公开/公告号CN106319007A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-01-11
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院青岛生物能源与过程研究所;仁荷大学(韩国);
申请/专利号CN201510346350.8
申请日2015-06-19
分类号C12P21/04;
代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司;
代理人周秀梅
地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路189号
入库时间 2023-06-19 01:20:05
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-06-07
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P21/04 专利号:ZL2015103463508 申请日:20150619 授权公告日:20191119
专利权的终止
2019-11-19
授权
授权
2017-02-08
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P21/04 申请日:20150619
实质审查的生效
2017-01-11
公开
公开
技术领域
本发明属于医药技术与合成生物学领域,涉及一种制备毛发生长促进剂[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸4]-环孢菌素A的生物转化方法。
背景技术
脱发是临床常见疾病,对人的精神和心理产生较大的影响。脱发可分为斑秃(alopecia areata)、脂溢性脱发(male pattern alopecia)、化疗性脱发、老年脱发以及由疾病引起的脱发,其中斑秃和脂溢性脱发的发病率高、且最难治疗。由于斑秃的发病机制尚不清楚,迄今没有明确的治疗药物。对于脂溢性脱发,目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准的治疗性药物仅有米诺地尔(Minoxidil)和5α-还原酶抑制剂非那雄胺(Finasteride)。但是,这两种药物的使用均具有局限性:5%年轻女性患者使用米诺地尔会出现多毛症(Rogers and Avram 2008);发囊完全遭到破坏的患者,使用米诺地尔没有任何疗效(Burton and Marshall 1979);非那雄胺不适用于绝经妇女(Whiting et al.1999)等。此外,还有一些未经FDA批准的具有毛发生长促进作用的药物,如锯叶棕提取物(Sawpalmetto extract)、左旋肉碱(L-Carnitine)、环孢菌素A(CyclosporineA,CsA)等。这类药物副作用明显,治疗时间长,容易产生耐药性(Prageret al.2002;Foitzik et al.2007)。治疗脱发药物的生产是一个年销售额高达数十亿美元的大产业(Wikipedia),因此发现新的、活性好、副作用小的脱发治疗药物具有十分重要的研究意义与实际应用价值。
CsA是从真菌茄病镰刀菌(Tolypocladium inflatum)中分离的一种由11个氨基酸组成的环肽,具有广谱生物活性,例如免疫抑制、抗真菌、抗寄生虫、抗HIV及抗炎等作用(Borel et al.1976)。CsA是一种重要的器官移植抗排斥药,临床应用时发现该药物能引起患者毛发的异常生长。研究发现在CsA第4位N-甲基-L-亮氨酸(N-methyl-L-Leu4)的γ碳原子上加羟基可以显著降低CsA的免疫抑制活性,但不改变其毛发生长促进作用(Kim>4-环孢菌素A(CsA-4-OH)是具有潜在临床应用价值的毛发生长促进剂。化学合成CsA-4-OH存在明显的局限性:①先合成γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸,再通过传统固相多肽合成方法存在高效选择性环化问题;②若使用发酵法生产的CsA进行化学半合成,则缺乏能够对4位N-甲基-L-亮氨酸选择性羟化的化学催化剂。因此,开发从CsA到CsA-4-OH的高效生物转化方法成为后者能否进入临床试验,进而作为毛发生长促进剂上市销售的关键问题。
通过从数百株放线菌中筛选可以转化CsA的菌株,发现稀有放线菌Sebekia benihana可以将底物CsA选择性地氧化为CsA-4-OH,通过基因敲除和回补实验找到了催化这一反应的细胞色素P450单加氧酶CYP-sb21。将CYP-sb21在S.benihana及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中过量表达,均未解决CsA转化率低的难题,最高转化率仅为21%(Lee et al.2013)。最适还原伴侣的缺乏、生物转化过程中底物与产物的穿膜效率低下可能是造成上述低转化率的主要原因。另外,S.benihana及天蓝色链霉菌的培养周期相对较长、对CsA的转化效率低、后续产物分离纯化繁琐、成本高昂,目前无法将其应用于CsA-4-OH的大规模生产。
因此现阶段急需一种转化效率高、后续产物分离纯化简便、成本低的合成,γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸4-环孢菌素A的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备毛发生长促进剂[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸4]-环孢菌素A的生物转化方法。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种制备毛发生长促进剂的生物转化方法,以构建的含高效表达的P450单加氧酶(CYP-sb21)和还原伴侣蛋白作为杂合酶催化系统,杂合酶催化系统(杂合酶催化系统可为纯酶,细胞裂解粗酶液或固定化酶)在电子供体再生系统作用下,催化CsA转化获得CsA-4-OH,实现一步酶的转化。
一种制备毛发生长促进剂的全细胞催化生物转化方法,通过构建含高效表达的P450单加氧酶(CYP-sb21)、还原伴侣蛋白和电子供体再生系统的重组质粒,而后转入宿主,所得全细胞作为催化剂,利用物理或化学方法对重组全细胞催化剂进行通透性处理,实现CsA到CsA-4-OH的全细胞高效转化。
所述P450单加氧酶(CYP-sb21)为来源于稀有放线菌Sebekia benihana菌株的P450酶CYP-sb21能够催化CsA获得CsA-4-OH的其他功能等同体。
所述还原伴侣蛋白为铁氧还蛋白(ferredoxin)和铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase)。
所述还原伴侣蛋白为蓝细菌Synechococcus elongates PCC 7942的铁氧还蛋白(ferredoxin:SynPcc7942_1499,seFdx)和铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase:SynPcc7942_0978,seFdR)。
所述宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母或丝状真菌。
所述电子供体再生系统为葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GDH)以葡萄糖为底物催化的以NAD+或NADP+为辅基生成NADH或NADPH的系统。
所述葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),或其他来源的葡萄糖脱氢酶。
所述重组质粒为诱导型受T7启动子控制的质粒,受体质粒与目标蛋白基因通过限制性酶切连接形成重组质粒,然后转化大肠杆菌感受态细胞,构建高效表达CYP-sb21、还原伴侣蛋白seFdR/seFdR、NADPH再生系统GDH的大肠杆菌重组菌株;所述的诱导型质粒为受T7启动子控制的pET质粒系列和Duet质粒系列,如pET28b或pET22b或pCDFDuet-1或pACYCDuet1,所述的大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)或其他用于异源蛋白表达的大肠杆菌菌株。
其中,上述重组全细胞催化剂优选可为:宿主为Escherichia coli BL21(DE3),该催化剂中CYP-sb21与NADPH再生酶GDH的编码基因串联表达自含有T7启动子的pET28b重组质粒或可以表达CYP-sb21及GDH的其他质粒,还原伴侣蛋白seFdx和seFdR的编码基因串联表达自含有T7启动子的pCDFDuet-1重组质粒或其他可以表达seFdx和seFdR的质粒。
所述全细胞催化方案如下:
1)蛋白的诱导表达:大肠杆菌基因工程菌在LB培养基中37℃,250rpm过夜培养,按10-30%的接种量转接到新鲜的LB培养基中,37℃,250rpm摇至OD600介于0.6-1.0之间添加0.2mM>
LB培养基中含有稳定质粒所需的抗生素,CYP-sb21诱导表达的LB培养基中还含有1mM硫胺素(thiamine)和0.5mM 5-氨基酮戊酸(5-ALA)作为P450酶亚铁血红素辅基的前体促进CYP-sb21的功能性表达。
2)底物的催化反应:离心收集菌体,用100mM硝酸钾缓冲液(pH值6.5-8.0)重悬菌株,达到50-200g湿细胞/L,加入不同浓度的CsA(1-100mM),25-40℃,150rpm反应12-48h,待反应结束后,加入等体积的乙酸乙酯或氯仿进行萃取,即可获得全细胞催化产生的毛发生长促进剂CsA-4-OH。
本发明相对于现有的技术具有优点和积极效果:本发明是基于细胞色素P450单加氧酶CYP-sb21的生物催化合成毛发生长促进剂CsA-4-OH的方法,相对于传统的化学合成以及已报道的放线菌生物转化途径,培养周期短,生产工艺简单,高催化选择性、底物转化率高,产物纯化简单,能耗低,无污染,是一种成本低廉、操作简单的绿色催化系统,具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的酶催化过程图。
图2为本发明实施例提供的全细胞转化过程图。
图3为本发明实施例提供的CYP-sb21、seFdx和seFdR蛋白SDS-PAGE及CYP-sb21的P450酶活性检测(一氧化碳结合及还原状态下的差异扫描谱图)图。
图4为本发明实施例1-4提供的酶法和全细胞转化法获得CsA-4-OH的HPLC图;其中,A.(a)实施例2酶法转化CsA获得CsA-4-OH的HPLC图;(b)实施例1酶法转化CsA获得CsA-4-OH的HPLC图;(c)和(d)分别为CsA和CsA-4-OH标准品。B.(a)实施例3全细胞法转化CsA获得CsA-4-OH的HPLC图;(b)实施例4全细胞法转化CsA获得CsA-4-OH的HPLC图;(c)空质粒对照组HPLC图。
图5为本发明实施例提供的全细胞转化实验中剩余底物CsA及产物CsA-4-OH的LC-Q-TOF/MS检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
本发明是基于稀有放线菌Sebekia benihana细胞色素P450单加氧酶CYP-sb21选择性羟化免疫抑制剂环孢菌素A(Cyclosporine A,CsA)第4位的N-甲基-L-亮氨酸,将其转化为毛发生长促进剂γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸4-环孢菌素A(γ-hydroxy-N-methyl-L-Leu4-Cyclosporine>
实施例1
纯酶催化方法:
(1)目的基因载体的构建及蛋白纯化
将cyp-sb21(序列表SEQ ID NO:1)根据大肠杆菌密码子进行优化(序列表SEQ ID NO:2),人工合成后以CYP-sb21-F/CYP-sb21-R(引物序列见表1)为引物扩增优化后的cyp-sb21片段;PCR扩增体系为100μL:引物各10μM,50μM的dNTPs,DNA模板0.5μL,5×DNA聚合酶buffer20μL,DNA聚合酶5U;PCR反应条件为:95℃预变性5min,之后95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,反应30个循环,最后72℃延伸10min)。
以Synechococcus elongates PCC 7942菌株基因组为模板,分别以FdR-F/FdR-R、Fdx-F/Fdx-R(引物序列见表1)作为引物,分别扩增sefdR和sefdx(序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4),PCR反应体系和条件同(1),其中sefdR 72℃延伸1min,sefdR 72℃延伸30s。
将上述获得扩增片段CYP-sb21、seFdx和seFdR分别利用限制性内切酶NdeI/EcoRI(CYP-sb21)、NdeI/XhoI(seFdx)、BamHI/HindIII(seFdR)连接在pET28b质粒上,而后将所得质粒分别在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中分别表达。经测序验证正确的目的菌株,将所获菌株分别在用含有1mM硫胺素(thiamine)和0.5mM的5-氨基酮戊酸(5-ALA)的LB液体培养基培养,0.2mM IPTG诱导蛋白表达,分别收集菌体用细胞破碎仪破碎,于高速冷冻离心机中离心。上清液分别通过Ni2+-NTA亲和柱,20-300mM咪唑梯度洗脱,250mM的咪唑可以将目的蛋白CYP-sb21、seFdx和seFdR洗脱下来,将分别收集的蛋白采用凝血酶孵育去除N端组氨酸标签,再用Amicon-Ultra-15超滤管浓缩,最后用GE>
(2)体外酶反应体系的构建
体外酶反应总体系为100μL,加入10μM CYP-sb21,10μM还原伴侣seFdx和seFdR,0.5mM NADPH,0.2mM底物CsA,30℃过夜反应,而后向反应体系中加入与反应液等体积的甲醇,高速离心后取上清进行HPLC、LC-MS或LC-Q-TOF/MS分析。CsA难溶于水,在该反应体系中添加10%助溶剂甲醇来提高转换率。CsA转化为CsA-4-OH的转化率为53%(图4A-b)。
另外,步骤(1)中杂合酶催化系统纯化所得纯酶可由杂合酶催化系统直接细胞裂解所获得的粗酶液或杂合酶催化系统经固定化处理所得固定化酶替换。
表1引物列表
实施例2
与实施例1不同之处在于:
在体外酶反应体系中电子再生体系由5U GDH和20mM葡萄糖替换,通过GDH氧化葡萄糖实现NADPH再生,CsA转化为CsA-4-OH的转化率为83.5%(图4A-a)。
实施例3
全细胞催化方法:
(1)基因工程菌的构建:通过限制性内切酶EcoRI/XhoI、NdeI/BamHI将密码子优化后的cyp-sb21基因和gdh分别酶切连接至pET28b质粒上,同时将蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942的P450还原伴侣sefdx和sefdR连接在pCDFDuet-1质粒上,将所得两个重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3),采用含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子,获得高效表达CYP-sb21、GDH、seFdx和seFdR的重组大肠杆菌基因工程菌株。
其中,密码子优化后的cyp-sb21基因(参见序列表2)是以CYP-sb21-Duet-F/CYP-sb21-Duet-R为引物扩增cyp-sb21,连接pCDFDuet-1,用EcoRI/XhoI切下带有T7启动子的cyp-sb21片段;
gdh(参见序列表SEQ ID NO:5)是以GDH-F/GDH-R为引物扩增gdh。(扩增条件与体系参见实施例1步骤(1)的记载)
(2)全细胞反应体系的构建:将上述筛选的重组基因工程菌株单菌落接种至装有10mLLB(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素)培养基的50mL摇瓶中,于摇床转速250rpm,37℃培养过夜,按照1%(v/v)接种量将过夜种子液接种至装有500mL LB(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素,1mM硫胺素,0.5mM的5-ALA)的2L摇瓶中,于37℃,250rpm摇床培养,待菌体密度达到OD600=0.6-1.0时,加入0.2mM>
实施例4
与实施例3不同之处在于
(1)基因工程菌的构建:通过酶切连接将密码子优化过的cyp-sb21基因连接在pET28b质粒上,将蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942的P450还原伴侣sefdx和sefdR连接在pCDFDuet-1质粒上,将所得两个重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3),采用含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子,分别获得高效表达CYP-sb21、seFdx和seFdR的重组大肠杆菌基因工程菌株。
(2)全细胞反应体系的构建:同实施例3,CsA转化为CsA-4-OH的转化率为45%(图4B-b),低于上述共表达GDH相应菌株的转化率,说明采用NADPH再生系统对于提高全细胞转化率的必要性。
SEQ ID NO:1:
ATGGACACCGTCAACCTGATGGATCCCGCACTGATGACCGACCCCTTCAGGGGCTTCTCACGAATCAGGGAGGAGGCGCCCATCGCGCGCGCCTGCTTCCCCGGTCAGGACACACCCATCTGGCTGGTCACCCGGTACGACGACGTCAAGACCGTGCTGGGCGAGCACCGCTTCGTCAACAATCCGGCCTCCATTCCCGGCGGCGACATCCCCGACCTGCGCGAGAAGCTCATGAAGGCGCGCGGGATCCCCGACGACTACGTCGTCTACCTCACCGACGGCATCCTCGACCTCGACGGCGATGACCACCTCAGGCTGCGCCGACTCGTCTCGCGGGCCTTCACCGCCAGGCGCGTCATGGAGATGCGTCCGCGGGTCGAGGAGATCAGTGGCAGGCTGCTCGACGCGCTGCCGGGCGACCGCGTCGTGGACCTGGTCGAGGAGTACGCCTACCCGCTGCCGATCACGGTCATCTGCGAGCTCGTCGGCATCCCCGAGAGCGACCGTCCGCTGTGGCGCGAGTGGGGCGCGAAGATGGTGTCTCTGTCACCTGGCGCCATGGCCGAACCTGTGATCAGCATGGTCGACTACATCCACGACCTGATCCCCCGCCGCCGCGCCGCGCCCGCCGACGACCTGCTCACCGGGCTGATCAAAGCGCACGACGACGACGGCGACCGCTTCACCGACACCGAGCTGATCACGATGGTGCTCACGCTCGTCCTGGCTGGACACGAGACCACCGCCCACCTGATCGGCAACGGCACCGCGGCCCTGCTCACCCACCCCGGCCAGCTTGCCATGCTGCGCGCGCGGCCCGAGCTCATGCCGCGCGCCGTCCACGAGCTCATGCGCTGGTGCGGGCCGGTGCAGGGCACCAGGGTCCGCTACGCGGCCGAGGACGTGGAGCTCGGTGGCATGACGGTGAAGCGGGGCGAGGCCGTGATGGCCGTACTGGTCTCGGCCAACTACGACCCTCGCCGCTTCGAGCGCCCCGACCGGCTCGACCTCACCCGCGAGGAGGACGGCAGGCGCGAGGTCCACGTCGGCTTCGGGCACGGCCTGCACTACTGCCTCGGCGCGGCGCTGGCCAGGCAGGAGGGCGAGGTCGCCTTCGCCGGGCTGCTCTCACGCTTCCCGAAGCTGCGCCTCGCCGTCGCACCCGAGGAGCTCGAACGGCAGCTCATGCCCGCCTCGTGGCGGCTCGCGAGCCTTCCCGTACTCCTGCGCTGA
(a)序列特征:
●长度:1233bp
●类型:碱基序列
●链型:单链
●拓扑结构:线性
(b)分子类型:DNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:稀有放线菌Sebekia benihana
(f)特异性名称:cyp-sb21
结构特征:编码蛋白含有亚铁血红素。
SEQ ID NO:2:
ATGGACACCGTTAATCTGATGGACCCAGCGCTGATGACCGATCCATTCCGTGGTTTCAGCCGTATTCGCGAAGAAGCGCCTATTGCCCGCGCTTGCTTCCCTGGCCAAGATACCCCGATCTGGCTGGTGACGCGCTACGATGATGTAAAAACTGTCCTGGGCGAGCACCGTTTCGTTAACAACCCGGCGTCCATCCCTGGCGGCGACATTCCTGATCTGCGTGAGAAACTGATGAAAGCGCGTGGCATTCCGGATGACTACGTTGTTTACCTGACCGATGGCATCCTGGACCTGGATGGTGACGACCATCTGCGTCTGCGTCGTCTGGTGTCCCGTGCGTTCACCGCTCGCCGTGTAATGGAAATGCGTCCGCGCGTAGAAGAAATCTCTGGTCGCCTGCTGGACGCTCTGCCGGGTGACCGTGTCGTCGACCTGGTTGAAGAGTACGCCTACCCACTGCCGATCACCGTGATCTGTGAACTGGTGGGCATCCCGGAAAGCGACCGTCCGCTGTGGCGCGAATGGGGTGCTAAAATGGTATCCCTGTCTCCGGGTGCAATGGCCGAGCCGGTTATCAGCATGGTTGATTACATCCACGATCTGATTCCACGTCGCCGCGCCGCCCCGGCGGATGATCTGCTGACTGGCCTGATCAAAGCGCACGACGACGACGGCGACCGCTTTACTGACACGGAGCTGATTACGATGGTACTGACCCTGGTTCTGGCAGGTCACGAAACCACTGCTCACCTGATCGGTAACGGTACCGCTGCGCTGCTGACTCATCCGGGTCAGCTGGCAATGCTGCGTGCGCGTCCTGAACTGATGCCGCGTGCGGTGCACGAGCTGATGCGTTGGTGTGGTCCGGTGCAGGGTACTCGTGTTCGTTATGCAGCAGAGGATGTCGAACTGGGTGGCATGACCGTTAAGCGTGGCGAAGCAGTGATGGCAGTACTGGTATCTGCGAACTATGATCCGCGTCGCTTTGAACGTCCGGACCGTCTGGACCTGACCCGTGAAGAAGATGGCCGTCGCGAAGTTCATGTGGGTTTCGGCCACGGTCTGCACTATTGCCTGGGCGCTGCACTGGCTCGCCAGGAAGGTGAAGTGGCTTTTGCTGGTCTGCTGTCTCGTTTCCCGAAACTGCGTCTGGCTGTTGCGCCGGAAGAACTGGAACGTCAGCTGATGCCGGCCTCTTGGCGCCTGGCATCCCTGCCGGTTCTGCTGCGCTGA
(a)序列特征:
●长度:1233bp
●类型:碱基序列
●链型:单链
●拓扑结构:线性
(b)分子类型:DNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:稀有放线菌Sebekia benihana
(f)特异性名称:cyp-sb21
SEQ ID NO:3:
ATGTTGAATGCGAGTGTGGCTGGCGGAGCAGCTACCACCACCTATGGCAACCGGCTCTTTATCTATGAAGTGATCGGTCTGCGCCAAGCCGAGGGCGAACCGTCCGACAGCTCAATCCGCCGTAGTGGCAGCACCTTCTTCAAGGTGCCTTACAGCCGGATGAATCAAGAAATGCAACGGATTTTGCGCCTTGGCGGCAAAATCGTTAGCATCCGGCCTGCGGAGGAAGCAGCCGCGAATAATGGTGCGGCTCCTCTACAGGCAGCAGCTGAAGAACCTGCTGCAGCACCAACCCCCGCTCCGGCTGCCAAAAAACATTCAGCCGAAGACGTGCCTGTCAATATCTACCGGCCTAACAAGCCTTTCGTAGGCAAGGTGCTCTCGAACGAGCCCTTGGTTCAAGAAGGCGGGATTGGTGTTGTGCAGCACCTCACCTTCGATATTTCGGAAGGCGATCTGCGCTACATCGAAGGTCAAAGTATCGGGATTATCCCGGATGGCACCGATGACAAAGGCAAGCCGCACAAGCTCCGTCTTTACTCGATCGCATCCACTCGCCACGGCGACCACGTGGATGACAAAACCGTCTCGCTGTGCGTGCGCCAGCTGCAGTACCAGAACGAAGCCGGCGAAACGATTAATGGCGTCTGCTCGACTTTCCTCTGTGGTCTGAAGCCAGGCGATGACGTCAAGATCACCGGTCCTGTGGGCAAAGAAATGCTCCTACCGGCGGACACAGACGCCAACGTGATCATGATGGGTACTGGCACCGGGATTGCTCCGTTCCGAGCCTACCTATGGCGGATGTTTAAAGACAACGAGCGAGCCATCAACAGCGAGTATCAATTCAACGGCAAGGCTTGGTTGATCTTCGGGATTCCGACGACCGCCAACATCCTCTACAAAGAGGAGCTGGAAGCGCTGCAGGCTCAGTATCCAGATAACTTCCGCCTGACCTACGCGATCAGCCGCGAGCAGAAAAATGAAGCGGGCGGCCGGATGTACATCCAAGACCGCGTCGCTGAACATGCTGACGAGATCTGGAACCTACTCAAGGACGAAAAAACCCACGTCTATATCTGTGGTTTGCGTGGCATGGAAGATGGGATCGATCAAGCCATGACCGTCGCAGCTGCCAAGGAAGATGTGGTTTGGTCTGACTACCAACGCACCCTCAAGAAAGCGGGTCGTTGGCATGTTGAAACCTACTAG
(a)序列特征:
●长度:1212bp
●类型:碱基序列
●链型:单链
●拓扑结构:线性
(b)分子类型:DNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:蓝细菌Synechococcus elongates PCC 7942
(f)特异性名称:sefdR
SEQ ID NO:4:
ATGGCAACCTACAAGGTTACGCTCGTCAATGCTGCCGAAGGCTTGAACACCACGATCGACGTGGCTGACGATACCTACATCTTGGACGCCGCTGAAGAGCAAGGCATTGACCTGCCTTACTCCTGCCGTGCTGGTGCTTGCTCGACCTGTGCTGGCAAAGTCGTCTCTGGTACCGTCGACCAATCGGATCAATCCTTCTTGGATGACGACCAAATTGCAGCAGGCTTTGTCCTGACCTGCGTCGCCTATCCGACCTCCGATGTGACGATCGAAACCCACAAAGAAGAAGACCTCTACTAA(a)序列特征:
●长度:300bp
●类型:碱基序列
●链型:单链
●拓扑结构:线性
(b)分子类型:DNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:蓝细菌Synechococcus elongates PCC 7942
(f)特异性名称:sefdx
SEQ ID NO:5:
ATGTATAAAGATTTAGAAGGAAAAGTAGTGGTCATAACAGGTTCATCTACAGGTTTGGGAAAATCAATGGCGATTCGTTTTGCGACAGAAAAAGCTAAAGTAGTTGTGAATTATCGTTCTAAGGAAGACGAAGCTAACAGCGTTTTAGAAGAAATTAAAAGAGTTGGCGGAGAGGCTATTGCCGTTAAAGGTGACGTAACAGTTGAGTCTGATGTAATCAATTTAGTTCAATCTGCAATTAAAGAATTTGGAAAGCTAGACGTTATGATTAACAACGCAGGACTAGAAAATCCGGTTTCATCTCATGAAATGTCTTTAAGCGATTGGAATAAAGTAATTGATACGAACTTAACGGGAGCTTTCTTAGGTAGTCGTGAAGCGATTAAATATTTTGTTGAAAATGATATTAAGGGAACAGTTATTAACATGTCGAGTGTTCACGAGAAAATTCCTTGGCCATTATTTGTTCATTATGCAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAGCTTATGACTGAAACACTGGCATTAGAATACGCTCCAAAAGGTATTCGTGTAAATAACATTGGACCGGGAGCGATTAATACACCGATTAACGCTGAGAAATTTGCTGATCCTGAGCAGCGTGCAGATGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGATACATCGGAGAGCCGGAAGAAATTGCAGCAGTTGCTGCATGGCTAGCTTCTTCAGAGGCGAGTTATGTAACAGGAATTACGCTCTTTGCTGACGGCGGTATGACACTGTACCCATCATTCCAAGCAGGACGCGGATAA
(a)序列特征:
●长度:786bp
●类型:碱基序列
●链型:单链
●拓扑结构:线性
(b)分子类型:DNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
(f)特异性名称:gdh
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机译: 制备与一种或多种对照和/或抗原性裂殖子表面艾美球虫表面具有免疫反应性的蛋白质的方法,编码该蛋白质的dna。制备含有该dna的重组载体的方法。制备含有该重组载体的微生物的方法禽的球虫病疫苗的制备及转化方法
机译: SHUTTLE VECTOR-PZ1,重组质粒,微生物的转化方法,蓖麻毒素的制备方法和将微生物转化为蓖麻毒素的一种方法
机译: 3.D.一种由酯-aborada生成3-D生物质的方法,包括(1)用聚氨酯印刷3-D生物质,(2)制备可渗透的树脂,包括(a)将树脂与苯乙烯单体混合,(b)添加促进剂。 ,(c)品脱。 (3)渗透和(4)在80至150摄氏度的温度下进行处理。