用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物和使用该组合物诊断动脉粥样硬化的方法

摘要

本发明涉及用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物和通过使用该组合物诊断动脉粥样硬化的方法。根据本发明的用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物显示优秀的动脉粥样硬化诊断准确度，使得甚至对于患有需要血糖控制的疾病如糖尿病的个体也能够诊断动脉粥样硬化，且使得甚至对于发生在脑和心脏中的动脉粥样硬化也能够有效诊断。此外，与用于动脉粥样硬化诊断的传统成像组合物相比，其生产成本低。因此，通过使用该组合物可以有效地诊断动脉粥样硬化。

说明书

技术领域

本公开涉及用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物和使用该组合物诊断动脉粥样硬化的方法。

背景技术

动脉粥样硬化指一种疾病，其中胆固醇在血管的内部(内膜)沉积且内膜细胞在沉积处增殖，导致血管变窄或阻塞和减少的血液向周围的流动。更具体地，动脉粥样硬化是一种血管疾病，其中正如老化水管的直径因铁锈和杂质沉积而变窄，胆固醇渗入血管的内膜层，内膜细胞和巨噬细胞在该处增殖，导致粥样斑的形成。粥样斑的核是由非细胞的脂质核组成的，且其被硬纤维斑块覆盖。当斑块不稳定时，其破裂并在血管中形成血块。到粥样斑内的出血导致血管的迅速变窄甚至阻塞，从而导致受限制的向末梢的血液循环。

用于监测动脉粥样硬化的发生和发展的方法包括使用PET/CT的分子成像。对于通过使用PET/CT的分子成像诊断动脉粥样硬化，已经使用氟-18氟脱氧葡萄糖(F18-FDG)。使用F18-FDG诊断动脉粥样硬化的原理是基于泡沫细胞对葡萄糖和FDG增加的吸收。

然而，使用F18-FDG对动脉粥样硬化进行成像的诊断方法具有一些问题。首先，因为FDG是葡萄糖类似物，由于血糖或代谢相关的激素可能受到影响，控制用于诊断的身体条件是受限的。因此，动脉粥样硬化诊断的准确度降低。此外，因为禁食或血糖控制是必要的，该方法对于高危群体例如患有糖尿病的群体是受限的。其次，虽然动脉粥样硬化在脑和心脏中频繁地发生，但是难以使用F18-FDG检测动脉粥样硬化，因为它们利用血糖作为能量。再次，生产成本过高，因为需要昂贵的设备例如回旋加速器来制备F18-FDG。

韩国专利注册号10-1351411(专利文件1)和韩国专利注册号10-1055700(专利文件2)公开了与本公开相关的技术。具体地，专利文件1涉及在F18-FDG正电子发射断层扫描中通过将恶性肿瘤与炎性病变区分开来选择性地诊断恶性肿瘤的方法，专利文件2涉及用Ga-68标记的甘露糖基化白蛋白。

发明内容

技术问题

本公开涉及提供用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物，其显示动脉粥样硬化诊断的高准确度，使得甚至对于患有疾病如糖尿病的个体也能够诊断动脉粥样硬化，且使得甚至对于发生在脑和心脏中的动脉粥样硬化也能够有效检测。本公开还涉及以低生产成本提供用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物，和提供使用该组合物诊断动脉粥样硬化的方法。

技术方案

在一方面，本公开提供用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物，其包含放射性同位素标记的化合物，所述放射性同位素标记的化合物是用金属放射性同位素标记的选自双官能螯合剂-甘露糖基化人血清白蛋白、双官能螯合剂-甘露糖基化纳米颗粒和双官能螯合剂-甘露糖基化聚合物中的一种或更多种。

在另一方面，本公开提供使用根据本公开的用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物诊断动脉粥样硬化的方法。

有益效果

根据本公开的用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物显示诊断动脉粥样硬化的高准确度，使得甚至对于患有伴随血糖代谢问题的疾病如糖尿病的个体也能够诊断动脉粥样硬化，且使得甚至对于发生在脑和心脏中的动脉粥样硬化也能够有效检测。此外，与现有用于诊断动脉粥样硬化的成像组合物相比，其生产成本低。因此，通过使用该组合物可以有效地诊断动脉粥样硬化。

附图说明

图1和图2示出通过TLC测量⁶⁸GaCl标记效率的结果。

图3示出通过测量放射化学纯度来验证稳定性的结果。

图4示出MSA-RITC与大鼠巨噬细胞中甘露糖受体的特异性结合。

图5示出向兔静脉注射1mCi的⁶⁸Ga-MSA后进行正电子发射断层扫描的结果。

图6示出在具有高胆固醇饮食的兔子的主动脉的动脉粥样硬化病变处检测的RITC标记的MSA。

图7、图8和图9比较使用对比例的¹⁸F-FDG和实施例及对比例的⁶⁸Ga-MSA对动脉粥样硬化进行成像的结果。

图10示出比较实施例和对比例的脑实质中的SUV的结果。

图11、图12和图13示出测试实施例对颈动脉粥样硬化部位的临床适用性的结果。比较正常人和患有心肌梗塞的患者的⁶⁸Ga-MSA图、SUV等。

最佳实施方式

本公开的发明人已经做出不懈努力以开发用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物，其显示诊断的高准确度，使得甚至对于患有疾病如糖尿病的个体也能够诊断动脉粥样硬化，且甚至可以适用于脑和心脏中的病变。因此，他们已经开发出根据本公开的用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物。

一般来说，F18-FDG(¹⁸F-FDG)已经被用于诊断动脉粥样硬化的发生和发展的成像组合物中。然而，其问题在于准确度低，因为FDG是葡萄糖类似物，其难以应用于患有疾病如糖尿病的个体，和其难以应用于其中动脉粥样硬化的发生是最重要问题的脑和心脏。此外，F18-FDG的生产成本高。

具体地，根据本公开的用于对动脉粥样硬化进行成像的药物组合物包含放射性同位素标记的化合物，所述放射性同位素标记的化合物是用金属放射性同位素标记的选自双官能螯合剂-甘露糖基化人血清白蛋白、双官能螯合剂-甘露糖基化纳米颗粒和双官能螯合剂-甘露糖基化聚合物中的一种或更多种。

在组合物中，双官能螯合剂用于结合放射性同位素，甘露糖基团用于结合甘露糖受体，人血清白蛋白、纳米颗粒或聚合物作为载体/支撑体用于将双官能螯合剂与甘露糖结合。期望组合物具有1至100nm的尺寸，以便其在血液中很好地分散且可以移动穿过血管。因为双官能螯合剂和甘露糖具有仅约0.5nm的尺寸，载体/支撑体即人血清白蛋白、纳米颗粒或聚合物占其尺寸的大部分。人血清白蛋白在尺寸上是理想的，因为其具有6nm的长轴和4nm的短轴的橄榄球形状。纳米颗粒和聚合物可以根据尺寸和材料适当地选择。

也就是说，根据本公开的用于对动脉粥样硬化进行成像的药物组合物，其中甘露糖基化的人血清白蛋白(MSA)、纳米颗粒或聚合物与甘露糖结合，甘露糖是甘露糖受体的配体，然后将选自⁶⁸Ga、^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹¹C、¹²³I、¹²⁴I和¹³¹I中的一种或更多种放射性同位素与其连接，所述药物组合物使得能够通过检测放射性同位素对动脉粥样硬化进行分子成像，通过这样，诊断动脉粥样硬化的发生和发展。甘露糖受体是存在于在动脉粥样硬化中出现的泡沫细胞上的细胞膜受体之一。

金属放射性同位素可以特别地是选自⁶⁸Ga、^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹¹C、¹²³I、¹²⁴I和¹³¹I中的一种或更多种，最特别地是⁶⁸Ga。

因为组合物不受代谢限制影响，禁食不是必要的。而且，因为其与代谢相关的激素无关，其甚至可以适用于患有疾病如糖尿病的个体。此外，不同于现有的F18-FDG，其也可以用于脑和心脏。并且，由于不同于F18-FDG，不需要复杂或昂贵的设备，所以生产成本低。通常，被称作回旋加速器的昂贵设备已被用于制备F18-FDG。然而，当如本公开中使用⁶⁸Ga作为金属放射性同位素时，其可以用被称作镓发生器的简单设备容易地制备。此外，由于⁶⁸Ga具有优异的正电子发射能力，与使用其它放射性同位素或F18-FDG的情况相比，可以得到更清晰的图像。

当使用^99mTc或¹¹¹In作为金属放射性同位素时是有利的，这是因为半衰期更长。并且，由于生产成本降低，¹²³I、¹²⁴I和¹³¹I是有利的。并且，当同时连接⁶⁸Ga、^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹¹C、¹²³I、¹²⁴I和¹³¹I中的两个或更多个放射性同位素时，各放射性同位素的效果同时发挥。例如，当同时连接⁶⁸Ga和^99mTc时是有利的，这是因为可以增加诊断准确度，甚至可以应用于患有疾病如糖尿病的对象，甚至可以应用于脑和心脏，且半衰期增加。

双官能螯合剂可以是选自[1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)]、[1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)]、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、肼基烟酸(HYNIC)，N₂S₂和N₃S中的一种或更多种。最具体地，其可以是NOTA，虽然不限于此。特别地，当NOTA用作双官能螯合剂时是有利的，这是因为其是容易用⁶⁸Ga标记的。具体地，当使用^99mTc作为标记物时可以使用HYNIC、N₂S₂或N₃S，当使用¹¹¹In作为标记物时可以使用DOTA。

根据本公开的用于诊断动脉粥样硬化的方法使用根据本公开的用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物。诊断方法包括相关领域中已知的任何诊断方法。

发明方式

在下文中，通过具体实施例详细地描述本公开以使本公开所属领域的普通技术人员可以容易地实施本公开。然而，本公开可以以各种不同形式实施而不受限于实施例。

实施例

实施例1：用于Ga-68(⁶⁸Ga)标记的NOTA-MSA的制备

<步骤1：苯基甘露糖结合的人血清白蛋白的制备>

在将20mg的人血清白蛋白溶于5mL的0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中并添加5.5mg的α-L-异硫氰酸苯基吡喃甘露糖苷后，在室温下通过充分地搅拌进行反应20小时。然后，在-70℃保储存反应溶液。

<步骤2：苄基NOTA和苯基甘露糖结合的人血清白蛋白的制备>

在向步骤1中制备的1mL甘露糖基化人血清白蛋白(13.6mg/mL)中加人10mg的p-SCN-Bz-NOTA后，在室温下进行反应1小时。反应后，分离苄基NOTA和苯基甘露糖结合的人血清白蛋白，并用Sephadex G-25柱纯化。

实施例2：用于对甘露糖受体进行成像的试剂盒的制备

在向0.3mL的乙酸钠缓冲液(0.5M，pH 5.5)中加入1mL的苄基NOTA和苯基甘露糖结合的人血清白蛋白(13.6mg/mL)，并将相当于1mg蛋白质的量转移至每个小瓶后，将混合物冷冻干燥并在-70℃保存。

实施例3：使用用于对甘露糖受体进行成像的试剂盒制备⁶⁸Ga标记的化合物

当向实施例2的试剂盒加入使用⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器(Cyclotron>68GaCl的0.1M盐酸溶液后，在37℃进行反应时，稍后通过TLC>68Ga保持在原点而未标记的⁶⁸Ga移至溶剂前沿(图1)。在37℃、pH>68Ga-NOTA-MSA的稳定性。结果显示在图3中。从图3可以看出，当化合物在37℃在血清中培养时，纯度保持在99％或更高2小时。考虑到在核医学成像中通常在标记后1小时内进行注射，可以看出化合物对于实际用途是足够稳定的。

实施例4：用于甘露糖受体荧光成像的RITC-MSA化合物的制备

首先，以与实施例1的步骤1相同的方式制备MSA。使100mg的MSA与溶于13mL的0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.5)中的16mg(0.03毫摩尔)罗丹明B异硫氰酸酯(RITC)在室温、黑暗中反应20小时。使用PD-10柱和生理盐水对生成的RITC-MSA进行分离和纯化，然后冷冻干燥。通过使用配备氮气激光(337nm)的MALDI-TOF质谱仪测量分子量来计算每MSA结合的RITC的量。为此，通过以线性模式照射激光500次进行测量。将所有样品分析4次，通过取结果平均值来确定MSA和RITC-MSA的分子量。

通过该过程制备用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物。

使用所制备的用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物得到患有动脉粥样硬化症状患者的PET/CT图。使用Philips’Extended Brilliance Workspace V3.5得到PET/CT图。具体地，在高丽大学九老医院进行成像。选择主动脉的感兴趣区(ROI)以使最大放射性吸收的部位位于中心。对于升主动脉和降主动脉的轴向中的相邻切片，确定感兴趣区的最大标准吸收值(SUV)和平均标准吸收值。通过将相应组织的放射性浓度除以所注射的放射性的总体浓度来计算标准吸收值。在内部观察者和外部观察者之间的平均标准吸收值的相关系数大于0.9。

从图4可以看出，MSA-RITC与大鼠巨噬细胞中的甘露糖受体特异性结合(图4a)，在用抗甘露糖受体抗体预培养时抑制该结合(图4b)。此外，流式细胞术分析显示，在用抗CD206抗甘露糖受体抗体培养时，MSA与甘露糖受体的结合以取决于含量的方式减少(图4c)。

另外的制备例：使用rMSA试剂盒制备Tc-99m-MSA(^99mTc-MSA)

在向实施例的试剂盒加入由Mo-99/Tc-99m发生器(Samyoung Unitech)制备的2mL或5mL高锝酸盐(^99mTcO4-)的生理盐水溶液后，在室温下进行反应1至30分钟。通过在ITLC(瞬时薄层色谱)板上用少量的反应物点板然后使用TLC扫描仪在用生理盐水显影后测量放射性分布来确定锝的放射性同位素标记效率。标记的锝保持在原点，而所有其他未标记的锝移至溶剂前沿。标记效率为99％或更高。当标记的99mTc-MSA保持在室温下且当其与人血清混合然后在37℃培养时，通过测量随时间的放射化学纯度(％)来研究标记的^99mTc-MSA的稳定性。结果显示在表1中。

【表1】

时间(小时)血清室温0.596.094.51.092.296.42.096.091.13.094.494.06.097.4N.D.20.090.591.024.088.795.3

如从表1看出，当^99mTc-MSA保持在室温下且当其在37℃在血清中培养时，纯度保持在90％或更高20小时。虽然当其在37℃在血清中培养时，纯度在24小时降至88.7％，但是对于实际用途是足够稳定的，因为在核医学成像中通常在标记后1小时内进行注射。

对比例

在对比例中，不同于实施例，使用在用于对动脉粥样硬化进行成像的组合物中已经使用的F18-FDG。

测试例

测试例1：实施例的兔动脉粥样硬化的分子成像

使用十只12周龄的正常兔(新西兰白兔)用于实验。它们被随机地分为2组，每组5只兔。给一组提供正常饮食而给另一组提供包含1％胆固醇的饮食。将动物保持在具有定期光照/黑暗(10/14小时)循环的标准条件(21℃，湿度41％至62％)下，并提供水和饲料的自由使用。3个月后，在麻醉下静脉注射1mCi的⁶⁸Ga-MSA后，在注射后10分钟开始对全身实施10分钟正电子发射断层扫描(图5和图6)。次日，将兔麻醉并向兔的耳静脉注射RITC-MSA(42μg/0.1mL)或混在0.9％生理盐水中的RITC。10分钟后，将兔安乐死，切下主动脉并使其保持在-20℃。在室温下，将主动脉部分在4％(体积/体积)缓冲的福尔马林溶液中固定30分钟，用冷PBS(pH>TM(SouthernBiotech，Birmingham，AL)安装组织切片。用分别具有547nm和572nm的激发和发射波长的IX81-ZDC焦点漂移补偿显微镜(Olympus，东京，日本)观察荧光图(图6)。

图5a示出正常饮食兔中⁶⁸Ga-MSA的PET/CT图。可以看出，未观察到动脉粥样硬化病变，在肝脏和骨髓组织中⁶⁸Ga-MSA吸收提高。图5b是胆固醇饮食兔中⁶⁸Ga-MSA的PET/CT图。在脊柱前面的腹部观察到绿色的动脉粥样硬化病变。图5c放大图5b中的动脉粥样硬化部位。在黄色脊柱前面观察到绿色动脉粥样硬化病变。

图6E示出通过DIC(微分干涉对比)显微镜观察的来自胆固醇饮食兔的主动脉的动脉粥样硬化部位的动脉粥样硬化组织。图6F示出在DAPI染色后通过荧光共聚焦显微镜观察来自动脉粥样硬化病变的相同组织的细胞核的结果。图6G示出在动脉粥样硬化部位观察的在MSA标记的RITC的荧光。图6H示出对于相同的动脉粥样硬化组织，当注射未在MSA标记的RITC时，通过荧光显微镜不能够观察到RITC的荧光。图6I是通过叠加上述图得到的图，示出RITC-MSA与甘露糖受体的特异性结合。可以看出RITC标记的MSA与动脉粥样硬化部位充分地结合。

测试例2：实施例和对比例的动脉粥样硬化成像的比较

比较实施例和对比例的动脉粥样硬化的诊断图。通过向相同的兔以两天间隔注射⁶⁸Ga-MSA和¹⁸F-FDG进行实验。结果显示在图7、图8和图9中。

图7a示出正常饮食兔中的¹⁸F-FDG的PET/CT图。可以看出，未观察到动脉粥样硬化病变，在肝脏和骨髓组织中的¹⁸F-FDG吸收提高。图7b是胆固醇饮食兔中的⁶⁸Ga-MSA的PET/CT图。在脊柱前面的腹部观察到绿色的动脉粥样硬化病变。图7c放大图7b中的动脉粥样硬化部位。在灰色脊柱前面观察到绿色动脉粥样硬化病变。

由图8可以看出，对于对比例的¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-MSA都可以观察到动脉粥样硬化病变。同时，如由图9看出，在吸收提高中，其中使用⁶⁸Ga-MSA的实施例与其中使用¹⁸F-FDG的对比例相比得到更好的结果。更具体地。图9a示出相对于主动脉动脉粥样硬化病变的SUV的下腔静脉的SUV(TBR：目标背景比)，图9b示出心脏SUV相对于主动脉动脉粥样硬化病变的SUV的TBR，图9c示出脑实质SUV相对于主动脉动脉粥样硬化病变的SUV的TBR。由图9可以看出，实施例与对比例相比得到更好的结果。因此，确定实施例与对比例相比可以获得更清晰的动脉粥样硬化成像。

表2显示主动脉动脉粥样硬化部位的SUV相对于脑SUV的TBR。可以看出实施例的TBR与对比例的TBR高。图10示出与对比例相比，实施例的脑SUV在PET中的作用很低。相反，对于对比例，因为¹⁸F-FDG通过血脑屏障进入脑实质，不确定信号是来源于动脉粥样硬化病变还是来源于¹⁸F-FDG的增加。因此，可以看出¹⁸F-FDG不能用于检测脑组织中的动脉粥样硬化病变。

【表2】

测试例3：实施例的临床适用性的评价

进行实验以比较与对比例相比实施例的化合物的临床适用性。进行比较对于急性心肌梗塞患者组和正常对照组的颈动脉粥样硬化部位的⁶⁸Ga-MSA图的I期临床研究。结果显示在图11、图12和图13中。图11示出急性心肌梗塞患者在颈动脉粥样硬化病变部位的⁶⁸Ga-MSA图。在颈部区域充分地观察到绿色动脉粥样硬化部位。图12示出在颈动脉没有动脉粥样硬化病变的对照组的⁶⁸Ga-MSA图。可以看出没有观察到异常部位。由图13可以看出，与正常对照组相比，由⁶⁸Ga-MSA>

虽然已经描述了本公开的具体示例性实施方案，但是本公开并不限于此，并且可以在本公开的精神和范围内进行各种改变。应理解的是这些改变在如所附权利要求所限定的本公开的范围内。