用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测微量组织中

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于微量组织中KRAS基因突变检测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。

背景技术

Ras为一种原癌基肿瘤的发生发展，最初是从大鼠肉瘤病毒中克隆而得。哺乳动物基因组中普遍存在三种RAS癌基因家族成员：H-RAS、K-RAS、N-RAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸同源序列，分子量均为21kDa，故称为RASp21蛋白。KRAS基因是RAS基因家族中三种癌基因的一种，位于12号染色体上，含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生长因子受体功能信号的下游分子，属膜结合型GTP／GDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化作用有节制的调节KRAS基因对信号系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号（Tsuchida>

KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早中期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因状态基本保持一致。目前研究发现，KRAS基因在膀胱、乳腺、直肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，还有造血系统等均在一定频率的突变，其中以结直肠癌、胰腺癌和肺癌的发生率比较高，在胰腺癌组织高达90％以上，在肺癌中则以肺腺癌为主，突变率为20～30％，结直肠癌患者突变率为27～43％（Zeitouni>

KRAS基因最常见的突变方式为点突变，90％的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，另有1～4％为第3号外显子的第61密码子突变（Bournet>KRAS基因发生突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致RAS蛋白不依赖EGFR受体激活而持续活化，造成RAS信号通路的异常活化，影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化，导致细胞增殖失控而癌变（Ricciuti>KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。因此KRAS基因突变检测能够提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节约宝贵的治疗时间。

目前针对KRAS突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检测范围有限。多态性分析法（RFLP），是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使用扩增阻滞突变系统（ARMS）与荧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法（NASBA）、自序序列复制法（3SR）和链置换复制法（SDA）虽均为等温扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。

尽管如此，KRAS突变的检测方法仍以肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上常常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准确全面地检测微量组织中KRAS基因突变的产品及方法，以便于为肿瘤个性化治疗服务。

为此，本发明利用恒温扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织样本中KRAS基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，有利于临床使用和推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中KRAS基因突变的引物组合，以组织DNA为检测对象，结合恒温预扩增技术和普通PCR技术，通过直接测序法确定肿瘤样本中有无KRAS基因突变，可对KRAS基因的突变进行准确的检测。

本发明提供的引物组合能检测出KRAS基因发生在第2和3号外显子的所有突变。

本发明提供的用于检测KRAS基因突变的引物组合包括如SEQ>

本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测KRAS基因突变的检测试剂中。

本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测KRAS基因突变的检测试剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种：聚合酶、引物组合、PCR反应缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。

本发明用于检测KRAS基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下：

（1）引物稀释

将primer1-prime18分别稀释后混匀制得Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.05-0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为1-3μM；primer19-primer22引物（表1）稀释至5-10μM。

（2）预扩增

在扩增管中加入1μL的10×反应缓冲液、2.5μL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板（本发明采用的DNA模板来源于结肠癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方法提取组织DNA）、用去离子水补足至8.8μL；混匀，98℃预变性5-10min，然后置于冰上10-20min；再加入0.5μL dNTP (10mM each)、0.2μL 100×BSA以及0.5μL phi29 DNA聚合酶，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。

（3）使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。

（4）KRAS基因突变检测

针对KRAS基因的2,3号外显子突变，分别采用如SEQ>

配置PCR反应总体系为25μL：其中Pfu Mix混合液12.5μL、所述正向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、反向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、预扩增产物1-2μL、用水补足至25μL。PCR反应条件为：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；测序检测。

本发明的检测优势在于： 本发明采用多引物组合、利用恒温扩增及普通PCR相结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行KRAS基因突变检测的局限性。本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本。本发明方法扩增效率高，如100pg的DNA经扩增后可得到1000ng/μL；可同时检测多位点的突变情况。本发明方法DNA扩增后DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的KRAS基因的突变情况进行高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，以及监测肿瘤的预后具有很好的实际应用价值。

表1：引物1-22的核苷酸序列

。

附图说明

图1是本发明针对1000pg的DNA模板扩增结果；其中A图为预扩增结果（3次重复）；B图为KRAS基因2、3号外显子扩增结果；

图2是本发明针对500pg的DNA模板扩增结果；其中A图为预扩增结果（3次重复）；B图为KRAS基因2、3号外显子扩增结果；

图3是本发明针对100pg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果（3次重复）；B图为KRAS基因2、3号外显子扩增结果；

图4是本发明针对1000pg的DNA模板中KRAS基因2、3号外显子测序结果图；

图5是本发明针对500pg的DNA模板中KRAS基因2、3号外显子测序结果图；

图6是本发明针对100pg的DNA模板中KRAS基因2、3号外显子测序结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1：1000pg的DNA模板中KRAS基因突变检测

1、实验材料

phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的 DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer22，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。

2、实验步骤及结果

2.1 预扩增

（1）引物稀释

将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。配置如下体系：

；

（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性10min，然后迅速置于冰上20min；

（3）再加入如下体系：

；

将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测（图1A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对1000pg的DNA模板扩增效果良好。

2.2 PCR产物纯化

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）；

（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；

（4）向吸附柱CB1中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；

（5）重复操作步骤（4）；

（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液,将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。

2.3 KRAS基因突变检测

（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增KRAS基因的第2号和3号外显子；

；

其中针对2号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对3号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。

（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；

（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图1B），结果显示第二轮PCR对KRAS基因的第2和3号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测。测序结果如图4所示，KRAS基因第2号外显子发生错义突变c.38G>A>

实施例2：500pg的DNA模板中KRAS基因突变检测

1、实验材料

phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的 DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer22，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。

2、实验步骤

2.1 预扩增

（1）引物稀释。将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。配置如下体系：

；

（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性5min，然后迅速置于冰上20min。

（3）再加入如下体系：

；

将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热10min使酶失活。铺1%的胶检测（图2A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对500pg的DNA模板扩增效果良好。

2.2 PCR产物纯化

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。

（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（4）向吸附柱CB1中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (～13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（5）重复操作步骤4。

（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000rpm(~13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。

2.3 KRAS基因突变检测

（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增KRAS基因的第2和3号外显子。

其中针对2号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对3号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。

（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；

（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B），结果显示第二轮PCR对KRAS基因的第2和3号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测。测序结果如图5所示，KRAS基因第2号外显子发生错义突变c.38G>A>

实施例3：100pg的DNA模板中KRAS基因突变检测

1、实验材料

phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的 DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer22，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。

2、实验步骤

2.1 预扩增

（1）引物稀释。将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。

配置如下体系：

；

（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性8min，然后迅速置于冰上20min。

（3）再加入如下体系：

将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测（图3A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对100pg的DNA模板扩增效果良好。

2.2 PCR产物纯化

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 μL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。

（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（4）向吸附柱CB1中加入600 μＬ漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（5）重复操作步骤4。

（6）12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μＬ洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000rpm(~13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。

2.3 KRAS基因突变检测

（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增KRAS基因的第2和3号外显子。

，

其中针对2号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对3号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。

（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；

（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B），结果显示第二轮PCR对KRAS基因的第2和3号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测。测序结果如图6所示，KRAS基因第2号外显子发生错义突变c.38G>A>

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>用于检测微量组织中KRAS基因突变的引物组合及其应用

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cagtcaactg ga 12

<210>2

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggtgagtttg ta 12

<210>3

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgtgtgaca tg 12

<210>4

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aggcctgctg aa 12

<210>5

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcaagagtgc ct 12

<210>6

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgaatatgat cc 12

<210>7

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tattactggt gc 12

<210>8

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

catgagtact ta 12

<210>9

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aggtacattt ca 12

<210>10

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tcttgtaata ag 12

<210>11

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gcaccagtaa ta 12

<210>12

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

atattcgtcc ac 12

<210>13

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tcaaggcact ct 12

<210>14

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ttttcagcag gc 12

<210>15

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gaacatgtca ca 12

<210>16

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ctccaccagt ac 12

<210>17

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gggcaggang10

<210>18

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

nnatgtgg 8

<210>19

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

agggttttcc cagtcacggg tactggtgga gtatttgata gt42

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

aagaatggtc ctgcaccagt aatat 25

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

agggttttcc cagtcacgag gtgcactgta ataatccag39

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cagtcctcat gtactggtcc 20