铁皮石斛EST-SSR引物组、开发方法及其在物种遗传多样性上的应用

摘要

一种铁皮石斛EST‑SSR引物组，其特征在于：该引物组由9对引物组成，9对引物的序列表为如下所示：

说明书

技术领域

本发明涉及铁皮石斛技术领域，具体涉及一种铁皮石斛EST-SSR引物组、开发方法及其在物种遗传多样性上的应用。

背景技术

铁皮石斛(学名：Dendrobium officinale Kimura et Migo)，又名：黑节草、仙斛兰韵、紫萦仙株。属微子目，兰科多年生附生草本植物。茎直立，圆柱形，长9-35厘米，粗2-4毫米，萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8cm，宽4～5mm，花期3～6月。主要分布于中国安徽、浙江、福建等地，其茎入药，属补益药中的补阴药。我国现有的76种石斛属植物中，具药用的就有40多种.其药理主要是强阴益精、补肾益力、明目和延年益寿。近年来，国内对铁皮石斛资源进行了大量研究，国外，Pyati AN等对5种石斛的离体培养也获得了一定程度的成功，但在石斛离体培养工作中，试验设计粗糙，数据缺乏可比性，对石斛离体条件下的遗传稳定性和生理稳定性缺乏基础性研究，未能获得规范化石斛繁殖技术体系和工艺流程，从而极大地阻碍了这一名贵中草药走向场。

分子标记鉴定是当今流行的比传统形态鉴定方法更科学和灵敏的重要方法之一，是构建高密度分子遗传图谱、分析物种分类与演化、染色体结构、遗传多样性、品种保护与纯度鉴定的有效工具；但是，普通基因组SSR(gSSR)引物扩增条带稳定性较弱，不能反映出个体或群体的遗传变异，且引物通用性较弱。EST-SSR标记不仅具有基因组SSR标记中技术简单、重复性好、多态性高和共显性遗传等特点，还具有引物开发廉价、通用性较好、条带清楚、容易统计等优点。此外，由于EST-SSR是编码基因的一部分，能够直接获得基因表达的相关信息，这有可能直接鉴定决定重要表型性状的等位基因。随着NCBI中EST数据库不断地丰富与完善，使用其序列开发SSR标记也已成为一种十分简便而有效的方法，时至今日，EST-SSR标记已在众多植物中得到广泛的应用^[6]。目前，石斛属植物的DNA分子鉴定方面主要采用RAPD、AFLP、ISSR、SRAP和SSR等分子标记技术，如苑鹤等利用RAPD对人工栽培铁皮石斛居群的遗传多样性进行了相关研究，发现其亲缘关系的远近与其地理种源具有显著的相关性，而与栽培地点无关；王慧中等利用AFLP对13种石斛属植物进行了遗传多样性的分析，其结果与传统分类>[9]利用ISSR进行了铁皮石斛新品种的选育工作；樊洪泓等^[10]利用SRAP对药用石斛的遗传多样性及亲缘关系进行了相关研究；邱道寿等对石斛属植物进行了SSR标记的开发及可转移性分析。但至目前为止，有关铁皮石斛的EST-SSR标记却极少见于报道。本文利用本课题组前期开发的铁皮石斛EST-SSR引物用于铁皮石斛种质资源的遗传多样性分析、种质鉴定、亲缘关系鉴定和指纹图谱构建等方面。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能降低条带判读的错误或偏差，同时也能够反映出群体或个体的遗传变异、并利于功能基因的研究的铁皮石斛EST-SSR引物。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种铁皮石斛EST-SSR引物组，该引物组由9对引物组成，9对引物的序列表为如下所示(序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.18的核苷酸序列)：

DN5 F:AAATATGGTTCTGGTGGTGGAG R:CAGGAAAACCCAAGGGAAA

DN23 F:GAGGAACGAATGATGGACTCTC R:GTTTAGGAAAAGGGGAGAAGGA

DN29 F:CATCGGTCTCTCACTTCCACTA R:CATGTTGTAGCCATAAGGGGAT

DN46 F:TTGGAGGAGTTATGGGAAAGG R:GGGACACTTATTCTTGGCTCTG

DN57 F:AATGGAGGGAGCTAATTTCACA R:CACGACCTCATCTCTTCTTCCT

DN60 F:AGGCCATTGTTACTACTGCTCC R:CCCTCACTTCCATCAACTAAGC

DN92 F:GACGAGCAGAGAGAAGAAATCG R:ACGGCAGAGACGACATTAAAA

DN95 F:AATGCCTCAACACTCGATTACA R:TGAAGAAAGAAGAGCAAGCAAG

DN106 F:GGGACTATTCACAAGCTCATGG R:CAAGTACAAATGCGTGCTCAAC。

本发明还提供一上述铁皮石斛EST-SSR引物组的开发方法，包括：

(1)基因组DNA提取

DNA的提取采用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)提取铁皮石斛基因组DNA，Eppendorf公司生产的Bio-Photometr核酸检测仪检测DNA浓度和纯度，根据计算所得的DNA浓度，将DNA样品溶液用TE稀释成50ng·uL^-1。-20℃保存备用；

(2)序列来源获得

登录到NCBI中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在搜索栏中输入Dendrobium>

(3)SSR位点查找

在线搜索软件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)对所有EST序列进行SSR位点搜索(http:∥www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索标准为：二、三、四、五和六核苷酸的最小重复次数分别为10、6、5、4、3次，EST序列长度大于100bp，SSR起始点位置距离5'和3'应不小于20bp。

(4)SSR引物设计

用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价，设计引物时设置的主要参数为:GC含量40％～70％，退火温度50～62℃，引物长18～24bp，上下游引物Tm值之差应在1℃范围之内，预期扩增产物长度100～500bp，尽量避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生，得分超过90分方为合格，才能被用于合成、使用；共设计出合格的SSR引物有106对，引物命名为Dn加序号，即Dn-1～Dn-106；

(5)EST-SSR引物筛选

将106对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最适复性温度的筛选于Eppendorf公司生产的Mastercycler普通梯度PCR仪上进行。2×Taq PCR MasterMix购自天根生物公司(北京)，PCR反应体系为20μL，其中包括：10μL的2×Taq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液)，0.4μL的模板DNA(50ng·μL^-1)，0.8μL的引物对(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH₂O。反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，复性(48—64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存。随机选择6份铁皮石斛种质资源用于引物以及最适退火温度的筛选，各引物对的最适退火温度通过梯度PCR试验确定。筛选出有目标条带和最适退火温度的引物。

本发明还涉及一种上述的EST-SSR引物组在物种遗传多样性上的应用，比如在铁皮石斛种质鉴定中的应用。

本发明的优点和有意效果：

1.本发明开发的EST-SSR引物扩增出的条带为功能基因的一部分，序列相对保守，其扩增条带结果较gSSR更稳定，这能降低条带判读的错误或偏差，同时也能够反映出群体或个体的遗传变异，同时也利于功能基因的研究。

附图说明

图1 9对引物在16份供试材料中的扩增。

图2基于SSR结果构建的16份材料的UPGMA聚类分析

具体实施方式：

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例

本发明的引物组序列为：

DN5 F:AAATATGGTTCTGGTGGTGGAG R:CAGGAAAACCCAAGGGAAA

DN23 F:GAGGAACGAATGATGGACTCTC R:GTTTAGGAAAAGGGGAGAAGGA

DN29 F:CATCGGTCTCTCACTTCCACTA R:CATGTTGTAGCCATAAGGGGAT

DN46 F:TTGGAGGAGTTATGGGAAAGG R:GGGACACTTATTCTTGGCTCTG

DN57 F:AATGGAGGGAGCTAATTTCACA R:CACGACCTCATCTCTTCTTCCT

DN60 F:AGGCCATTGTTACTACTGCTCC R:CCCTCACTTCCATCAACTAAGC

DN92 F:GACGAGCAGAGAGAAGAAATCG R:ACGGCAGAGACGACATTAAAA

DN95 F:AATGCCTCAACACTCGATTACA R:TGAAGAAAGAAGAGCAAGCAAG

DN106 F:GGGACTATTCACAAGCTCATGG R:CAAGTACAAATGCGTGCTCAAC

试验材料

本试验采集了15份铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)种质资源和一份串珠石斛(DO-5为串珠石斛，作为外来群，其余为铁皮石斛)，DO-1采自广东饶平，DO-2采自云南思茅，DO-3采自安徽合肥，DO-4采自福建龙岩，DO-5采自浙江温州，DO-6采自福建武夷山，DO-7采自湖南新宁崀山，DO-8采自浙江瑞安，DO-9采自浙江萧山，DO-10采自浙江温岭雁荡山，DO-11采自云南红河，DO-12采自浙江丽水，DO-13采自云南文山，DO-14采自浙江富阳，DO-15采自浙江临安，DO-16采自浙江富阳.具体的步骤和鉴定铁皮石斛的开发过程为：

(1)基因组DNA提取：采用试剂盒法提取铁皮石斛基因组DNA。具体步骤如下：1.称取≦100mg新鲜植物。

2.将样品转入研钵中，加液氮浸没样品，然后迅速研磨，反复2-3次，研磨至细粉末状，立即加入0.8ml Buffer PFG1和5ul RNase A1,快速研磨使Buffer PFHG1完全覆盖在样品上，温室放置，待样品完全融化后倒入1.5ml离心管中，剧烈摇晃混合均匀。

3.65℃温育1小时左右，温育期间剧烈摇晃混合1-2次。

4.冰浴2min，加入125ul Buffer PFG2混合均匀。

5.离心2min，仔细吸取≦700ul上清，转入干净的1.5ml离心管中。

6.加入125ul Buffer PFG3混合均匀，离心2min。

7.实验准备：将DNA吸附柱-C30置于收集管中并做好标记：

在干净的1.5ml离心管中加入150ul异丙醇。

8.吸取步骤6中≦650ul上相，转入步骤7准备的已加入异丙醇的1.5ml离心管中，缓慢吹打5次混合均匀，转入DNA吸附柱-C30。

9.离心1min，弃收集管，将DNA吸附柱-C30放入另外一个干净的收集管中。

10.在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WAG，离心1min，弃收集管，将DNA吸附柱-C30放入另外一个干净的收集管中。

11.在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WB1，离心1min，弃废液，将DNA吸附柱-C30放回收集管中。

12.重复步骤11。

13.离心2min。

14.将DNA吸附柱-C30转入试剂盒携带的1.5ml离心管中，向硅胶的中央加大约100ulTE，将1.5ml离心管的盖子扣在DNA吸附柱上，做好标记，去除DNA吸附柱的盖子，室温放置1-2min或者更长时间，12，000×g离心1min。

之后采用核酸检测仪检测DNA浓度和纯度，然后将DNA样品溶液用TE稀释成50ng·uL^-1，-20℃保存备用；

(2)序列来源：登录到NCBI中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在搜索栏中输入Dendrobium>

(3)SSR位点查找：在线搜索软件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)对所有15383条EST序列进行SSR位点搜索(http:∥www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索标准为：二、三、四、五和六核苷酸的最小重复次数分别为10、6、5、4、3次，EST序列长度大于100bp，SSR起始点位置距离5'和3'应不小于20bp。

(4)SSR引物设计：用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价。设计引物时设置的主要参数为:GC含量40％～70％，退火温度50～62℃，引物长18～24bp， 上下游引物Tm值之差应在1℃范围之内，预期扩增产物长度100～500bp，尽量避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生，得分超过90分方为合格，才能被用于合成、使用。共设计出合格的SSR引物有106对，引物命名为Dn加序号，即Dn-1～Dn-106。

(5)EST-SSR引物筛选：将106对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最适复性温度的筛选于Eppendorf公司生产的Mastercycler普通梯度PCR仪上进行。2×Taq PCR MasterMix购自天根生物公司(北京)，PCR反应体系为20μL，其中包括：10μL的2×Taq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液)，0.4μL的模板DNA(50ng·μL^-1)，0.8μL的引物对(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH₂O。反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，复性(48—64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存。随机选择6份铁皮石斛种质资源用于引物以及最适退火温度的筛选，各引物对的最适退火温度通过梯度PCR试验确定。筛选出有目标条带和最适退火温度的引物。

(6)聚丙烯酰氨凝胶电泳

在最适退火温度下，对有目标条带的引物用于16份铁皮石斛种质资源的PCR扩增，产物采用6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染，等胶干燥后利用数码相机进行拍照、保存。具体步骤如下：

(1)

表1 6％聚丙烯酰胺变性凝胶制备

注：^*40％丙烯酰胺:将190g丙烯酰胺和10g甲叉丙烯酰胺用水稀释至500mL,4℃贮存备用。

^**TEMED和25％APS在灌胶前加入。

(2)灌胶：轻轻灌凝胶液，防止出现气泡。聚合时间lh以上。

(3)预电泳：恒功率预电泳30min，温度达到43℃左右。

(4)样品变性：10uL PCR样品加入5uL 3×Loading Buffer[98％甲酰胺，0.5M EDTA(pH8.0),0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青]，混匀后,在95℃变性5min，立即放至冰上10min以上。

(5)加样和电泳：吸打加样槽，清除残胶、尿素和气泡，每一个加样孔点入5uL样品； 40W恒功率电泳约1.0h～2.0；电泳结束后，小心分开两块玻璃板。

(6)银染程序：固定：将凝胶板置于lL乙酸溶液(10％)中，轻轻摇荡5-6min。漂洗：用1.5L双蒸水漂洗2-3min。染色：在1.5L新配的染色液中(l.5g硝酸银,1.5mL37％甲醛)，轻轻摇荡15min。漂洗：用1.5L双蒸水漂洗，时间不超过10秒。显影：在1.5L显影液中(显影液含无水碳酸钠45g，1％硫代硫酸钠300uL，37％甲醛2.25mL。提前配制，置于4℃冰箱中预冷)轻轻摇荡，直至出现带纹。定影：在1.5L 10％乙酸溶液中定影2-3min。漂洗：用1.5L双蒸水漂洗2-3min。干胶：室温下自然晾干。

(7)引物多态性指标分析

铁皮石斛以富含多糖类物质而著名，其叶片多糖的含量也十分丰富，本试验所使用的试剂盒提取基因组DNA质量较高，无其它杂质干扰，之后经核酸检测仪检测显示，OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.68-1.95范围内，获得的DNA纯度较高，达到了后续分析的要求。最后再依据检测出的DNA样品溶液浓度，使用预热的TE缓冲溶液稀释成30-50ng·μL^-1备用。

通过优化好的PCR反应体系对该106对EST-SSR引物进行筛选以及最佳退火温度的筛选。在最优体系和最适退火温度下进行PCR反应，以利于高质量的聚丙烯酰胺凝胶电泳图的获得，这保证了后续条带的统计和数据分析的准确性。

选用16份差异较大的铁皮石斛资源的核DNA为模板对筛选过后的引物进行扩增检测。图1为9对引物在16份供试材料中的扩增。

由表1可知，9对引物在16份材料(图1)中共扩增出79条带，其范围为2～5条不等，平均每条引物扩增出3.11条；其中多态性条带有23条，平均每条引物扩增出2.56条多态性条带。平均多态性百分率为82.96％，其中DN5多态性百分率最低，为50％；DN29、DN95和DN106多态性百分率均为100％；其余引物多态性百分率介于50％～100％之间。

此外，每对引物的Nei's基因多样度范围为0.1766～0.4297，均值为0.2855，小于0.2的有DN23和DN60，介于0.2～0.3的有DN5、DN46和DN95，其余均大于0.3；香农信息指数范围为0.2931～0.6211，均值为0.4310，小于0.3的有DN23和DN60，介于0.3～0.4的有DN5、DN23和DN46，其余均大于0.4。

表2 9对引物的扩增结果

聚类分析

依据9对EST-SSR引物扩增结果，再利用NTSYSpc2.10e软件进行Jaccard相似性系数分析，计算出它们之间的遗传相似系数，其中，15份铁皮石斛(去除DO5)其范围在0.582～0.949之间，串珠石斛(DO5)与15份铁皮石斛之间的范围在0.456～0.709之间(表4)。

由遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，构建了15份铁皮石斛和1份串珠石斛的遗传关系图(图2)。其中在15份铁皮石斛中DO8和DO16号遗传相似系数最大，为0.949；DO9和DO12、DO13遗传相似系数最小，为0.582。串珠石斛(DO5)与DO8遗传相似系数最大(0.709)，与DO4遗传相似系数最小(0.456)。由图2可知，大约在遗传相似系数0.58处，串珠石斛被从铁皮石斛中首先分离出来；大约在遗传相似系数0.68处，15份铁皮石斛被分为3大类。

第一类包括DO9、DO10、DO14和DO15；第二类仅包括DO4；第三类包括DO1、DO11、DO2、DO3、DO7、DO6、DO13、DO12、DO8和DO16。其中大约在0.77处第三类又可分为三小类，第一小类包括DO1、DO11和DO2；第二小类包括DO3、DO7、DO6、DO13和DO12；第三小类包括DO8和DO16。

结果表明，外类群-串珠石斛最先被分离出来，与15铁皮石斛遗传距离较远。来自浙江萧山(DO9)、浙江温岭雁荡山(DO10)、浙江富阳(DO14)和浙江临安(DO15)亲缘关系较近而被聚类在一起，而来自浙江瑞安(DO8)和浙江富阳(DO16)彼此亲缘关系最近而被聚类在一起；来自广东饶平(DO1)、云南思茅(DO2)和云南红河(DO11)亲缘关系较近而被聚类在一起。以上来自相同地区或区域的基本被聚类在一起。而来自 浙江丽水(DO12)、云南文山(DO13)与来自安徽合肥(DO3)、湖南新宁崀山(DO7)和福建武夷山(DO6)的亲缘关系较近而被聚类在一起，由于目前铁皮石斛产业高度商业化，可能是人为有意、无意携带流入这些地区造成的，亦可能是由于这些种质遗传背景比较复杂，彼此体内流着相同的“血液”，究其原因有待后续进一步研究。总体而言，该20对引物聚类结果能够比较准确地反应种内、种间彼此亲缘关系的远近。

表3 16份材料SSR分析的遗传相似系数

所以，从上述应用实施例可以看出，本发明的引物可以实现对铁皮石斛的甄选、鉴别。

SEQUENCE LISTING

<110>宁波城市职业技术学院

<120>铁皮石斛EST-SSR引物组、开发方法及其在物种遗传多样性中的应用

<130>2016

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aaatatggtt ctggtggtgg ag22

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caggaaaacc caagggaaa19

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaggaacgaa tgatggactc tc22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtttaggaaa aggggagaag ga22

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

catcggtctc tcacttccac ta22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

catgttgtag ccataagggg at22

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttggaggagt tatgggaaag g 21

<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gggacactta ttcttggctc tg22

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aatggaggga gctaatttca ca22

<210>10

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cacgacctca tctcttcttc ct22

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

aggccattgt tactactgct cc22

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<212>DNA

<213>人工序列

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ccctcacttc catcaactaa gc22

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<212>DNA

<213>人工序列

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gacgagcaga gagaagaaat cg22

<210>14

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<212>DNA

<213>人工序列

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acggcagaga cgacattaaa a 21

<210>15

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<212>DNA

<213>人工序列

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aatgcctcaa cactcgatta ca22

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<213>人工序列

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tgaagaaaga agagcaagca ag22

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<212>DNA

<213>人工序列

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gggactattc acaagctcat gg22

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<212>DNA

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caagtacaaa tgcgtgctca ac22