一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体及其制备方法

摘要

本发明一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体，颗粒粒径为50~300纳米，由介孔氧化硅颗粒、嵌入在介孔氧化硅颗粒内部的Fe

说明书

技术领域

本发明属于材料学领域，涉及一种药物载体，具体来说是一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体及其制备方法。

背景技术

目前，癌症高发病率是全世界范围内的严重问题。国内外临床治疗癌症的方法主要是外科手术、放射治疗和药物化疗，其中药物化疗是癌症治疗中最常见的手段。由于癌症复杂的发病机制以及肿瘤细胞的多药耐药性，常规药物化疗往往得不到较好的治疗效果。采用结合疗法可提高癌症的治疗效果，即多种癌症治疗方法同时作用于同一肿瘤部位，其中药物化疗和热疗的结合是重要方法之一。

热疗作为一种有效的癌症治疗方法已经被广泛接受。医学研究表明，由于肿瘤细胞是灭氧细胞，对热敏感性比正常细胞或组织强，当温度在43^oC以上并持续一定时间后，肿瘤细胞就会受阻，解体，以至死亡。然而人体正常细胞或组织在体温升高的情况下，由于机体的调节作用，保证在体温升高时，甚至在达到43^oC以上时，组织损伤不大，且能够修复。而且相关的研究结果证实，热疗能够促进阿霉素、顺铂等抗癌药物的活性而提高药物化疗效果。

目前临床上使用的热疗主要分为全身热疗和局部热疗，其中局部热疗的副作用较轻。磁热疗是局部热疗的典型代表，被认为是癌症治疗中几乎没有副作用的治疗手段。磁性纳米颗粒置于交变磁场时，由于其磁滞损耗和奈尔松弛等机制而产生热。当磁性纳米颗粒分布于肿瘤细胞或组织中，通过控制颗粒本身的磁性能以及交变磁场的物理参数，可以加大肿瘤细胞或组织与周围正常细胞或组织的温差，大幅度提高癌症的治疗效果，并且减轻其治疗过程中因正常细胞或组织过热而引起并发症。光热疗是利用具有较高光热转换效率的材料（如纳米金棒，碳量子点，石墨烯，硫化铜等），将其聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源（一般是近红外光）的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法。光热疗法治疗时间短，治疗效果明显且副作用小。因此，设计制备兼具药物化疗和磁热疗、光热疗协同作用的纳米颗粒系统用于癌症治疗，将有助于提高癌症的治疗效果。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体及其制备方法，所述的这种具有磁热、光热效应的纳米药物载体及其制备方法要解决现有技术中的药物治疗癌症的效果有限的技术问题。

本发明提供了一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体，所述的纳米药物载体的颗粒粒径为50~300纳米，所述的纳米药物载体包括介孔氧化硅颗粒，在所述介孔氧化硅颗粒的内部嵌入有Fe₃O₄纳米颗粒，在所述的介孔氧化硅颗粒表面的包覆有氧化石墨烯；所述的纳米药物载体的介孔孔径为2~5纳米，介孔孔道呈蠕虫状；所述Fe₃O₄纳米颗粒的粒径为15~30纳米。

本发明还提供了上述的具有磁热、光热效应的纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将FeCl₃·6H₂O溶于乙二醇，随后将乙二胺和柠檬酸钠加入上述溶液并超声至完全溶解，得到澄清溶液，其中，FeCl₃·6H₂O、乙二胺、柠檬酸钠和乙二醇的摩尔比为10>3O₄纳米颗粒；

步骤二，将Fe₃O₄纳米颗粒分散在水中，得到Fe₃O₄纳米颗粒溶液，将十六烷基三甲基溴化铵和三乙醇胺加入Fe₃O₄纳米颗粒溶液中，加热至70~90℃搅拌1-2小时，将正硅酸乙酯逐滴加入并继续搅拌1~4小时得到棕褐色胶体，其中，Fe₃O₄纳米颗粒、十六烷基三甲基溴化铵、三乙醇胺、正硅酸乙酯和水的摩尔比为1~25>3O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒；

步骤三，将Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒分散在100－200毫升甲苯中并在100－110℃搅拌1-3小时，将氨基硅烷偶联剂以0.1~2.0毫升/1克介孔纳米颗粒的比例快速加入，并继续在110－120℃搅拌12－48小时；在8000-13000rpm的转速下离心收集棕褐色胶体颗粒，依次用甲苯和无水乙醇洗涤棕褐色胶体颗粒，真空干燥，得到氨基功能化的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒；

步骤四，在1-4毫克/毫升的氧化石墨烯水溶液中加入2.8毫摩尔/升的EDC和2.8毫摩尔/升NHS溶液进行活化处理1-3小时，其中氧化石墨烯、EDC和NHS的体积比为200：65：13；将氨基功能化的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒分散到活化过的氧化石墨烯溶液中反应12－24小时，氧化石墨烯和介孔纳米颗粒的质量比为1~8：4；在8000-13000rpm的转速下离心收集褐色胶体颗粒，用去离子水洗涤后冷冻干燥得到氧化石墨烯包覆的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒，并在4℃下保存。

进一步的，所述氨基硅烷偶联剂为γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷中的任意一种。

本发明还提供了上述的具有磁热、光热效应的纳米药物载体在负载抗癌药物中的用途。

介孔氧化硅是一种新型的纳米多孔材料，由于其高的比表面积和孔容、均一可调的介孔孔道，可以高含量储藏抗癌药物；介孔氧化硅纳米颗粒具有无毒性，生物相容性，热、化学稳定性，能够被各种细胞摄取；介孔氧化硅纳米颗粒孔道表面丰富的Si-OH基团使得其易于各种功能基团修饰，实现药物缓控释、靶向输送等特性。因此，介孔氧化硅纳米颗粒复合磁性纳米颗粒和石墨烯可以实现抗癌药物的高效输送协同磁热、光热作用。但是，如何设计制备石墨烯复合磁性介孔纳米颗粒载体成为获得抗癌药物高效输送协同磁热、光热治疗的关键。

本发明以溶剂热法制备超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒，以十六烷基三甲基溴化铵为结构导向剂和正硅酸乙酯为硅源，通过溶胶凝胶自组装过程复合Fe₃O₄纳米颗粒制备得到磁性能可调控的磁性介孔纳米颗粒Fe₃O₄/mSiO₂；经功能基团修饰后，抗癌药物高含量储藏在介孔孔道；然后，通过离子间、静电或氢键作用将石墨烯（graphene>3O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒表面，得到兼具可高效输送抗癌药物和磁热、光热效应的纳米药物载体Fe₃O₄/mSiO₂/GO，可实现药物化疗协同磁热、光热治疗的癌症治疗。

本发明和已有技术相比，其技术方案的优点和积极效果如下：

1. 药物pH响应控制释放

本发明所提供的具有磁热、光热效应的纳米药物载体介孔孔径为2~5纳米，适合化疗药物在介孔孔道储藏，并且氧化石墨烯包覆层在pH7.4时包封效果好，在pH4.5-6.0时可从磁性介孔纳米颗粒脱离，使储藏的药物易于释放。

2. 良好的磁热效应

本发明所提供的具有磁热、光热效应的纳米药物载体具有良好的磁热效应。该纳米药物载体具有超顺磁特性且饱和磁化强度在0~40 emu/g可调控，在外界交变磁场作用下能在较短时间内控制其升温范围在43~50℃，还可以通过控制该纳米药物载体本身的磁性能以及交变磁场的物理参数来调控纳米药物载体的磁热效应。

3. 良好的光热效应

本发明所提供的具有磁热、光热效应的纳米药物载体具有良好的光热效应。该纳米药物载体在808nm近红外光照射下，非常短时间内控制其升温至43~50℃，还可以通过控制该纳米药物载体的氧化石墨烯包封量以及近红外光强度来调控纳米药物载体的光热效应。

4. 能够实现药物化疗协同磁热、光热治疗的癌症治疗方法。

附图说明

图1为实施例一制备的具有磁热、光热效应的纳米药物载体的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图。

图2为实施例一制备的磁性介孔纳米颗粒的氮气吸附-脱附等温线及孔径分布曲线。

图3为实施例二制备的储藏阿霉素药物的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒在pH7.4和pH5.0，温度为37^oC和50^oC条件下的阿霉素(DOX)释放曲线。

图4为实施例一制备的具有磁热、光热效应的纳米药物载体的细胞毒性结果。

图5为实施例一中具有磁热、光热效应的纳米药物载体水溶液在交变磁场作用下的磁热效应曲线。

图6为实施例一中具有磁热、光热效应的纳米药物载体在近红外光照射下的光热效应曲线。

图7为实施例二中储藏阿霉素的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒的药物化疗与磁热疗协同效应结果。

图8为实施例二中储藏阿霉素的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒的药物化疗与光热疗协同效应结果。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明所涉及的一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体及其制备方法做进一步说明。

实施例1

本实施例所提供的纳米药物载体为包括介孔氧化硅颗粒、嵌入在介孔氧化硅颗粒内部的Fe₃O₄纳米颗粒和包覆于介孔氧化硅颗粒表面的氧化石墨烯。该纳米药物载体制备方法包括以下步骤：

步骤一，将1.5毫摩尔的FeCl₃·6H₂O溶于20毫升乙二醇（EG），随后将7.5毫摩尔乙二胺(EDA)和0.75毫摩尔柠檬酸钠（NaCit）加入上述溶液并超声至完全溶解，得到澄清溶液；然后，将澄清溶液转移至水热釜（聚四氟乙烯内衬，不锈钢釜体），在220^oC下溶剂热处理10小时后室温冷却；黑色沉淀采用高速离心收集黑色沉淀，用乙醇洗涤该黑色沉淀，真空干燥，得到Fe₃O₄纳米颗粒。

步骤二，将0.2克Fe₃O₄纳米颗粒分散在60毫升水中，得到Fe₃O₄纳米颗粒溶液；将0.6836克十六烷基三甲基溴化铵和0.4克三乙醇胺加入上述Fe₃O₄纳米颗粒溶液中，加热至90℃搅拌1小时，将2毫升正硅酸乙酯逐滴加入并继续搅拌2小时得到棕褐色胶体。采用高速离心收集棕褐色胶体，得到棕褐色胶体颗粒，依次用去离子水和乙醇洗涤棕褐色胶体颗粒，60^oC下真空干燥12小时，然后650^oC下煅烧6小时，得到Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒。

步骤三，将0.5克Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒分散在100毫升甲苯中并在100^oC搅拌1小时，将0.75毫升的γ-氨丙基三乙氧基硅烷快速加入并继续在120^oC搅拌24小时；采用高速离心收集棕褐色胶体颗粒，依次用甲苯和无水乙醇洗涤棕褐色胶体颗粒，60^oC下真空干燥，得到氨基功能化的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒。

步骤四，20毫升氧化石墨烯水溶液（1毫克/毫升）中分别加入2.8毫摩尔/升的650微升EDC和130微升NHS进行活化处理1小时；将20毫克氨基功能化的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒加入到活化过的氧化石墨烯溶液中反应12小时；采用高速离心收集褐色胶体颗粒，用去离子水洗涤后冷冻干燥得到氧化石墨烯包覆的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒，并在4^oC下保存。

图1为实施例一制备的具有磁热、光热效应的纳米药物载体的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图。

取本实施例制备的纳米药物载体置于扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)下观察，结果如图1所示，本实施例制备的纳米药物载体呈球形颗粒，颗粒粒径为100纳米左右，粒径分布均匀，分散性好，介孔孔道为蠕虫状分布。

图2为实施例一制备的磁性介孔纳米颗粒的氮气吸附-脱附等温线及孔径分布曲线。

将本实施例制备的磁性介孔纳米颗粒进行氮气吸附-脱附实验，结果如图2所示，为典型的IV型曲线，表明该磁性介孔纳米颗粒具有介孔特征。根据该等温曲线，计算本实施例制备的磁性介孔纳米颗粒的BET比表面积为586m²/g，采用BJH方法计算得到磁性介孔氧化硅颗粒的平均介孔孔径为3.0纳米。

实施例2

取50毫克实施例一制备得到的氨基功能化的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒，分散于10毫升阿霉素药物的PBS缓冲溶液中（阿霉素浓度0.5毫克/毫升），上述混合液在避光的振荡器室温摇晃24小时后离心分离，PBS缓冲液洗涤，最后得到储藏阿霉素药物的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒。

20毫升氧化石墨烯水溶液（1毫克/毫升）中分别加入2.8毫摩尔/升的650微升EDC和130微升NHS进行活化处理1小时；将20毫克储藏阿霉素药物的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒加入到活化过的氧化石墨烯溶液中避光反应12小时；采用高速离心收集红棕色胶体颗粒，用去离子水洗涤后冷冻干燥得到储藏阿霉素的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒，并在4^oC下保存。

测定得到阿霉素的储藏量为47微克药物/1毫克氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒。与相同实验条件下，传统药物载体对阿霉素的储存量（30微克药物/1毫克药物载体）相比，实施例一提供的Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒的储藏量显著增加。

图3为实施例二制备的储藏阿霉素药物的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒在pH7.4和pH5.0，温度为37^oC和50^oC条件下的阿霉素(DOX)释放曲线。

将得到的储藏阿霉素药物的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒在pH值为7.4和5.0的缓冲液中，分别在37^oC和50^oC下进行阿霉素药物的释放实验。释放药物浓度在NanoDrop>

结果如图3所示，在pH7.4时及37^oC和50^oC条件下，10小时内都只有8%的DOX释放出来；而在pH5.0时，37^oC条件下10小时的释放达到35%，50^oC条件下10小时释放达到45%。说明储藏阿霉素药物的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒在进入细胞前很少释放抗癌药物，而进入细胞后可以获得抗癌药物的较快释放。

实施例3

图4为实施例一制备的具有磁热、光热效应的纳米药物载体的细胞毒性结果。

体外细胞毒性测定采用标准的Cell Counting Kit-8方法。乳腺癌细胞株4T1细胞株购买于上海生化细胞研究所并按提供的方法进行培养。

具体实验过程如下：将实施例一制备的纳米药物载体分散于DMEM培养液并配制成浓度为1毫克/毫升，当4T1细胞播种在96孔板（细胞密度5000个/孔）后，将纳米药物载体悬浮液立刻加到96孔板，最终的纳米药物载体浓度分别达到25，50，75，100和200微克/毫升，溶液体积为100微升。

纳米药物载体悬浮液与细胞共培养24小时后，每孔中加入10微升的CCK-8溶液，细胞继续培养2小时后用酶标仪（ELX800, BioTek）测定450纳米波长处的吸光度。纳米药物载体悬浮液处理过的4T1细胞的活细胞与没有纳米药物载体悬浮液处理的4T1细胞的活细胞相比的百分数表示为细胞毒性。结果如图4所示，实施例一制备的纳米药物载体在浓度达到200微克/毫升仍然没有细胞毒性。

实施例4

图5为实施例一中具有磁热、光热效应的纳米药物载体水溶液在交变磁场作用下的磁热效应曲线。

将实施例一制备的纳米药物载体分散于去离子水中得到颗粒浓度为10毫克/毫升，采用在DM100磁热疗效应分析仪（西班牙nanoscale biomagnetics公司）测定该纳米药物载体的磁热效应。当设置磁场强度为180Gauss，磁场频率409kHz，颗粒溶液（10毫克/毫升）体积为1毫升时，交变磁场作用270秒使得溶液温度从28^oC升温至50^oC，比吸收率(SAR)为44W/g。

结果如图6所示，1毫升的纳米药物载体溶液（10毫克/毫升）在交变磁场（磁场强度180Gauss, 磁场频率409kHz）作用下快速升温，能够在270秒内从28^oC升至50^oC。说明实施例一制备的纳米药物载体有很好的磁热效应，能够在较短时间内达到磁热疗的温度（磁热疗温度一般在43~48^oC），有利于实际应用。

实施例5

图6为实施例一中具有磁热、光热效应的纳米药物载体在近红外光照射下的光热效应曲线。

将实施例一制备的纳米药物载体分散于去离子水中得到颗粒浓度为10毫克/毫升，采用红外光热成像仪测定该纳米药物载体的光热效应。当设置光源强度为2.5W/cm²，近红外光波长808nm，照射距离1厘米，颗粒溶液（10毫克/毫升）体积为1毫升时，808nm近红外光照射200秒使得溶液温度从28^oC升温至67^oC。

结果如图6所示，1毫升的纳米药物载体溶液（10毫克/毫升）在近红外光（光源强度为2.5W/cm²，近红外光波长808nm，照射距离1厘米）照射下快速升温，能够在200秒内从28^oC升至67^oC。说明实施例一制备的纳米药物载体有很好的光热效应，能够在较短时间内达到光热疗的温度（热疗温度一般在43~48^oC），有利于实际应用。

实施例6

图7为实施例二中储藏阿霉素的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒的药物化疗与磁热疗协同效应结果。

将实施例二制备的储藏阿霉素的纳米药物载体分散于DMEM培养液并配成浓度100微克/毫升。当4T1细胞播种在96孔板（细胞密度5000个/孔）后，将纯阿霉素溶液、纳米药物载体和储藏阿霉素的纳米药物载体的悬浮液加到96孔板，溶液体积为100微升；最终纯阿霉素溶液含阿霉素4.7微克，纳米药物载体悬浮液含100微克载体，储藏阿霉素的纳米药物载体悬浮液中含4.7微克阿霉素、100微克纳米药物载体。共同培养8小时后，细胞洗涤以除去细胞外剩余的阿霉素和纳米药物载体，并重新加入100微升新鲜DMEM培养液。细胞在DM100磁热疗效应分析仪（西班牙nanoscale biomagnetics公司）中进行交变磁场（磁场强度180Gauss, 磁场频率409kHz）处理10分钟，接着继续培养细胞4小时。然后，每孔中加入10微升的CCK-8溶液，细胞继续培养2小时后用酶标仪（ELX800,>

结果如图7所示，经过交变磁场处理后，与储藏阿霉素的纳米药物载体溶液共培养细胞的细胞活性明显低于与纯阿霉素溶液和纯纳米药物载体溶液共培养细胞的细胞活性。说明实施例二制备的储藏阿霉素的纳米药物载体具有药物化疗和磁热疗的协同作用，提高治疗效果。

实施例7

图8为实施例二中储藏阿霉素的氧化石墨烯包覆Fe₃O₄/mSiO₂介孔纳米颗粒的药物化疗与光热疗协同效应结果。

将实施例二制备的储藏阿霉素的纳米药物载体分散于DMEM培养液并配成浓度100微克/毫升。当4T1细胞播种在96孔板（细胞密度5000个/孔）后，将纯阿霉素溶液、纳米药物载体和储藏阿霉素的纳米药物载体的悬浮液加到96孔板，溶液体积为100微升；最终纯阿霉素溶液含阿霉素4.7微克，纳米药物载体悬浮液含100微克载体，储藏阿霉素的纳米药物载体悬浮液中含4.7微克阿霉素、100微克纳米药物载体。共同培养8小时后，细胞洗涤以除去细胞外剩余的阿霉素和纳米药物载体，并重新加入100微升新鲜DMEM培养液。接着，利用红外光热成像仪的808nm近红外光（光源强度为2.5W/cm²，照射距离1厘米）照射细胞3分钟，接着继续培养细胞4小时。然后，每孔中加入10微升的CCK-8溶液，细胞继续培养2小时后用酶标仪（ELX800,>

结果如图8所示，经过808nm红外光照射处理后，与储藏阿霉素的纳米药物载体溶液共培养细胞的细胞活性明显低于与纯阿霉素溶液和纯纳米药物载体溶液共培养细胞的细胞活性。说明实施例二制备的储藏阿霉素的纳米药物载体具有药物化疗和光热疗的协同作用，提高治疗效果。

当然，本发明所涉及的一种具有磁热、光热效应的纳米药物载体及其制备方法并不仅仅限定于上述实施例一至七中的内容。以上内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明的保护范围。

另外，本发明所涉及的纳米药物载体的颗粒粒径可以为50~300纳米之间可调，介孔氧化硅颗粒的介孔孔径可以为2~5纳米之间可调，Fe₃O₄纳米颗粒的粒径可以为15~30纳米之间可调。