检测病毒样品中回复突变的方法和用于该方法的试剂盒

摘要

本申请公开了一种检测病毒样品中回复突变的方法，其包括：获得所述病毒样品中的核酸；获得PCR反应混合物，所述PCR反应混合物包含所述核酸、引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，其中所述引物能够特异性地与发生回复突变的核酸通过碱基互补结合；将所述PCR反应混合物分散成多个微滴；对所述多个微滴分别进行PCR扩增；检测在所述多个微滴中的PCR扩增产物。本申请还公开了实现上述方法的试剂盒。

说明书

技术领域

本申请涉及生物检测领域，更具体地，涉及一种检测病毒样品中回复突变的方法和用于该方法的试剂盒。

背景技术

基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。基因治疗与常规治疗方法不同，其针对的是疾病的根源—异常的基因本身。随着研究的不断深入，基因治疗己从单基因遗传病扩展到多个病种范围，例如恶性肿瘤、心血管疾病、遗传病、AIDS和类风湿等。

虽然基因治疗药物有着光明的前景，但是也有潜在的危险性。在基因治疗药物的生产的过程中，基因药物有一定的概率会与宿主细胞产生回复突变，而回复突变后的基因药物会对人体产生潜在的副作用，因此，各国监管部门对基因治疗药物的回复突变的比例提出了非常高的要求，例如，美国食品药品监督管理局(FDA)要求回复突变率应在3×10¹⁰个拷贝的基因药物中不超过1个拷贝的回复突变。

由于病毒样品中具有的回复突变的病毒拷贝数可能只占总的病毒拷贝数的极少数，甚至远远低于百万分之一的水平，在绝对数量上更可能仅有个位数的拷贝。在现有技术中，要准确定量检测如此痕量的回复突变非常困难，在技术上面临巨大的挑战。不仅如此，由于病毒样品中总的病毒拷贝数达到3×10¹⁰个拷贝甚至更多，这与极少的(例如个位数的)回复突变拷贝数形成鲜明对比。要在这些数以亿计的不具有回复突变的病毒拷贝中准确地定量检测出稀少的回复突变拷贝，无异于大海捞针。而且这些数以亿计的不具有回复突变的病毒拷贝与待检测的回复突变拷贝具有极为相似的核苷酸序列，这又反过来对定量检测造成极大的干扰，使得准确的定量检测更加困难，甚至几乎不可能。所以，提供一种能够准确检测回复突变的方法是至关重要的。

发明内容

本申请提供了一种检测病毒样品中回复突变的方法和用于该方法的试剂盒。

在本申请的一个方面中，提供了一种检测病毒样品中回复突变的方法，其包括：获得所述病毒样品中的核酸；获得PCR反应混合物，所述PCR反应混合物包含所述核酸、引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，其中所述引物能够特异性地与发生回复突变的核酸通过碱基互补结合；将所述PCR反应混合物分散成多个微滴；对所述多个微滴分别进行PCR扩增；及检测在所述多个微滴中的PCR扩增产物。

在一些实施方式中，所述将所述PCR反应混合物分散成多个微滴的步骤包括将所述PCR反应混合物和油相混合以形成含有油相和水相的乳液，并将所述乳液分散成多个微滴。

在一些实施方式中，所述病毒样品含有具有突变的病毒，且所述回复突变涉及在所述具有突变的病毒的基因组中原本缺失的核酸被至少部分或全部恢复。在一些实施方式中，所述病毒样品含有具有突变的腺病毒。在一些实施方式中，所述具有突变的腺病毒是溶瘤性腺病毒。在一些实施方式中，所述具有突变的腺病毒在E1a基因和/或E1b基因缺失了至少部分的核酸。在一些实施方式中，具有突变的腺病毒与Ad5相比，缺失对应于Ad5的E1a基因的SEQ ID NO:1所示区域的全长或者其片段。在一些实施方式中，所述具有突变的腺病毒与Ad5相比，缺失对应于Ad5的E1b基因的SEQ ID NO:2所示区域的全长或者其片段。在一些实施方式中，所述回复突变涉及在所述具有突变的病毒的基因组中原本缺失的SEQ ID NO:1的全长或者其片段被至少部分或全部恢复。在一些实施方式中，所述回复突变涉及在所述具有突变的病毒的基因组中原本缺失的SEQ ID NO:2的全长或者其片段被至少部分或全部恢复。

在一些实施方式中，所述引物能够特异性结合于被部分或全部恢复的所述缺失的核酸。在一些实施方式中，所述引物能够特异性结合于具有如序列SEQ ID NO:1或2所示的序列。在一些实施方式中，所述引物具有序列SEQ ID NOs:3-6任一所述的序列。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有病毒核酸拷贝数大于或等于1×10¹⁰。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数大于或等于3×10¹⁰。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数大于或等于1×10¹¹。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸浓度大于或等于10ng/μl。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸浓度大于或等于100ng/μl。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸浓度大于或等于200ng/μl。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸摩尔浓度(以nM计)与所述PCR反应混合物中含有的所述引物的浓度(以nM计)的比值大于或等于1/1080。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸摩尔浓度(以nM计)与所述PCR反应混合物中含有的所述引物的浓度(以nM计)的比值大于或等于1/360。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸摩尔浓度(以nM计)与所述PCR反应混合物中含有的所述引物的浓度(以nM计)的比值大于或等于1/108。

在一些实施方式中，所述反应混合物进一步含有探针，所述探针能够特异性地显示含有所述突变的核酸的PCR扩增。

在一些实施方式中，所述探针在所述PCR反应混合物中的浓度大于或等于30nM。在一些实施方式中，所述探针在所述PCR反应混合物中的浓度大于或等于100nM。在一些实施方式中，所述探针在所述PCR反应混合物中的浓度大于或等于200nM。

在一些实施方式中，所述探针具有序列SEQ ID NO:7。在一些实施方式中，所述探针在5'端具有FAM，在3'段具有MGBNFQ。

在一些实施方式中，所述的方法还包括通过计算含有PCR扩增产物的微滴的数量来确定所述病毒样品中回复突变的数量。

在一些实施方式中，所述病毒样品中回复突变的数量为在每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中大于或等于1个拷贝。在一些实施方式中，病毒样品中回复突变的数量为在每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中为0-10000个拷贝、0-1000个拷贝、0-100个拷贝或0-10个拷贝。

在本申请的另一个方面中，提供了一种用于本申请所述检测病毒样品中回复突变的方法的试剂盒，其包括引物和探针。

在一些实施方式中，所述引物具有核苷酸序列SEQ ID NOs:3-6任一所述的核苷酸序列、或SEQ ID NOs:3-4的组合、或SEQ ID NOs:5-6的组合。

在一些实施方式中，所述探针具有核苷酸序列SEQ ID NO:7。

以上为本申请的概述，可能有简化、概括和省略细节的情况，因此本领域的技术人员应该认识到，该部分仅是示例说明性的，而不旨在以任何方式限定本申请范围。本概述部分既非旨在确定所要求保护主题的关键特征或必要特征，也非旨在用作为确定所要求保护主题的范围的辅助手段。

附图说明

通过下面说明与附图结合，将更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征。可以理解，这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式，因此不应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图，本申请内容将会得到更加明确和详细地说明。

图1示出了常规PCR方法检测阳性模板(即含有模拟回复突变的病毒核酸)的电泳照片。

图2A示出了荧光PCR方法检测阳性模板，其中未加入阴性模板(即不含有模拟回复突变的病毒核酸)，的标准曲线。

图2B示出了阳性模板中加入了阴性模板的荧光PCR方法的标准曲线。

图3A示出了用微滴式数字PCR方法检测未加入阴性模板的阳性模板所得到的结果拟合图。图中的横坐标代表阳性模板的理论拷贝数，纵坐标代表数字PCR方法检测出的实际拷贝数。

图3B示出了用微滴式数字PCR方法检测加入了阴性模板的阳性模板所得到的结果拟合图。图中的横坐标代表阳性模板的理论拷贝数，纵坐标代表数字PCR方法检测出的实际拷贝数。

图4A示出了使用25nM的探针时微滴式数字PCR方法的检测结果图。

图4B示出了使用250nM的探针时微滴式数字PCR方法的检测结果图。

图5A示出了对含有1.8×10⁹个拷贝的病毒核酸的样品用微滴式数字PCR方法进行检测的结果图。

图5B示出了对含有1.57×10¹¹个拷贝的病毒核酸的样品用微滴式数字PCR方法进行检测的结果图。

具体实施方式

本申请涉及一种检测病毒样品中回复突变的方法，其包括：获得所述病毒样品中的核酸；获得PCR反应混合物，所述PCR反应混合物包含所述核酸、引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，其中所述引物能够特异性地与发生回复突变的核酸通过碱基互补结合；将所述PCR反应混合物分散成多个微滴；对所述多个微滴分别进行PCR扩增；和检测在所述多个微滴中的PCR扩增产物。

病毒样品

病毒是一种生物物质，当其感染宿主细胞后，能够利用宿主细胞内的核酸复制和/或蛋白合成机制，复制自身核酸和/或合成自身蛋白。某些病毒还可以利用宿主细胞，组装出成熟的病毒颗粒，其包括外壳和包裹在外壳内的核酸基因组。病毒的核酸基因组可以是RNA或DNA，可以是单链核酸分子也可以是双链核酸分子。

病毒可以以不同的形式存在。在某些实施方式中，病毒可以是感染性的核酸分子，当进入宿主细胞后，可以利用宿主细胞内核酸复制机制进行核酸的复制。感染性的核酸分子包括DNA和RNA，可以是单链的，也可以是双链的。感染性的核酸分子的例子包括，例如，分离的病毒核酸基因组序列，或者载有病毒核酸基因组序列的质粒。在某些实施方式中，病毒可以是病毒颗粒，其包含外壳和包裹在外壳内的核酸基因组。病毒颗粒中的外壳可以包含蛋白外壳。病毒颗粒可以有不同的形状和大小(例如约0.02微米至0.3微米)。应理解，本申请所述的病毒包括上述任一的病毒形式，而不仅仅指成熟的病毒颗粒。

本申请所述的病毒不仅包括野生型病毒，也包括具有突变的病毒。术语“具有突变的病毒”在本申请中是指与野生型病毒相比，在核酸序列上存在改变的病毒，所述改变包括，例如，在病毒基因组序列中删除、插入和/或取代一个或多个核酸。具有突变的病毒可以包括天然突变的病毒，也包括人工突变的病毒。人工突变的方法可以包括，例如，使用一种或多种分子生物学技术对病毒的基因组序列进行人为改变，或者将病毒在非天然宿主细胞中进行人工传代以导致病毒基因组序列在传代过程中发生改变。人工突变的病毒可以包括重组病毒或者经过人工传代而导致基因组发生改变的病毒。在某些实施方式中，具有突变的病毒中的核酸删除、插入和/或取代发生在病毒的一个或多个基因序列中。所述缺失、插入和/或取代可以影响所述基因的功能，例如但不限于，降低或消除所述基因的功能、提高或引入所述基因的功能。病毒的非限制性实例包括流感病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、虫媒病毒、星状病毒、噬菌体、肠病毒、胃肠炎病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒(例如，爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒(HSV))、诺瓦克病毒、脊椎动物痘病毒亚科(例如，5型正痘病毒、牛痘病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒)、弹状病毒、呼肠孤病毒、鼻病毒、轮状病毒、逆转录病毒、杆状病毒科、杯状病毒科、花椰菜花叶病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科、野田村病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头瘤毒科、细小病毒科、藻类去氧核糖核酸病毒科、微小核糖核酸病毒科和披膜病毒科，以及衍生自这些病毒的变体病毒。还包括本领域已知的其它适合的病毒，例如Fields等在Virology(第34版，L ippincottffilliams&ffilkins(2001))中所描述的。

在一些实施方式中，本申请所述的病毒是腺病毒。成熟的腺病毒颗粒是一种中型的(直径为90-100nm)、含有约36kb双链DNA的无包膜二十四面体病毒颗粒。腺病毒的基因组通常不会整合至宿主细胞的染色体，而是保持线性游离体形式，从而极大降低了重组的腺病毒干扰正常细胞功能的可能性。本申请所述的腺病毒优选是人类腺病毒，但也可以是非人类腺病毒例如猿腺病毒、禽腺病毒、犬腺病毒、绵羊腺病毒或牛腺病毒。目前已知51种腺病毒的血清型，分别分为A到F共6个亚群：A亚群包括例如，血清型12、18和31；B亚群包括例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50；C亚群包括例如，血清型1、2、5和6；D亚群包括例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-48；E亚群包括例如，血清型4；F亚群包括例如，血清型40和41。本申请的检测方法可应用于任何适合的腺病毒血清型。在某些实施方式中，本申请的检测方法可应用于血清型2的腺病毒(其全基因组序列请参见Genbank登陆号：AC_000007)和血清型5的腺病毒(其全基因组序列请参见Genbank登陆号：AY339865)。

在某些实施方式中，本申请所使用的腺病毒是具有突变的腺病毒。所述具有突变的腺病毒的基因组已被改变，以缺失至少一部分野生型的病毒核酸序列，和/或者插入对于被改造的腺病毒而言是异源的核酸序列(例如可以是非腺病毒的核酸序列或者是不同血清型的腺病毒的核酸序列)、和/或者取代至少一部分野生型的病毒核酸序列。

在一些实施方式中，本申请所述的腺病毒是溶瘤性腺病毒。“溶瘤性腺病毒”在本申请中是指能够特异性地在肿瘤细胞中复制或者特异性地在肿瘤细胞中具有复制能力的腺病毒。在某些实施方式中，溶瘤性腺病毒包含肿瘤特异性启动子。“肿瘤特异性启动子”在本申请中是指优选地或特异性地在肿瘤细胞中具有启动基因表达的功能且在非肿瘤细胞或非癌细胞中无活性或具有降低活性的启动子。肿瘤特异性启动子的实例包括，但不限于，E2F-1启动子、α-甲胎蛋白启动子、缩胆囊肽启动子、癌胚抗原启动子、C-erbB2/neu癌基因启动子、环氧合酶启动子、CXCR4启动子、HE4启动子、II型己糖激酶启动子、L-网素启动子、MUC1启动子、PSA启动子、存活素启动子、TRP1启动子、和酪氨酸酶启动子。肿瘤特异性启动子可以通过基因工程的方式插入到腺病毒的基因组序列中或取代一部分腺病毒的天然序列。

在一些实施方式中，本申请所述的病毒(例如腺病毒)在某些病毒基因中缺失了至少部分的核酸。利用本领域公知的技术，可以对腺病毒基因组中的多种基因进行人工改造，以使其缺失至少部分核酸序列。例如，可以对腺病毒的复制必需的基因进行改造，以删除至少部分核酸，从而得到具有改变的复制能力的、有条件地复制能力的或复制缺陷的腺病毒。复制必需的基因是指参与腺病毒复制过程(例如，基因组复制、病毒颗粒的包装等)的基因，包括但不限于，腺病毒早期区基因(例如E1、E2和E4)、晚期区基因(例如L1、L2、L3、L4和L5)、参与病毒包装的基因(例如IVa2基因)和病毒相关RNA(例如VA-RNA-1和/或VA-RNA-2)。对于某个给定的腺病毒，本领域技术人员可以通过公知的方法确定出在某个感兴趣的基因中是否缺失了至少部分的核酸。例如，对于某个感兴趣的基因，可以使用已知的参考腺病毒(例如野生型腺病毒Ad5)的参考基因序列，在给定腺病毒的基因组中进行同源性比对，从而判断在给定腺病毒的对应的基因序列中是否缺失了部分核酸序列。可以使用本领域已知的同源性比对工具进行同源性比对，例如，

在某些实施方式中，本申请所述的腺病毒在E1(例如E1a和/或E1b基因)和/或E3基因中、在E1(例如E1a和/或E1b基因)和/或E2基因中、和/或在E1(例如E1a和/或E1b基因)和/或E4基因中缺失了至少部分核酸。所述腺病毒的E1(例如E1a、E1b)、E2、E3、E4基因序列可以根据参考腺病毒(例如野生型腺病毒Ad5)的对应的基因序列在所述腺病毒的基因组序列中进行同源性搜索得到确认。“缺失”或“删除”在本申请中是指，当给定腺病毒的对应基因与参考腺病毒的参考基因相比时，某一段核酸序列(长度至少为1个碱基)在参考腺病毒的参考基因中存在但是在特定腺病毒的对应基因的对应位置处为空缺。参考腺病毒可以是野生型腺病毒，例如但不限于Ad5，其基因组序列可参见Genebank登录号AY339865。在某些实施方式中，当与Ad5的基因组序列相比时，本申请所述的腺病毒可以在E1a基因中缺失对应于Ad5的E1a基因的SEQ ID NO:1所示区域的全长或者其片段，所述片段至少包括10bp、20bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、或500bp。在某些实施方式中，当与Ad5的基因组序列相比时，本申请所述的腺病毒可以在E1b基因中缺失对应于Ad5的E1b基因的SEQ ID NO:2所示区域的全长或者其片段，所述片段至少包括10bp、20bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、或500bp。不受理论的限制，腺病毒的E1a和/或E1b基因的缺失可能使得腺病毒无法在正常人类细胞中复制。

在一些实施方式中，本申请所述的腺病毒的E1a基因对应于Ad5全基因组序列(Genbank登陆号：AY339865)的第468-1632位核苷酸。在一些实施方式中，E1a基因具有如序列SEQ ID NO:1所示的序列。在一些实施方式中，本申请所述的腺病毒的E1b基因对应于Ad5全基因组序列(Genbank登陆号：AY339865)的第1672-3509位核苷酸。在一些实施方式中，E1b基因具有如序列SEQ ID NO:2所示的序列。

本申请所述的“病毒样品”是指含有病毒的材料或制剂，例如病毒制剂。在某些实施方式中，所述病毒样品是用于基因治疗的病毒制剂。

本申请所述的病毒样品可以在它们的天然状态(当收集时)和/或以改变的状态下进行分析，例如在储存、保存、抽提、溶解、稀释、浓缩、纯化、过滤、与一种或多种试剂混合的状态下。

回复突变

本申请所述的病毒的“回复突变”是指在具有突变的病毒中，所述突变的核酸序列被进一步改变以部分或全部恢复为突变以前的序列。回复突变的实例可以包括，例如：原本缺失的核酸序列被部分或全部恢复成缺失以前的核酸、或者原本被插入的核酸序列被部分或全部缺失、或者原本被取代的核酸序列被部分或全部恢复成取代以前的核酸序列。

在某些实施方式中，所述回复突变是在具有突变的病毒基因组中，原本缺失的核酸序列被至少部分或全部插入，从而部分或全部恢复成缺失以前的核酸序列。在某些实施方式中，所述具有突变的病毒基因组是具有突变的腺病毒基因组，例如溶瘤腺病毒基因组，其中可选地在E1a和/或E1b基因缺失了至少部分的核酸，例如，与Ad5相比时，其缺失对应于Ad5的E1a基因的SEQ ID NO:1所示区域的全长或者其片段，或缺失对应于Ad5的E1b基因的SEQ ID NO:2所示区域的全长或者其片段。

在一些实施方式中，所述回复突变涉及具有突变的腺病毒基因组(例如溶瘤性腺病毒基因组)中缺失的E1a基因或其片段、和/或缺失的E1b基因或其片段被至少部分或全部恢复。在一些实施方式中，所述缺失的E1a基因或其片段(例如SEQ ID NO:1所示的全长或其片段)被至少部分或全部恢复。在一些实施方式中，所述的E1b基因或其片段(例如SEQ ID NO:2所示的全长或其片段)被至少部分或全部恢复。

“至少部分恢复”是指，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的缺失的核酸被恢复(包括连续及间断的序列)。在某些实施方式中，缺失的核酸被至少部分恢复后，原本由于缺失而受影响的生物学功能至少部分或完全被恢复。

在一些实施方式中，每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中包含不多于10,000个拷贝的回复突变、不多于1,000个拷贝的回复突变、不多于100个拷贝的回复突变、不多于10个拷贝的回复突变或不多于1个拷贝的回复突变。在一些实施方式中，所述病毒样品中回复突变的数量为或者被怀疑为在每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中不超过10个拷贝，或者不超过1个拷贝。

获得所述病毒样品中的核酸

本申请的方法包括获得所述病毒样品中的核酸。本申请所述的核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。核酸可以是单链的，也可以是双链的。在一些实施方式中，本申请的核酸是指病毒样品本身的基因组核酸。例如，如果病毒样品是腺病毒，则核酸是指腺病毒的基因组核酸。

可以使用本领域已知的方法提取病毒样品中的核酸。可以使用本领域已知的从生物样品中提取核酸的方法(参见，例如Nucleic Acids Isolation Methods，Bowein(编)，American Scientific Publishers(2002)。在一些实施方式中，可以使用机械剪切(比如振荡、搅拌等)以破坏病毒颗粒从而使病毒样品中的核酸得以游离出来。通常而言，还可以通过常用的化学试剂(例如酚氯仿等)处理病毒样品，在保持核酸分子不受破坏的同时使蛋白质等杂质变性并沉淀，从而与核酸分子分离开来。分离的过程还可以使用抑制核酸酶的物质，以尽可能保持核酸分子的完整性。分离的核酸分子可以进一步被纯化，例如通过用无水乙醇洗涤并沉淀。

在一些实施方式中，本申请的方法还可以进一步包括对获得的核酸进行预处理以降低核酸粘度的步骤。在一些实施方式中，所述预处理包括使用核酸酶处理所述核酸以降低核酸粘度。核酸酶可以是位点特异性的核酸内切酶，其可以识别在核酸序列上的特定位点(即特定的序列)，并将核酸分子在该特定的位点处剪切，从而得到核酸片段。本领域公知的任何适当的核酸酶都可以使用。可以选择适当的核酸内切酶，以使得其识别的特定位点在待检测的发生回复突变的区域之外，从而避免对发生回复突变的区域的破坏。

获得PCR反应混合物

本申请的方法还包括获得PCR反应混合物。PCR反应混合物是指用于进行PCR反应的反应混合物。在一些实施方式中，PCR反应混合物包含从病毒样品中获得的核酸，还包含引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶。PCR反应混合物还可以进一步包含缓冲液(例如Tris-Cl缓冲液)，其有助于将反应混合物保持在适当的pH，以及可选地金属离子(例如Mg⁺²等)，其为某些核酸聚合酶发挥酶活性所必需。

在本申请的方法中，从病毒样品中获得的核酸中包含或者被怀疑包含极少量的回复突变，例如每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中不超过100个拷贝、不超过10个拷贝、或不超过1个拷贝的回复突变。通常，在基因治疗领域，美国FDA规定，用于基因治疗的病毒制品中，每3×10¹⁰个拷贝的病毒拷贝中应不超过1个拷贝的回复突变。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数大于或等于1×10¹⁰、3×10¹⁰或1×10¹¹。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数小于或等于1×10¹⁵、1×10¹⁴、1×10¹³或1×10¹²。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数为1×10¹⁰-1×10¹⁵、1×10¹⁰-1×10¹⁴、3×10¹⁰-1×10¹³或1×10¹¹-1×10¹²。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数是指进行一次检测所用的PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数。所述核酸拷贝数可以通过本领域公知的方法确定。例如，可以对获得的病毒样品中的核酸通过分光光度法检测，计算得到总拷贝数或总拷贝浓度，再根据在PCR反应混合物中的核酸的加入量或体积计算PCR反应混合物中的拷贝数；或者，可以直接对PCR反应混合物通过分光光度法检测，通过计算得到PCR反应混合物中的核酸拷贝数。

在一些实施方式中，为计算病毒样品的核酸拷贝数，可以将从病毒样品中获得的核酸用适当的溶液(例如TE缓冲液)溶解，使用分光光度计检测该核酸溶液在260nm的吸光值，使用获得的吸光值计算核酸的浓度进而根据核酸的分子量推算出核酸的拷贝数。例如，可以根据如下公式计算DNA浓度：

其中，A260＝260nm处的吸光值；L＝比色皿的厚度；N＝稀释倍数。

在一个实施方式中，当所述病毒样品是腺病毒时，可以根据如下公式计算腺病毒样品的单位体积中的病毒核酸拷贝数，再乘以核酸溶液的体积可以得出样品中病毒核酸的总拷贝数：

病毒核酸分子量＝碱基对数×660道尔顿。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸浓度大于或等于10ng/μl、100ng/μl或200ng/μl。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸浓度小于或等于500ng/μl、400ng/μl或300ng/μl。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸浓度为10-500ng/μl、100-400ng/μl或200-300ng/μl。所述核酸浓度可以通过本领域公知的方法确定。例如，可以对获得的病毒样品中的核酸通过分光光度法检测，通过计算得到核酸的浓度，再根据在PCR反应混合物中的核酸的加入量或体积，计算PCR反应混合物中的核酸浓度；或者，可以直接对PCR反应混合物通过分光光度法检测，通过计算得到PCR反应混合物中的核酸浓度。

在一个实施方式中，还可以计算病毒样品的核酸摩尔浓度。当所述病毒样品是腺病毒时，其摩尔浓度可以如下计算：

病毒核酸分子量＝碱基对数×660道尔顿。

在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸摩尔浓度为大于或等于0.83、2.5、或8.33nM。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数小于或等于83,333、8,333、833.3或83.3nM。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸拷贝数为0.83nM-83,333nM、0.83nM-8,333nM、2.5nM-833.3nM或8.33nM-83.3nM。

本申请所述的“引物”是指能够和/或用于起动核酸模板的复制的寡聚核苷酸分子，其具有7-40个核苷酸、10-38个核苷酸、15-30个核苷酸、15-25个核苷酸，或者17-20个核苷酸。例如，引物可以是长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的寡聚核苷酸。引物可以包含DNA、RNA、核酸类似物、或其任意的组合。示例性引物可以是化学合成的。在某些实施方式中，在所述PCR混合物中可以使用至少一对引物。在一对引物中，其中一条引物可以与双链核酸的5’-3’链的第一位置结合，另一条引物可以与双链核酸的3’-5’链的第二位置结合，当通过PCR反应延伸这对引物时，可以扩增获得包括从第一位置开始到第二位置结束的双链核酸分子的核酸分子，该核酸分子也叫扩增子。

在一些实施方式中，所述引物与发生回复突变的核酸通过碱基互补结合。本申请中“通过碱基互补结合”是指在所述引物与靶核酸分子之间可以有足够数量的碱基互补形成氢键，使得该引物能够与靶核酸分子的靶序列结合并通过PCR反应扩增该靶序列。引物能够与靶核酸特异性地通过碱基互补结合，并且能够自其3’端开始延伸。在某些实施方式中，引物中至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的碱基与靶核酸通过碱基互补配对。在一些实施方式中，在本申请的方法中引物与病毒核酸的发生回复突变的区域的至少一部分或其相邻的区域通过碱基互补结合。本领域技术人员可以根据回复突变的具体情况设计引物，使其与发生回复突变的核酸通过碱基互补结合。

举例来说，当回复突变涉及将原本被插入的核酸序列部分或全部缺失时，所述引物可以与原本位于所述被缺失的序列两侧但由于发生缺失而被融合在一起的序列通过碱基互补结合，该融合序列存在于发生缺失(即回复突变)的病毒核酸中，但在没有回复突变的病毒核酸中则不存在。

当回复突变涉及在原本被缺失的核酸序列的位置插入其他的核酸，或原本被缺失的核酸序列部分或全部恢复成缺失以前的核酸序列时，所述引物可以与所述插入序列(或恢复的序列)或其至少一部分通过碱基互补结合，或者与所述插入序列与其插入点的某一侧或两侧序列融合在一起的融合序列通过碱基互补结合，该插入序列(或恢复的序列)或其融合序列存在于发生插入(即回复突变)的病毒核酸中，但在没有回复突变的病毒核酸中则不存在。

当回复突变涉及将原本被取代的核酸序列部分或全部恢复成取代以前的核酸序列时，所述引物可以与恢复的序列或者该恢复的序列与其某一侧或两侧序列融合在一起的融合序列通过碱基互补结合，该恢复的序列或其融合序列存在于发生取代(即回复突变)的病毒核酸中，但在没有回复突变的病毒核酸中则不存在。

在一些实施方式中，所述回复突变涉及病毒样品中的核酸中的缺失被恢复。在某些实施方式中，被缺失的核酸序列可以部分或全部恢复成缺失以前的核酸序列。在某些实施方式中，所述回复突变涉及腺病毒的基因(例如E1a、E1b、E1、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5)中的缺失被全部或部分恢复。对于这样的回复突变，可以使用与被恢复的核酸序列或其片段(例如E1a、E1b、E1、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5中被恢复的序列或其片段)通过碱基互补结合，或者与所述被恢复的核酸序列与其某一侧或两侧序列融合在一起的序列通过碱基互补结合的引物。

在一些实施方式中，所述回复突变涉及腺病毒中的如SEQ ID NO:1所示的序列被至少部分或全部恢复。在一些实施方式中，所述引物能够特异性地与具有如SEQ IDNO:1所示的序列通过碱基互补结合。在一些实施方式中，所述引物可以具有SEQ IDNO:3或4所示的序列。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中具有引物对，该引物对包括SEQ ID NO:3和4的组合。

在一些实施方式中，所述回复突变涉及腺病毒中的如SEQ ID NO:2所示的序列被至少部分或全部恢复。在一些实施方式中，所述引物能够特异性地与具有如SEQ IDNO:2所示的序列通过碱基互补结合。在一些实施方式中，所述引物可以具有SEQ IDNO:5或6所示的序列。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中具有引物对，该引物对包括SEQ ID NO:5和6的组合。

在某些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸摩尔浓度(以nM计)与所述PCR反应混合物中含有的所述引物的浓度(以nM计)的比值大于或等于1/1080、1/360或1/108。在一些实施方式中，所述PCR反应混合物中含有的所述病毒样品的核酸摩尔浓度(以nM计)与所述PCR反应混合物中含有的所述引物的浓度(以nM计)的比值在1/1080-100/108、1/1080-10/108、1/1080-1/108、1/360-100/108、1/360-10/108、1/360-1/108、1/108-10/108、或1/108-100/108。

在某些实施方式中，所述PCR反应混合物的总体积可以是0.05-5000μl、5-3500μl、5-1000μl、5-500μl、10-350μl或10-30μl。在一些实施方式中，PCR反应混合物的总体积为20μl。在某些实施方式中，可以通过调整引物和病毒样品分别占所述PCR反应混合物的体积来优化PCR反应混合物的配置。

核苷酸单体混合物可以是脱氧核苷三磷酸混合物。脱氧核苷三磷酸混合物包括脱氧核苷三磷酸单体，包括但不限于dATP、dTTP、dGTP和dCTP。

“核酸聚合酶”在本申请中是指任何具有使用存在的多核苷酸作为模板催化多核苷酸合成功能的多肽。本领域公知的任何适合DNA合成或复制的聚合酶都可以使用。核酸聚合酶的例子包括，但不限于，Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等)、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其组合。在一些实施方式中，可以使用一种或多种耐热的聚合酶来完成PCR，例如Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等)、PfuDNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其组合。

在某些实施方式中，所述PCR混合物中还可进一步包含能够检测PCR扩增产物的检测分子。在一些实施方式中，所述检测分子能够特异性地显示含有所述突变的核酸的PCR扩增产物。本领域公知的任何适合的检测分子都可以使用，例如能够特异性与PCR扩增区域结合的核酸探针、或能够检测核酸双链的染料分子等。染料分子的例子包括，但不限于，Green、LC Green、Eva Green、BEBO、BOXTO、BYTO9。核酸探针是指带有可检测标记的寡核苷酸分子。可检测标记可以是荧光分子、同位素标记等。可检测标记可以与探针的寡核苷酸分子共价连接，例如，共价连接在寡核苷酸的5’端和/或3’段端。

在一些实施方式中，核酸探针可以特异性地结合靶区域，例如病毒核酸中的待扩增区域。在一些实施方式中，核酸探针具有荧光分子和淬灭分子，在探针完整时，即使荧光分子被激发，由于荧光分子的附近具有淬灭分子，因此不发出荧光。当核酸探针与病毒核酸中的待扩增区域结合时，随着靶序列被扩增，核酸聚合酶由3'-5'方向延伸引物并合成新生链，在核酸聚合酶遇到与模板结合的核酸探针时，核酸聚合酶的5'-3'的外切酶活性会切断探针，从而使荧光分子和淬灭分子分离，此时如果荧光分子被激发，则会发出荧光。随着扩增循环的增加，被剪切的核酸探针也随之增加，荧光也会相应地增强，荧光信号与被剪切的探针的数量基本上成正比(即，与由引物延伸产生的PCR扩增产物的量基本上成正比)。

荧光分子例子可以包括，但不限于，6-羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、Alexa、CF、HEX、VIC、ROX、德克萨斯红(Texas Red)、CY5、Quasar。淬灭分子的例子可以包括，但不限于，四甲基罗丹明(TAMRA)、小沟结合非荧光淬灭剂(Minorgroove binding non-fluorescent quencher(MGBNFQ))、Eclipse、BHQ。在某些实施方式中，所述荧光分子是FAM、所述淬灭分子是MGBNFQ。在一些实施方式中，所述探针在5'端具有FAM，在3'段具有MGBNFQ。检测分子的示例还可以参见美国专利号5,723,591和5,928,907；WO2011066476和WO2012149042；www.idahotech.com；Gudnason等人，NucleicAcids Res.，35(19)：e127(2007)，其全文通过引用并入本申请。

在一些实施方式中，所述核酸探针中的寡核苷酸分子可以特异性地与PCR扩增产物的非引物部分的区域结合。所述核酸探针中的寡核苷酸分子可以特异性地与E1a基因或E1b基因中的序列结合。在一些实施方式中，所述探针具有如SEQ ID NO:7所示的序列。

在一些实施方式中，所述探针在所述PCR反应混合物中的浓度大于或等于30nM、100nM或200nM。在一些实施方式中，所述探针在所述PCR反应混合物中的浓度范围为30nM-500nM、100nM-400nM或200nM-300nM。

将所述PCR反应混合物分散

本申请的方法还包括将所述PCR反应混合物分散成多个微滴。

“微滴”在本申请中是指PCR反应混合物被分散后形成的具有微小体积的液体。所述多个微滴中至少有50％(例如至少60％、70％、80％)的微滴的体积，和/或所述多个微滴的平均体积，可以是例如小于约1微升(或在约1微升与1纳升之间或在约1微升与1皮升之间)、小于约1纳升(或在约1纳升与约1皮升之间)、或小于约1皮升(或在约1皮升与1飞升之间)等。微滴可以是球形的或非球形的。微滴可以是单相的(例如水相)，或者是多相的液滴(例如油包水或者水包油的液滴)。

在一些实施方式中，将所述PCR反应混合物分散成多个微滴的步骤包括将所述PCR反应混合物和油相混合以形成含有所述油相和水相的乳液，并将所述乳液分散成多个微滴。油相是指与水不互溶的液体，水相是指具有亲水性的液体(例如水或缓冲溶液)。油相可以具有高含量的碳，在一些实例中，还可以具有高含量的氢、氟、硅、氧、或其任何组合。油相可以是一种水不互溶液体，或者两种或以上水不互溶液体的混合物。例如，所述油相可以包括至少一种硅油、矿物油、氟烷油、植物油或其组合。在一些实施方式中，所述油相可形成用于数字PCR的稳定乳液。在一些实施方式中，所述油相是硅油和含氟化合物的混合物。油相的示例性配方可参见WO2010036352A1、WO2011066476和US20140170736，其全文通过引用并入本申请。

在某些实施方式中，所述乳液是油包水的乳液，即被连续油相包裹的水相，其中所述PCR反应混合物存在于水相中。

在某些实施方式中，所述乳液中还可以包含至少一种表面活性剂。表面活性剂的例子包括，但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、Tween20、Krytox^TM、Pluronic>

可以使用本领域已知的适合的方法将PCR反应混合物分散成多个微滴。在一些实施方式中，先将存在于PCR反应混合物与油相混合，之后再形成微滴。在一些实施方式中，存在于水相中的PCR反应混合物和油相混合与微滴的形成同时发生。在一些实施方式中，通过机械剪切力完成PCR反应混合物与油相的混合。在一些实施方式中，通过微孔通道完成PCR反应混合物与油相的混合。在一些实施方式中，使用QX100^TM微滴发生器(BIO-RAD)或其后续更新产品形成微滴。形成微滴的示例性方法可以参见US20110092376、US20110311978、WO2011120006、WO2011120020、WO>

在一些实施方式中，所述多个液滴可以是，例如1,000-100,000个、5,000-50,000个或10,000-30,000个微滴。

对微滴分别进行PCR扩增

本申请的方法还包括对所述多个微滴分别进行PCR扩增。在某些实施方式中，所述多个微滴中的每一个被分隔在单独的空间里进行PCR扩增。例如，多个微滴中的每一个可以位于单独的微孔中，并且在所述微孔中进行PCR扩增。可以使用本领域公知的方法将多个微滴分隔在单独的空间。例如，可以将多个微滴分隔在微孔板(例如96孔板、384孔板等)的单独的微孔中，集成流体通路(IFC)芯片的单独的反应板上，或者平板的单独的反应孔中。

可以使用交替加热和冷却的循环以进行PCR扩增。一个循环的PCR扩增通常包括在变性温度下使模板核酸分子解链成单链、在退火温度下使引物与单链的模板核酸分子通过碱基互补结合、和在延伸温度下使核酸聚合酶延伸引物。根据具体的情况不同，退火温度和延伸温度可以相同或不同。

检测在所述多个微滴中的PCR扩增产物

本申请的方法还包括检测所述多个微滴中的PCR扩增产物。在某些实施方式中，通过计算含有PCR扩增产物的微滴的数量来确定所述病毒样品中回复突变的数量。在某些实施方式中，含有PCR扩增产物的微滴具有可检测的信号，例如荧光信号。通过检测该信号，可确定被检测的微滴中是否存在PCR扩增产物，和/或PCR扩增产物的量。可以通过本领域公知的方法检测微滴中的可检测信号。例如，可以使用检测器对每个微滴进行成像，并将成像结果进行分析。示例的检测/成像装置例如WO2007091228、WO2007091230、WO2008038259、WO2010036352、Zhang等人Nucleic Acids Res.，35(13)：4223-4237(2007)、Wang等人，J.Micromech.Microeng.，15：1369-1377(2005)；Jia等人，38：2143-2149(2005)；Kim等人，Biochem.Eng.J.，29：91-97；Chen等人，Anal.Chem.，77：658-666；Chen等人，Analyst，130：931-940(2005)；Munchow等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，5：613-620(2005)；Charbert等人，Anal.Chem.，78：7722-7728(2006)；和Dorfman等人，Anal.Chem，77：3700-3704(2005)中所描述的那些，其全文通过引用并入本申请。可以对流动的或静态的微滴进行检测。

在一些实施方式中，本申请的检测方法还包括通过记录含有PCR扩增产物的微滴的数量来确定所述病毒样品中回复突变的数量。在一些实施方式中，根据泊松分布原理或其它适用的统计学方法对阳性微滴进行计算，从而确定所述病毒样品中回复突变的量。示例性的统计学方法可以参见WO2010036352，其全文通过引用并入本申请。

在一些实施方式中，所述病毒样品中回复突变的数量为在每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中大于或等于1个拷贝。在一些实施方式中，病毒样品中回复突变的数量为在每3×10¹⁰个拷贝的病毒样品中为0-10,000个拷贝、0-1,000个拷贝、0-100个拷贝或0-10个拷贝。

试剂盒

本申请的另一方面提供了一种用于本申请所述检测病毒样品中回复突变的方法的试剂盒，其包括引物和探针。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括具有如SEQ ID NOs:3-6任一所示的核苷酸序列的引物。在一些实施方式中，所述试剂盒包括具有如SEQ ID NOs:3-4所示的核苷酸序列的引物组合。在一些实施方式中，所述试剂盒包括具有如SEQ ID NOs:5-6所示的核苷酸序列的引物组合。在一些实施方式中，所述的试剂盒包括连接有第一标记和第二标记的具有如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的核酸探针。第一标记可以是TAMRA、MGBNFQ、Eclipse或BHQ，第二标记可以是FAM、TET、Alexa、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、CY5或Quasar。

在某些实施方式中，所述试剂盒还可以包含微滴生成油。在某些实施方式中，微滴生成油可以包括至少一种硅油、矿物油、氟烷油、植物油或其组合。在一些实施方式中，微滴生成油是硅油和含氟化合物的混合物。微滴生成油的示例性配方可参见WO2010036352A1、WO2011066476和US20140170736，其全文通过引用并入本申请。

该试剂盒还可包含一种或多种限制酶、内切核酸酶、外切核酸酶、连接酶、聚合酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、逆转录酶、拓扑异构酶、激酶、磷酸酶、缓冲液、盐、金属离子、还原剂、BSA、精胺、亚精胺、甘油、和/或核苷酸单体混合物。该试剂盒还可以包含一套或多套说明书。

本申请的应用

由于病毒样品中具有的回复突变的病毒拷贝数可能只占总的病毒拷贝数的极少数，在绝对数量上更可能仅有个位数的拷贝，而且具有回复突变与不具有回复突变的病毒基因差异较小。因此，要准确定量检测如此痕量的回复突变非常困难，在技术上面临巨大的挑战。

现有技术中尚无使用数字PCR检测重组病毒回复突变的报道，而且基于现有数字PCR对模板核酸量的上限要求，现有的数字PCR显然无法根据监管部门的要求检测重组病毒回复突变。而本申请的发明人通过对数字PCR的改进，成功检测出了在高背景下的低拷贝数(例如1个拷贝)的回复突变。因此，本申请的方法可用于检测病毒样品中存在的潜在的回复突变，特别是能够应用于回复突变率极低(例如不超过三百亿分之一)的病毒样品，而这样的病毒样品通过现有技术的方法往往不能被准确检测或者由于回复突变低于检测限而被误检为假阴性。本申请的方法可以提高重组病毒制品及类似产品用于人体的安全性，还可用于检测高核酸浓度和/或高拷贝浓度的病毒样品，使得原本可能需要分成多个亚体积分别进行检测的样品能够在一个反应中直接检测，这大大提高了反应效率和反应准确性，并且显著减少了误差。

实施例

下文列出实施例的目的是用于帮助对本申请中所述发明的理解，其不会通过任何方式构成对本申请保护范围的限制。

实施例1 常规PCR方法检测

使用的试剂：2×BenchTop Taq MasterMix(SinoBio)、病毒DNA抽提试剂盒(GenerayBio)、鲑鱼精DNA(Invitrogen)、pFG140质粒(Admax公司)、E1a基因的检测引物对(P1：5′-GGCGGAAGTGTGATGTTGC-3′(SEQ ID NO:3)；P2：5′-AACATCCGCCTAAAACCGC-3′(SEQ ID NO:4))。

使用的主要设备及耗材：普通PCR仪、微量核酸蛋白定量仪(Themofisher)、带滤芯的Tip(200μl，20μl)、0.2ml凸盖EP管、Parafilm膜、水平电泳仪(天能)、凝胶成像系统(天能)。

阴、阳性模板的制备

将含有待扩增序列(即：野生型Ad5病毒的E1a基因的463-530碱基，含包装信号的5个碱基)的pFG140(Admax公司)作为阳性模板，不含有待扩增序列的鲑鱼精DNA作为阴性模板。待扩增序列如SEQ ID NO:8所示。

碱裂解法抽提pFG140质粒，酚氯仿抽提数次以提高质粒的纯度，用无菌水将pFG140分别稀释为每μl含量为1×10⁰到1×10⁵拷贝的6个浓度梯度，每个梯度配置各100μl的溶液。将100μl溶液分装成10等分，冻于-70度，用时取出一管，用完丢弃。

鲑鱼精DNA配制成浓度为每μl含3×10¹⁰拷贝鲑鱼精DNA的溶液，配制100μl，同样分装成10等分，冻于-70度。

常规PCR的方法检测

按照表1配置PCR反应体系。以pFG140为阳性模板，浓度分别为1×10⁰、1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、或1×10⁵拷贝/μl，每个浓度做2个重复。

以鲑鱼精DNA为阴性模板，浓度为3×10¹⁰拷贝/μl，做2个重复。

以无菌水为空白模板，做2个重复。

含有空白模板和阴性模板的PCR反应混合物在密闭无阳性模板污染的区域配制，避免与阳性模板的反应混合物发生交叉污染。

表1：PCR反应的混合物(共20μl)

无菌水8.6μl2×BenchTop Taq Master Mix10μl引物P10.2μl引物P20.2μl模板1μl

PCR的反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃10秒，55℃30秒，共40个循环。

检测

使用水平电泳仪对样品进行检测。每个泳道的上样量为1μl。检测结果请参见图1，其中1-6泳道为无菌水空白模板的PCR扩增产物，7-8泳道为鲑鱼精DNA阴性模板的PCR扩增产物，9-10泳道为含有1×10⁰个拷贝的pFG140阳性模板的PCR扩增产物，11-12泳道为含有1×10¹个拷贝的pFG140阳性模板的PCR扩增产物，13-14泳道为含有1×10²个拷贝的pFG140阳性模板的PCR扩增产物，15-16泳道为含有1×10³个拷贝的pFG140阳性模板的PCR扩增产物，17-18泳道为含有1×10⁴个拷贝的pFG140阳性模板的PCR扩增产物，19-20泳道为含有1×10⁵个拷贝的pFG140阳性模板的PCR扩增产物。

结果与讨论

如图1所示，无菌水空白模板(1-6泳道)未见有扩增产物；鲑鱼精DNA阴性模板(7-8泳道)也未有扩增产物，说明防交叉污染效果好，灵敏度检测结果可靠；pFG140阳性模板在低于1×10²个拷贝时(9-12泳道)未检测到扩增产物，从1×10²个拷贝开始(13-20泳道)能够检测到扩增产物。实验结果说明，常规PCR对目标核酸的最低检测限在1×10²个拷贝左右，当目标核酸的初始含量低于1×10²个拷贝时，常规PCR难以准确检测出其扩增产物的存在。

由此可见，当病毒样品中发生的回复突变的绝对拷贝数较低时(例如低于1×10²个拷贝)，常规PCR难以对其进行准确的检测。由于美国食品药品监督管理局要求回复突变率应低于每3×10¹⁰个拷贝的病毒中不超过1个回复突变，如此低的绝对拷贝数是常规PCR无法准确检测的。而且，考虑到序列相似的其他3×10¹⁰个拷贝的未回复突变的病毒核酸对该检测可能造成的潜在的干扰，常规PCR更难以对其进行检测。

实施例2 荧光定量PCR方法检测

使用的试剂：标准质粒抽提试剂盒：TIANprep Midi Plasmid Kit(TIANGEN，DP106)；荧光定量PCR试剂盒：SYBR Green Realtime PCR Master mix(TOYOBO，QPK-212)、pFG140质粒(Admax公司)、E1a基因的检测引物对SEQ ID NOs:3和4。

使用的主要设备及耗材：生物安全工作台、分光光度计、ABI荧光定量PCR仪(复旦研发平台)、96孔板及封板膜。

阳性模板和阴性模板的制备

为模拟对病毒样品的回复突变的检测，将含有待扩增序列(即：SEQ ID NO:8)的pFG140质粒作为阳性模板(即，模拟回复突变的病毒拷贝)，将不含有待扩增序列的pAdEasy-1质粒作为阴性模板(即，模拟不具有回复突变的病毒拷贝)。pFG140质粒含有野生型Ad5的部分基因组序列，并且含有E1a基因。pAdEasy-1质粒也含有野生型Ad5的部分基因组序列，但不含有E1a基因。

将pFG140质粒和pAdEasy-1质粒分别转化E.coli感受态细胞，挑斑接菌12ml，用TIANprep Midi Plasmid Kit抽取质粒，取少量质粒用Pme I线性化完全，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10分钟，12,000rpm离心10分钟，弃上清，然后用75％的乙醇洗沉淀2次，室温晾干，加适量TE溶解，分光光度计检测DNA的浓度，并用下面公式计算dsDNA的单位体积中的拷贝数。

病毒核酸分子量＝碱基对数×660道尔顿。

荧光定量PCR标准曲线的测定

按照表3配置PCR反应体系。

为确定荧光定量PCR对目标核酸拷贝数的检测限，配置以下PCR反应体系：以1、3、10、100、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、或1×10⁶个拷贝的pFG140质粒用PmeI线性化后得到的片段作为阳性模板，做2个重复，P1和P2(如下表2)为引物。同时以无菌水作为空白模板进行对照试验。按照以下PCR反应程序进行PCR反应，并检测PCR扩增产物。

为确定在回复突变的检测中，大量的未回复突变的病毒核酸对回复突变检测的潜在干扰，配置以下PCR反应体系：在1.8×10⁹个pAdEasy-1质粒用PmeI线性化后得到的片段中按浓度梯度掺入1、3、10、100、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、或1×10⁶个拷贝的pFG140质粒，每个浓度做2个重复，以P1和P2(如下表2)为引物。同时以无菌水作为空白模板进行对照试验。按照以下PCR反应程序进行PCR反应，并检测PCR扩增产物。

表2：荧光定量PCR的引物

表3：PCR反应的混合物(共20μl)

无菌水6.4μlSYBR Green Realtime PCR Master mix10μl引物P1(终浓度为900nM)0.8μl引物P2(终浓度为900nM)0.8μl模板(约含1.8×10⁹个拷贝)2μl

PCR的反应程序为：95℃预变性60秒；95℃15秒，45℃15秒，72℃45秒，共40个循环。熔解曲线分析程序为：95℃15秒；60℃30秒，95℃15秒。

结果与讨论

荧光PCR的实验数据显示，当只含有空白模板或阴性模板时，检测不到扩增产物，也无法计算阈值循环(Ct值)。当阳性模板的含量为1个拷贝时，也检测不到扩增产物，无法计算Ct值。当阳性模板的含量为10个拷贝或更多时，不管是否掺入阴性模板，都能够检测并计算Ct值。

使用BIO-RAD iQ5软件及自带数据处理方法，对检测到的Ct值进行数据分析，对只有阳性模板的PCR扩增结果绘制标准曲线，结果请参见图2A；另外对掺入了阴性模板的阳性模板的PCR扩增结果绘制标准曲线，结果请参见图2B。

实验结果表明，荧光定量PCR对目标核酸的最低检测限在10个拷贝左右，当目标核酸的初始含量低于10个拷贝时，荧光定量PCR难以直接检测出其扩增产物的存在，进而需要通过标准曲线外推的方式推测目标核酸的初始含量(见图2A和2B)。由此可见，当病毒样品中发生的回复突变的绝对拷贝数较低时(例如低于10个拷贝)，荧光定量PCR难以对其进行准确的检测。由于美国食品药品监督管理局要求回复突变率应低于每3×10¹⁰个拷贝的病毒中不超过1个回复突变，如此低的绝对拷贝数用荧光定量PCR也难以准确检测。

此外，在检测回复突变时，荧光定量PCR还会受到未回复突变的核酸拷贝的干扰。如图2A和2B所示，掺入阴性模板后的标准曲线的E值(E＝306.1％，请参见图2B)明显大于未掺入阴性模板的标准曲线的E值(E＝257.3％，请参见图2A)，而E值大于100％时提示PCR反应体系中存在PCR的抑制物，E值越大，表明抑制作用越强，这说明掺入阴性模板后干扰了荧光定量PCR的效率。

实施例3 数字PCR方法检测

使用的试剂：微滴分析专用油(Droplet reader oil)，含2个1L瓶装微滴分析专用油(BIO-RAD，1863004)；微滴生成油(Droplet generation oil)，含10个7mL瓶装微滴生成油(BIO-RAD，1863005)；探针用2X ddPCR supermix，含5个1mL管装PCR预混液(BIO-RAD，1863005)；QIAfilter Plasmid Maxi Kits(QIAGEN，12262)、pFG140质粒(Admax公司)；E1b的检测引物对(SEQ ID NOs:5-6)；E1b的检测探针SEQ ID NO:7。

使用的主要设备及耗材：QX100^TM微滴式数字PCR系统(QX100^TM微滴发生器，QX100^TM微滴分析仪，BIO-RAD)；生物安全工作台；分光光度计；ddPCR用DG8微滴发生卡，含一包24个微滴发生卡(BIO-RAD，1863008)；ddPCR用DG8密封垫，含一包24个密封垫(BIO-RAD，1863009)；96孔半裙边板(Twin>

阳性模板和阴性模板的制备

为模拟对病毒样品的回复突变的检测，将含有待扩增序列(即：野生型Ad5病毒的E1b基因的1712-1811碱基)的pFG140质粒作为阳性模板，含有野生型Ad5的部分基因组序列但不含有E1b基因的质粒(在本实施例中称为阴性质粒)作为阴性模板。待扩增序列如SEQ ID NO:9所示。

将pFG140质粒和阴性质粒转化E.coli感受态细胞，挑斑接菌200ml，用QIAfilterPlasmid Maxi Kits抽提质粒，取少量质粒用Pme I线性化完全，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心10min，弃上清，然后用75％的乙醇洗沉淀2次，室温晾干，加适量TE溶解，分光光度计检测DNA的浓度，并用下面公式计算dsDNA的单位体积中的拷贝数。

病毒核酸分子量＝碱基对数×660道尔顿。

微滴式数字PCR的测定

按照表5配置PCR反应体系。

为确定微滴式数字PCR对目标核酸拷贝数的检测限，配置以下PCR反应体系：以1、10、100、1000个拷贝的pFG140质粒线性化片段为模板，P3和P4(如下表4)为引物。同时以无菌水作为空白模板进行对照试验。按照以下PCR反应程序进行PCR反应，并检测PCR扩增产物。

为确定在回复突变的检测中，大量的未回复突变的病毒核酸对回复突变检测是否存在潜在干扰，配置以下PCR反应体系：在1.8×10⁹个阴性质粒线性化片段中按浓度梯度掺入1、10、100、1000个拷贝的pFG140线性化片段DNA为模板，以P3和P4(如下表4)为引物。同时以无菌水作为空白模板进行对照试验。按照以下PCR反应程序进行PCR反应，并检测PCR扩增产物。

表4：微滴式数字PCR的引物与探针

表5：PCR反应的混合物(共20μl)

无菌水3.9μl2X探针用ddPCR supermix10μl引物P3(终浓度为900nM)1.8μl引物P4(终浓度为900nM)1.8μl探针(终浓度为250nM)0.5μl模板(约含1.8×10⁹个拷贝)2μl

PCR的反应程序为：95℃预变性10分钟；95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环；98℃10分钟。

结果与讨论

表6：数字PCR检测结果

微滴式数字PCR的实验结果如表6所示。使用Excel软件以表6的数据进行作图，以阳性模板的理论拷贝数为横坐标，实际检测到的阳性微滴数为纵坐标。只有阳性模板的PCR扩增结果请参见图3A，掺入了阴性模板的阳性模板的PCR扩增结果请参见图3B。

由表6、图3A和3B所示，微滴式数字PCR对目标核酸的最低检测限甚至可以达到1个拷贝。由此可见，即使当病毒样品中发生的回复突变的绝对拷贝数极低时(例如个位数的拷贝)，微滴式数字PCR也能够对其进行准确的检测。

此外，实验数据还表明，微滴式数字PCR在检测回复突变时不会受到未回复突变的核酸拷贝的干扰。如图3A和3B所示，掺入阴性模板后，阳性模板的理论值与实测值仍然保持了良好的线性相关性，其R²值和斜率(R²＝0.999，斜率＝0.969，请参见图3B)与未掺入阴性模板的曲线的R²值和斜率(R²＝0.999，斜率＝0.959请参见图3A)保持高度一致，这表明阴性模板的掺入并未影响数字PCR检测的准确性。即使在掺有1.8×10⁹个拷贝的阴性模板的情况下，微滴式数字PCR仍能够准确检测出低至1个拷贝的阳性模板。因此，微滴式数字PCR的检测方法有潜力能够满足美国食品药品监督管理局对检测回复突变的要求，即准确检测出每3×10¹⁰拷贝中不多于1个拷贝的回复突变。

考虑到病毒核酸中发生回复突变的绝对数量通常比较低，这就要求检测方法的检测限足够低，而且在接近检测限时仍然能够准确地检测。而且由于发生回复突变的核酸掺杂在大量的且极其相似的未回复突变的病毒核酸中，就如同在数以百万计的几乎完全相同的分子中要准确找出具有细微差异的那一个或几个目标分子，这就要求检测方法能够排除未回复突变的核酸的巨大干扰，准确地找到其中混杂的极少数的目标分子。本申请的发明人发现，常规PCR和荧光定量PCR在检测回复突变的方面都具有明显的缺陷，难以提供准确的检测结果，而本申请的数字PCR却能够在检测限和排除干扰这两方面都提供巨大的优势，从而为回复突变的准确检测提供可靠的技术保障。

实施例4 数字PCR的条件优化

本实施例中的微滴式数字PCR的实验方法同实施例3。简单地说，为模拟对病毒样品的回复突变的检测，将含有待扩增序列(即：SEQ ID NO:9)的pFG140质粒作为阳性模板，含有野生型Ad5的部分基因组序列但不含有E1b基因的质粒(在本实施例中称为阴性质粒)作为阴性模板。单个引物在PCR反应混合物中的终浓度为900nM。

探针浓度的优化

发明人首先对探针浓度进行了优化。微滴式数字PCR的实验方法同实施例3，区别仅在于PCR反应混合物的组分浓度进行了调整。在本实验中，在1.8×10⁹个阴性质粒线性化片段中按浓度梯度掺入1、10、100、1000个拷贝的pFG140线性化片段DNA为模板。

按照以下的配方，配置得到探针终浓度为25nM或探针终浓度为250nM的PCR反应混合物。

含25nM终浓度探针的反应混合物1：

含250nM终浓度探针的反应混合物2：

将上述反应混合物1和2分别进行微滴式数字PCR反应，得到的结果请分别参见图4A(探针浓度25nM)和图4B(探针浓度250nM)。如图4A所示，阳性信号几乎都在1000-2000之间，距离264的阈值线较近；而提高探针浓度后，如图4B所示，阳性信号普遍提高，达到8000以上甚至到12000，远远超过1336的阈值线。这表明，探针浓度的提高显著提高了阳性信号的强度，使得原本可能由于探针不足而未能检测到的阳性微滴被准确地检测，从而大大提高了检测的准确性。

模板量

发明人对模板量也进行了优化。根据微滴式数字PCR的仪器厂家Bio-rad的要求，在20μl的PCR反应混合物中，每μl最多可加3.3ng模板，也就是说一个20μl的反应混合物最多可加66ng模板，按照这个要求，每个20μl的反应混合物最多只能检测1.8×10⁹个拷贝的腺病毒模板。FDA的要求是在3×10¹⁰个拷贝的病毒分子中不能超过1个回复突变。如果按照厂家的要求，则需要将3×10¹⁰个拷贝的病毒样品分成17份，每份进行单独的反应，并将17个反应的结果加在一起才能得出最终的结果。但是，这样操作会大大增加工作量，而且分割的反应个数越多则会导致误差越大，影响检测结果的准确性。

本申请在20μl反应混合物中加入5.67μg的阴性模板(相当于1.57×10¹¹个拷贝腺病毒DNA分子)，在这个反应混合物中掺入5个拷贝的阳性模板(这也符合FDA的要求)，并进行微滴式数字PCR检测。为了能够加入如此大量的模板，本申请调整了PCR反应混合物的配比，还同时提高了探针的浓度。该反应混合物称为反应混合物4，具体配置如下所示。

反应混合物4：

将实施例3中的模板量为1.8×10⁹个拷贝的反应混合物(在此称为反应混合物3)的实验结果作为对比。反应混合物4的实验方法和程序与实施例3相同，区别仅在于反应混合物的组分不同。在反应混合物3和4中，探针终浓度都为250nM，但反应混合物3中的模板量为1.8×10⁹个拷贝，反应混合物4中的模板量为1.57×10¹¹个拷贝。

实验结果：

常规模板量(即1.8×10⁹个拷贝)的反应混合物3的实验结果请参见实施例3中的表6。高模板量(即1.57×10¹¹个拷贝)的反应混合物4的实验结果参见表7。

表7：反应混合物4的数字PCR检测结果

^*：样品是指每个20μl的PCR反应体系中所含的模板。

结果表明，在本申请的优化条件下，微滴式数字PCR能够在远超出厂家要求的上限的样品拷贝数中，准确检测出不同浓度的目标分子，其检测结果与在厂家推荐的常规模板量时的检测结果相当。

图5A表示常规模板量(即1.8×10⁹个拷贝)的反应混合物3的数字PCR结果图，图5B表示高模板量(即1.57×10¹¹个拷贝)的反应混合物4的数字PCR结果图。从图中可以看出，数字PCR对两者均可以检验出信号，而且两者的信号强度相似，都在8000左右甚至达到12000，远远超过阈值线。

本实验的结果表明，在本申请的优化的微滴式数字PCR的条件下，可以在一个反应中直接对高拷贝的病毒样品进行回复突变的检测，而无需将病毒样品分成多个单独的反应。本申请的方法大大简化了实验操作，在节省人力物力的同时还避免了不必要的误差，大大提高了检测的准确度。

尽管本申请已公开了所述发明的多个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。本申请公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本申请的实际保护范围。