抗ALS抑制剂类除草剂马唐的PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明提供用于检测抗ALS抑制剂类除草剂马唐的特异性PCR引物对与试剂盒。本发明的引物特异性好，灵敏度高，经PCR试验证明能够将马唐的ALS基因序列扩增出来，而扩增出的序列含有已报道的所有与抗性相关的位点，能够反映马唐对ALS类除草剂的抗性水平。本发明操作简便快捷，仅需2‑3天。灵敏度和特异性均能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂马唐的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。

说明书

技术领域

本发明涉及抗除草剂杂草检测领域，具体地说，涉及抗ALS抑制剂类除草剂马唐的PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

马唐(Digitaria>)是黄淮海玉米种植区的恶性杂草之一, 其在黄淮海免耕玉米田的出现频率及危害率分别为99.0%和73.0%。黄淮海地区玉米田的7个主要杂草群系，有6个群系以马唐为优势种。目前，对于马唐的化学防除，主要采用ALS类除草剂，但由于该类除草剂分子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性。近些年来，马唐对ALS类除草剂抗性问题在我国黄淮海区域的一些玉米田已经较为非常突出，以常规剂量喷施已经无法有效防除抗性马唐。

杂草产生抗性，则这些农田不能继续使用该类除草剂。但在生产实践中人们对杂草抗性的认识不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗药性杂草检测鉴定方法。

乙酰乳酸合酶(Acetolactate synthase，ALS)，是植物和微生物体内三种支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成过程中的关键性酶。ALS抑制剂类除草剂通过抑制生物体内的ALS酶的合成，使蛋白质的合成受到破坏，阻断了杂草细胞的有丝分裂过程，最终导致植物生长受阻、直至死亡。

取决于这一特性，ALS作为一种重要的除草剂靶标己经被广泛证实和应用。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪80年代初，如咪唑啉酮类(imidazolinones, IMI)、磺酰脲类(sulfonylureas, SU)等。这些除草剂具有活性高、对人及动物低毒和环境友好等明显的优势，受到广泛关注。

我国抗药性杂草的分子机制研究起步较晚，但是随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理得到明确。因此，通过PCR技术快速、灵敏的检测目标杂草靶标基因的突变位点，从而检测目标杂草是否产生抗药性的方法已经成为可能。

发明内容

为解决以上技术上的不足，本发明提供了一种快速高效的分子生物学检测杂草抗性的方法。

本发明的目的是提供一种更快速和高效的抗ALS抑制剂类除草剂马唐的PCR检测方法。

本发明的另一目的是提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂马唐的PCR检测试剂盒。

我们首次克隆了马唐的ALS基因，并与已报道的其它杂草ALS基因进行序列比对。明确其同源性，并命名为DsALS基因。根据克隆得到的DsALS基因序列，设计一特异性引物对用于检测抗ALS抑制剂类除草剂马唐

为实现本发明的目的，具体采用如下的技术方案：

首先提供一对特异性引物对用于检测抗ALS抑制剂类除草剂马唐，引物序列如下：

用于特异性扩增马唐DsALS基因的引物对：

正向引物DsALS-F: 5’- GTCATCGCCAACCACCTCT-3’

反向引物DsALS-R: 5’- CATATCCTTGAAAGCGCCAC -3’

其中，DsALS基因的GeneBank登录号为KX461957。

本发明还提供含有上述引物对的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂马唐的试剂盒。

本发明所述试剂盒还包括dNTPS、Taq DNA聚合酶和含有Mg²⁺的PCR反应缓冲液。

本发明所述试剂盒还包括标准阳性模板。

同时，本发明还提供一种检测方法，以上述引物对或上述试剂盒进行马唐抗性检测的PCR克隆方法。

所述PCR方法的具体步骤为：

1. 选取田间待检测植株或以温室自行种植的植株为材料。

2. 提取待检测样品基因组DNA；

3. 进行PCR扩增反应；

4. 回收、分析PCR产物。

PCR反应体系以25 μL计为:

模板DNA 1>

2.5 mM dNTPs1>

10 μM正向引物 1>

10 μM反向引物 1>

Taq DNA聚合酶 1.5 U

含Mg²⁺的10×PCR反应缓冲液2.5>

ddH₂O补至25>

PCR反应条件为：94℃ 4分钟；94℃ 0.5分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，30个循环；72℃ 10分钟。

本发明以发明人首次克隆的马唐ALS基因序列为依据，根据其序列信息设计特异性引物DsALS-F/DsALS-R，并同时设计了含有该引物对的PCR检测试剂盒，采用该PCR引物对或试剂盒均能够特性的扩增出马唐ALS基因序列（图1）。该方法基于对核昔酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需1-2天，具有精确和快速的特点。

不同于传统的生物测定方法，分子生物学手段的检测更加快速和灵敏，已经成为目前要求较高的一类检测方向。在发明人成果首次克隆了马唐ALS序列后，基于该序列克隆和分析的快速PCR检测技术也就成为了可能。

本发明提供的检测方法是基于基因核苷酸序列的检测技术，该检测能够以当即植株为检测对象，整个检测方法不仅简便快捷，而且灵敏度高、特异性好，可对田间采集的疑似抗性的马唐进行快速检测。该方法效率高，操作简便，是传统的室内除草剂抗性生物测定的有效替代方法。

附图说明

图1 本发明实施例1中克隆得到DsALS基因序列的进化树分析。

图2为本发明实施例2中利用所设计特异性引物DsALS-F/DsALS-R对马唐基因组DNA的PCR结果。

图3 为以本发明试剂盒中所提供的阳性模板的PCR克隆产物的测序结果，若被检测植株在该位点处发生氨基酸水平的变化则意味着被检测植株为抗性植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，以下所述实施例为本发明所采用具体实施方式，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 马唐ALS基因（DsALS）的克隆。

在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank数据库中查询已报道的禾本科杂草ALS基因序列，根据查询到的序列信息设计通用引物，根据已扩增得到的基本序列通过3’和5’端RACE技术克隆两端序列，通过相关生物学软件进行拼接后获得马唐DsALS基因序列。

实施例2 PCR引物对的设计和合成

根据本发明人所克隆得到的马唐DsALS基因序列，通过Primer 5.0软件设计特异性引序列DsALS-F/DsALS-R，用于特异性扩增目的基因，具体序列信息如下：

正向引物DsALS-F: 5’- GTCATCGCCAACCACCTCT-3’ (Seq ID No.1)

反向引物DsALS-R: 5’- CATATCCTTGAAAGCGCCAC -3’(Seq ID No.2)

引物设计完成后送上海生物工程有限公司进行引物的合成工作。

实施例3 PCR试剂盒的制备

根据实施例中获得特异性引物对，在试剂盒中添加PCR反应所必须试剂：dNTPS、TaqDNA聚合酶和含有Mg²⁺PCR反应缓冲液，并结合所合成引物对，制成PCR检测试剂盒。

实施例4 抗ALS抑制剂类除草剂马唐的PCR检测

采集不同地区的田间马唐，或以自行种植的马唐植株为检测材料。

取马唐新鲜叶片约0.3g，加入液氮研磨，采用CTAB法提取马唐基因组DNA。

PCR反应体系，其中10×PCR反应缓冲液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 1 μL，10 μM引物各1 μL，TaqDNA聚合酶1.5 U，DNA模板1 μL，灭菌双蒸水补足至终体积为25 μL。

用于检测马唐DsALS基因的PCR扩增程序：94℃ 4分钟；94℃ 0.5分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，30个循环；72℃ 10分钟。

PCR产物的鉴定：1 %琼脂糖凝胶电泳检测所克隆PCR产物的特异性。将PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序分析。

实验结果：

发明人首次克隆了马唐ALS基因序列（DsALS基因），基因序列分析发现，该序列与其它杂草的ALS基因的氨基酸同源性在60%以上，进化树分析显示其与稗草亲缘关系较近（图1）。以本发明所设计的特异性引物对DsALS-F/DsALS-R进行PCR扩增分析，能够获得特异性PCR产物（图2）。

依据本发明所提供试剂盒中的模板，进行PCR克隆反映，经测序分析后能够获得DsALS基因与抗性产生相关位点的序列组成。图3中显示为第197为氨基酸所对应的氨基酸序列，而待检测植株如果在此位置发生突变就意味着该植株为抗性植株。

以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>山东省农业科学院植物保护研究所

<120>抗ALS抑制剂类除草剂马唐的PCR检测方法及试剂盒

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<170>PatentIn version 3.5

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