，然后转入生根培养基上培养30d；培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。幼苗生长健壮，产生大量根，生根率高达97％，由此得到生根苗。所述的壮苗培养基为：每升含有活性炭2.0g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。所述的生根培养基为：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2.0g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH为6.5。

4.试管苗移栽：当生根苗长至7-8片叶子时，把盖有瓶塞的培养瓶中的生根苗放置于阴棚里2-3d，然后打开瓶塞又继续放3-4d后，用镊子把生根苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土:珍珠岩＝2：1(v/v)的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达92％。

实施例2：

1.外植体的消毒和初代诱导培养：在生长季节剪取怀集报春苣苔肥厚的嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗20min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％乙醇溶液浸泡30s，质量分数0.1％HgCl₂溶液消毒5min，用无菌水漂洗6次，用无菌滤纸吸干表面水分后，将叶片切成0.5cm×1.0cm小块，接种于初代诱导培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。培养19d左右切块周围开始长愈伤组织并有少许芽萌发。继续培养27d左右愈伤组织上萌发大量幼芽。消毒成功率85％。所述的初代诱导培养基为：每升含有6-BA>

2.芽的诱导和继代增殖：将大量萌发幼芽的愈伤组织切割成只带3～4个芽的小块，接种于增殖培养基上培养，能促使丛生芽的形成，培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。继代周期为35d，增殖系数为6，由此得到继代培养苗。所述的增殖培养基为：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。

3.壮苗和生根培养：待继代培养苗长到3～4个叶片时，将幼苗切分出来接种到壮苗培养基上培养40d，然后转入生根培养基上培养30d；培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。幼苗生长健壮，产生大量根，生根率达94％，由此得到生根苗。所述的壮苗培养基为：每升含有活性炭2.0g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。所述的生根培养基为：每升含有NAA 0.5mg、活性炭2.0g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH为6.5。

4.试管苗移栽：当生根苗长至7-8片叶子时，把盖有瓶塞的培养瓶中的生根苗放置于阴棚里2-3d，然后打开瓶塞又继续放3-4d后，用镊子把生根苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土:珍珠岩＝2：1(v/v)的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达92％。

实施例3：

1.外植体的消毒和初代诱导培养：在生长季节剪取怀集报春苣苔肥厚的嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗20min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％乙醇溶液浸泡30s，质量分数0.1％HgCl₂溶液消毒4min，用无菌水漂洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分后，将叶片切成1.0cm×2.0cm小块，接种于初代诱导培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。培养22d左右切块周围开始长愈伤组织并有少许芽萌发。继续培养30d左右愈伤组织上萌发很多细小幼芽。消毒成功率85％。所述的初代诱导培养基：每升含有6-BA>

2.芽的诱导和继代增殖：将大量萌发幼芽的愈伤组织切割成只带3～4个芽的小块，接种于增殖培养基上培养，能促使丛生芽的形成，培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。继代周期为35d,增殖系数为3.1，由此得到继代培养苗。所述的增殖培养基：每升含有6-BA 0.5mg、NAA 0.5mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。

3.壮苗和生根培养：待继代培养苗长到3～4个叶片时，将幼苗切分出来接种到壮苗培养基上培养40d，然后转入生根培养基上培养30d；培养温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。幼苗生长弱小，产生大量根，生根率达91％，由此得到生根苗。所述的壮苗培养基为：每升含有蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5。所述的生根培养基为：每升含有NAA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH为6.5。

4.试管苗移栽：当生根苗长至7-8片叶子时，把盖有瓶塞的培养瓶中的生根苗放置于阴棚里2-3d，然后打开瓶塞又继续放3-4d后，用镊子把生根苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土:珍珠岩＝2：1(v/v)的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达92％。

以上的三个实施例均能实现较好的怀集报春苣苔组织培养和快速繁殖效果。通过以上三个实施例可以得出，怀集报春苣苔外植体最适的初代诱导培养基为：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5；最适的增殖培养基为：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为MS培养基，pH为6.5；最适的生根培养基为：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2g、蔗糖30g、琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH为6.5；其中活性炭对于壮苗和生根起到很大作用。