芽孢杆菌JC65及其挥发性物质在植物促生中的应用

摘要

本发明公开了芽孢杆菌JC65及其挥发性物质在植物促生中的应用。发明通过对已有菌株的再次开发，筛选到芽孢杆菌JC65，其产生的挥发性物质能够广谱、高效促进植物生长，尤其能够促进蔬菜、粮油作物等农作物生长，促生效果超21.55％，最高可达829.14％，且提高其品质。解决了化学肥料等其它方法效果不佳或者有残留等问题，保护环境，促进农业可持续发展，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，涉及芽孢杆菌JC65及其挥发性物质在植物促生中的应用

背景技术

随着现代农业的发展，化学肥料的大范围的过量施用对环境和人体健康造成了极大伤害，已成为影响环境、人类健康及社会发展的重要因素。过量施用化肥，造成土壤的理化性状恶化、土壤养分结构失调、肥力下降。同样造成土壤酸化以及板结，最终致使耕地土壤退化。且土壤的酸化会增加有害重金属元素如汞、铅等在土壤中的活性，产生重金属污染，影响作物生长。

过多地偏施单一性质的几种化肥容易导致作物的营养失调，化肥大多是含有各种不同的盐类，其中氮、磷、钾等化学物质极易被土壤固结，在土壤中积累，土质盐碱化，造成土壤养分失衡，影响和阻碍农作物对所吸收养分物质的转化吸收，使果蔬生长性状低劣，作物口感和品质变差，质量下降，如蔬菜吃起来不香、瓜果吃起来不甜、口感差，且易腐烂，不宜存放。因此，人们迫切需要更安全有效的代替产品。近年来，微生物制剂因具有环境友好、促生增产、防病等特点而备受关注。利用土壤中有益微生物开发成微生物肥料是近年来的研发热点。

CN102174431A中公开了一种防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株JC65对西瓜细菌性果斑病的防效为50-90％,病田增产效果为10-200％。对无病植株的促生效果可达10-200％,对无病田的增产效果为5-20％。该菌剂可以兑水喷雾使用,或做成堆肥使用,也可稀释后在移栽时灌根使用。但并未公开该细菌具备促生功能。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供芽孢杆菌JC65在促进植物生长中的应用。

本发明的又一目的是提供芽孢杆菌JC65产生的挥发性物质在促进植物生长中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

芽胞杆菌JC65在促进植物的生长中的应用，所述的芽胞杆菌JC65于2010年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4475。

芽胞杆菌JC65在制备能够促进其生长的微生物制剂中的应用，所述的芽胞杆菌JC65于2010年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4475。

将所述芽胞杆菌JC65在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水将菌体进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

芽胞杆菌JC65产生的挥发性物质在促进植物的生长中的应用，所述的芽胞杆菌JC65于2010年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4475。

芽胞杆菌JC65产生的挥发性物质在制备促进植物生长的制剂中的应用，所述的芽胞杆菌JC65于2010年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4475。

本发明所述的植物优选蔬菜、粮油作物等农作物。

有益效果

本发明通过对已有菌株的再次开发，筛选到芽孢杆菌JC65，其产生的挥发性物质能够广谱、高效促进植物生长，尤其能够促进蔬菜、粮油作物等农作物生长、提高其品质。解决了化学肥料等其它方法效果不佳或者有残留等问题，保护环境，促进农业可持续发展，具有较好的应用前景。

该制剂JC65处理后对植物的株高以及根长有明显地提高，对植株具有一定的促生作用，经JC65处理的作物与对照组相比，促生效果超21.55％，最高可达829.14％，且提高其品质。该芽胞杆菌菌剂，可室温保存6个月-1年。

附图说明

图1、微生物菌剂JC65挥发性物质对作物的促生效果

图2、微生物菌剂JC65挥发性物质对番茄生物量的影响

生物保藏信息

JC65，为芽胞杆菌(Bacillus sp),于2010年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所菌种保藏号为CGMCC NO.4475。

具体实施方式

实施例1挥发性物质具有促生效果菌株的筛选

方法：采用分隔培养皿的方法筛选挥发性物质具有促生效果的菌株。将拟南芥种子用3％NaClO溶液消毒10min后用，ddH₂O清洗6次。将已准备好的拟南芥种子铺在MS培养皿中放置在4℃闭光培养箱进行低温春化2d后，放置在光照培养箱中培养(12h光照，20℃，50％相对湿度，40W荧光灯)2d。然后，将2d大小的幼苗铺在含MS培养基的二分隔培养皿的一边，在另一边滴入10μL的菌液(浓度为10⁷CFU/mL)，用封口膜密封培养皿，继续放置上述光照培养箱中培养，每个培养皿3株幼苗，每个处理6个重复。以不加菌液作为对照。

促生效果统计：约21d后可观察到明显变化，取出植株后，统计每一株植物的生物量：叶片数、叶面积、鲜重，并用紫外分光光度法检测拟南芥的总叶绿素含量。

如表1所示，微生物菌剂JC65能够产生具有促生效果的挥发性物质。

表1产挥发性物质菌株的促生效果

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例2

微生物菌剂JC65菌剂的制备方法如下：

芽胞杆菌JC65在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水将菌体进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

实施例3微生物菌剂JC65产挥发性物质对茄果类蔬菜的促生试验

方法：将番茄经3％NaClO溶液消毒5min后，在MS培养基上催芽后，将 出芽一致的幼苗转移至组培瓶中，每瓶放置1颗。另外，再将已灭菌的含有MS培养基的10mL小烧杯放在组培瓶中，并在小烧杯中接种JC65菌液(浓度为5.0×10⁷CFU/mL)10μL。将组培瓶置于光照培养箱中培养(条件：光照时间12h，温度28℃，相对湿度50％)。并以大肠杆菌(Escherichia>

28d后统计番茄的株高、茎粗、叶片数、鲜重。

生物量增加(％)＝(处理组植株鲜重—空白对照组植株鲜重)/对照植株鲜重×100％

如表2所示，微生物菌剂JC65产挥发性物质能够显著促进茄果类蔬菜番茄的生长，表现在作物的鲜重，茎长，茎粗与对照相比，都有显著的增加。表明，微生物菌剂JC65产生的挥发性物质对番茄的生物量增加达到829.14％。

表2微生物菌剂JC65产挥发性物质对茄果类蔬菜番茄生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例4微生物菌剂JC65产挥发性物质对茄果类蔬菜品质的影响

方法：按照实施例3中的步骤，将番茄种子经3％NaClO溶液消毒5min后，在MS培养基上催芽后，将出芽一致的幼苗转移至组培瓶中，每瓶放置1颗。另外，再将已灭菌的含有MS培养基的10mL小烧杯放在组培瓶中，并在小烧杯中接种JC65菌液(浓度为5.0×10⁷CFU/mL)10μL。将组培瓶置于光照培养箱中培养(条件：光照时间12h，温度28℃，相对湿度50％)。14d后，将组培瓶中的番茄苗移栽到盆钵中，放置在温室中生长(条件：光照时间12h，温度28℃，相对湿度50％)。并以大肠杆菌(Escherichia>

最后统计番茄果实的维生素C、可溶性糖、可滴定酸。

如表3所示，微生物菌剂JC65产挥发性物质处理后，番茄的维生素C、可溶性糖以及可滴定酸的含量，并显著增加番茄的糖酸比。表明，微生物菌剂JC65产生的挥发性物质在改善番茄品质方面具有显著的效果。

表3微生物菌剂JC65产挥发性物质对番茄品质的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例5微生物菌剂JC65产挥发性物质对叶类蔬菜的促生试验

方法：将空心菜种子经3％NaClO溶液消毒5min后，在无菌水中浸泡5min，然后在MS培养基上催芽，将出芽一致的幼苗转移至组培瓶中，每瓶放置1颗。另外，再将已灭菌的含有MS培养基的10mL小烧杯放在组培瓶中，并在小烧杯中接种JC65菌液(浓度为5.0×10⁷CFU/mL)10μL。将组培瓶置于光照培养箱中培养(条件：光照时间12h，温度28℃，相对湿度50％)。并以大肠杆菌(Escherichia>

14d后统计空心菜的株高、茎粗、鲜重。

如表4所示，微生物菌剂JC65产挥发性物质能够显著促进叶类蔬菜空心菜的生长，表现在作物的茎长、茎粗、鲜重与对照相比，都有显著的增加。表明，微生物菌剂JC65产生的挥发性物质对叶类蔬菜空心菜的促生效果达到42.09％。

表4微生物菌剂JC65产挥发性物质对叶类蔬菜空心菜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例6微生物菌剂JC65产挥发性物质对粮油作物的促生试验

方法：将玉米种子经3％NaClO溶液消毒5min后，在无菌水中浸泡5min，然后在MS培养基上催芽，将出芽一致的幼苗转移至组培瓶中，每瓶放置1颗。另外，再将已灭菌的含有MS培养基的10mL小烧杯放在组培瓶中，并在小烧杯中接种JC65菌液(浓度为5.0×10⁷CFU/mL)10μL。将组培瓶置于光照培养箱中培养(条件：光照时间12h，温度28℃，相对湿度50％)。并以大肠杆菌(Escherichia>

14d后统计玉米的株高、茎粗、鲜重。

如表5所示，微生物菌剂JC65产挥发性物质能够显著促进粮油作物玉米的生长，表现在作物的茎长、茎粗、鲜重与对照相比，都有显著的增加。表明，微生物菌剂JC65产生的挥发性物质对叶类蔬菜空心菜的促生效果达到21.55％。

表5微生物菌剂JC65产挥发性物质对粮油作物玉米生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例7挥发物的收集与鉴定

方法：采用固相微萃取方法收集菌株JC65的挥发性物质，将供试细菌JC65接入LB培养液中培养(培养条件：28℃，180r/min，24h)，然后将菌液稀释至约为5.0×10⁷CFU/mL备用。取10μL菌液接到含有MS培养基的顶空瓶中，28℃培养箱中培养5d。将固相微萃取装置的针头插入顶空瓶上方，固定固相微萃取手柄，小心推出纤维头(SPME>

色谱条件：

色谱柱：Supelcowax 10(30m×0.25mm inside diameter,0.25um)(24079,Supelco)。

进样口温度：250℃；升温程序：35℃保持3min，以10℃/min升至180℃保持1min，最后以4℃/min升至240℃保持4min；载气(He)：流速1.0mL/min，不分流进样。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV；传输线温度220℃；激活电压1.5V；质量扫描范围m/z：50-500。

谱图检索采用NIST MS Search software V.进行检索

如表6所示，菌株JC65产生的挥发性物质主要有酮类、烷烃类、醇类、脂类等。

表6菌株JC65产生的挥发性物质

实施例8挥发性物质对植物的促生试验

方法：将拟南芥种子用3％NaClO溶液消毒10min后用，ddH₂O清洗6次。将已准备好的拟南芥种子铺在MS培养皿中放置在4℃闭光培养箱进行低温春化2d后，放置在光照培养箱中培养(12h光照，20℃，50％相对湿度，40W荧光灯)2d。然后，将2d大小的拟南芥幼苗铺在含MS培养基的二分隔培养皿的一边。

根据GC-MS的分析结果，选取其特异成分的化合物2-壬酮、2-乙基-1-己醇、 2-十三烷酮的纯品。化合物纯品溶液：加10μg该物质溶解到10μL的DSM中，使用之前，将羊毛脂溶液(羊毛脂溶液：取1.6g羊毛脂溶于10ml的二氯甲烷(DSM)中。)跟化合物纯品液按比例混合，制成终浓度分别为1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、1mg/10mL。然后再取20μL滴在灭菌的滤纸(直径均为1cm)上，晾干90s后，放在二分隔培养皿的另一边，密封后，至于培养箱中(12h光照，20℃，50％相对湿度，40W荧光灯)培养，14d后统计生物量：鲜重。

如表7所示，2-壬酮、2-乙基-1-己醇、正十三烷酮在分隔平板体系下不同浓度处理对拟南芥具有不同强度的促生作用，2-壬酮是10ng/10μL，2-乙基-1-己醇是10μg/10μL，正十三烷是100ng/10μL。表明，微生物菌剂JC65产生的挥发性物质具有较好的促生效果。

表7挥发性物质的促生效果

注：“——”表示植株未生长。