一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统

摘要

本发明公开了一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，包括激光器、第一透镜、第一偏振分束镜、第二偏振分束镜、第一二色镜、上显微镜头、样品台、下显微镜头、第二二色镜、第二透镜、柱面镜、第一CMOS照相机、偏心孔径光阑、第一反射镜、第三透镜、第二反射镜、第二CMOS照相机；本发明不改变4Pi显微镜的原有架构，利用二色镜将聚焦锁定系统引入整个4Pi系统中，可以实现对双镜头相对位置以及镜头与样品相对位置的实时锁定，整个聚焦锁定系统十分紧凑。本发明可以克服4Pi显微系统中上下镜头单独成像的造成的差异，避免传统4Pi显微镜中后期图像处理所导致的图像失真的问题，工作精度高。

说明书

技术领域

本发明涉及光学仪器领域、生物医学显微成像领域，具体涉及一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统。

背景技术

目前在生物医药领域的研究对分辨率的要求越来越高，研究人员需要了解各种亚百纳米尺度上微小形态物质的三维结构信息，然而传统光学显微镜无法达到这样的分辨率，特别是在光轴方向上的分辨能力远远不足。电镜和原子力显微镜虽然可以提供更高的分辨率，但是只能局限于提供表面图像，无法对深层组织和活细胞进行成像，而4Pi共聚焦系统的出现完美地解决了这个问题。根据瑞利数据，增加物镜的数值孔径，可以减小点扩散函数的尺寸，从而提高显微镜的分辨率。4Pi显微镜正基于此原理，利用通过样品前后的双物镜，使显微镜总的立体接收角接近4Pi，从而提高数值孔径，提高显微镜分辨率特别是轴向分辨率。通常4Pi显微镜基于宽场或共聚焦显微镜平台，采用两个相对的相同物镜，可将轴向分辨率大幅提升，获得极佳的三维效果，因此在亚细胞结构、细胞内寄生虫和病毒等的观察方面具有广泛的应用。

对于显微镜而言，必须保证其工作的时候，物镜聚焦于样品表面。作为一套自动化仪器，具备焦平面锁定功能的显微镜，可以很好的保证系统的位相关系，为显微镜使用者获得高质量图片提供极大的便利。作为一种干涉系统，在4Pi架构的显微系统中，必须同时保证两个相对的物镜均聚焦在样品上相同位置。因此，两个显微镜头与样品相对位置锁定系统对于4Pi架构的显微系统而言显得更为关键。而与一般单镜头相比，4Pi架构的显微系统对于机械振动、热膨胀等因素更为敏感，焦平面锁定功能是一般4Pi架构显微系统的必要组成部分。Roman Schmidt等人在《自然》杂志中发表的题为《Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells》 的论文中，应用了经典4Pi架构的显微系统，采用两套独立的锁定系统分别锁定两个镜头与样品间的相对位置。这种设计可以充分借鉴单镜头显微系统的已有成果，提高设计效率，但是，该种设计方案的最大问题在于：无法保证两个镜头间相对位置的稳定。当镜头位置偏移量较大(横向偏移大于100纳米，轴向大于300纳米)时，可以在系统图像中观察到“重影”现象。这种重影现象原理上可以通过后期图像处理算法，如自相关算法等加以矫正。但在现实中，由于上下镜头单独成像图像不可避免存在微小差异，后期图像处理本身即有可能导致图像失真等严重问题。对于基于4Pi架构的超分辨显微系统，如4Pi单分子定位显微系统(4Pi-SMS)而言，由于其自身设计分辨率较高(<50纳米)，并且在原理上依赖荧光干涉实现对于单分子的定位，对于镜头位置的相对偏移的容忍度更低(横向偏移小于20纳米，轴向小于50纳米)。因此，现有的锁定系统设计并不能满足4Pi显微架构显微镜的需要。

发明内容

本发明针对现有4Pi显微系统中无法保证两个镜头相对位置、精度较低，以及后期图片处理易失真等诸多问题，提出了一种新型的基于4Pi架构的显微镜头与样品锁定系统。该结构高效、精确，可以同时实现对4Pi显微镜系统中双镜头相对位置的实时调节。

一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，包括激光器、第一透镜、第一偏振分束镜、第二偏振分束镜、第一二色镜、上显微镜头、样品台、下显微镜头、第二二色镜、第二透镜、柱面镜、第一CMOS照相机、偏心孔径光阑、第一反射镜、第三透镜、第二反射镜、第二CMOS照相机；

所述激光器发射的光束经过第一透镜的扩束准直后，发射至第一偏振分束镜：

光束中垂直偏振分量继续沿原方向传输，经过第二偏振分束镜出射后被第一二色镜反射进入上显微镜头，被上显微镜头汇聚到样品面；从样品下表面出射后，被下显微镜头收集，之后被第二二色镜反射，经过第三透 镜、柱面镜后被第一CMOS相机收集并成像；

光束中水平偏振分量被反射，经过偏心孔径光阑后，形成细光束，之后被第一反射镜反射，经第三透镜会聚到第二反射镜表面，第二反射镜反射后，进入第二偏振分束镜后再次被反射至第一二色镜表面；经过第一二色镜反射后，进入上显微镜头，会聚入射在样品表面，然后由于入射角较大，被样品表面反射回上显微镜头，再次经过第一二色镜后，被第二偏振分束镜反射到第二反射镜表面；之后通过第三透镜形成平行光束，被第二CMOS相机收集并成像；

还包括控制单元，该控制单元实时读取第一CMOS相机和第二CMOS相机的成像信息，并将该成像信息与预先确定的锁定位置图像信息进行对比计算，根据计算结果对上显微镜头和下显微镜头之间的相对位置、上显微镜头或下显微镜头与样品之间的位置进行补偿调整。

本发明中，所述第一透镜用于将光束扩束准直，使得激光束直径变大，发散角较小，在垂直于光轴方向的横截面内光强分布更均匀，更接近于平行光，有利于光束会聚形成更小的光斑。

本发明中，所述第二透镜及第三透镜用于将光束聚焦；一般选择凸透镜。

本发明中，所述上显微镜头与下显微镜头正对共焦放置。所述第三透镜的聚焦位置为上显微镜头的后焦平面的位置。

本发明中，所述偏心孔径光阑只允许宽光束边缘的部分光通过。

作为优选，控制单元通过实时读取第一CMOS相机的成像信息，实现对上显微镜头和下显微镜头之间的相对位置的补偿调整；控制单元通过实时读取第二CMOS相机的成像信息，实现对上显微镜头或下显微镜头与样品之间的位置进行补偿调整。

作为优选，所述激光器为红外波段激光器，平均输出功率为150μW。采用该技术方案，可以保证系统在完成聚焦锁定功能的时候，不对4Pi系统中的成像光束造成较大的影响。

作为优选，所述红外波段激光器的波长为980纳米。

作为优选，经过偏心孔径光阑后的细光束的光束直径为0.2～0.5毫米。

作为优选，所述控制单元采用闭环负反馈控制，其过量补偿参数设置为1.05。

作为进一步优选，所述闭环负反馈控制公式为：

u(t)＝K(t)·e(t)

其中u(t)为实时输出控制信号；K(t)为所述的过量补偿参数；e(t)为实时聚焦光斑形状与锁定位置聚焦光斑形状差异。

作为优选，上显微镜头和下显微镜头选用UPLSAPO100XS超级复消色差物镜，放大倍率100倍，数值孔径1.35。

作为优选，第一CMOS相机和第二CMOS相机选用DCC1545M型高分辨率黑白CMOS相机，像素为1280×1024。

本发明中，控制单元可选择控制芯片，该控制芯片可单独设置，或者几成设置；所述控制单元也可以选择计算机，通过计算机进行图像的实时采集和控制。

本发明中，第一二色镜、第二二色镜具有两个重要的作用，一方面用于反射聚焦锁定系统的光束，同时也用于透射4Pi显微镜系统的光束。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明不改变4Pi显微镜的原有架构，利用二色镜将聚焦锁定系统引入整个4Pi系统中，可以实现对双镜头相对位置以及镜头与样品相对位置的实时锁定，整个聚焦锁定系统十分紧凑。

2、本发明可以克服4Pi显微系统中上下镜头单独成像的造成的差异，避免传统4Pi显微镜中后期图像处理所导致的图像失真的问题，工作精度高。

因此，该本发明的技术方案与原有技术相比，能够提高4Pi显微镜的工作效率和实验精度。

附图说明

图1为本发明的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统的一个实施例的光路图；

其中：1、光纤激光器；2、第一透镜；3、第一偏振分束镜；4、第二偏振分束镜；5、第一二色镜；6、上显微镜头；7、样品台；8、下显微镜 头；9、第二二色镜；10、第二透镜；11、柱面镜；12、第一CMOS照相机；13、偏心孔径光阑；14、第一反射镜；15、第三透镜、16、第二反射镜；17、第二CMOS照相机；

图2为上显微镜头6和下显微镜头8共焦时，第一CMOS相机12收集的光斑；

图3为上显微镜头6和下显微镜头8沿着光束传播方向远离时，第一CMOS相机12收集的光斑；

图4为上显微镜头6和下显微镜头8沿着光束传播方向靠近时，第一CMOS相机12收集的光斑；

图5为上显微镜头6、下显微镜头8之间在垂直光束传输方向发生相对位置的变化时，第一CMOS相机12收集的光斑；

图6为平行细光束的光斑被第二CMOS相机17收集的光斑；

图7为样品下沉时，平行细光束在第二CMOS相机的像面所呈现的光斑。

具体实施方式

下面结合附图说明本发明，但本发明并不限于此。

如图1所示是本发明基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统的一个实施例的双光束的光路图。该实施例的双光束光镊系统包括：

光纤激光器1，第一透镜2，第一偏振分束镜3，第二偏振分束镜4，第一二色镜5，上显微镜头6，透明的样品台7(样品置于该样品台上)，下显微镜头8，第二二色镜9，第二透镜10，柱面镜11，第一CMOS照相机12，偏心孔径光阑13，第一反射镜14，第三透镜15，第二反射镜16，第二CMOS照相机17；

其中，光纤激光器1为Thorlabs公司的LP980-SF15型光纤激光器，功率为15mW，工作波长为980纳米。

光纤激光器1出射的光束经过第一透镜2后，光束被扩束准直，激光束直径变大，发散角较小，在垂直于光轴方向的横截面内光强分布更均匀，更接近于平行光，有利于光束会聚形成更小的光斑。

经过扩束准直的激光入射到第一偏振分束镜3后，光束中的垂直偏振分量继续沿原方向传输，入射到第二偏振分束镜4后出射；出射后被第一二色镜5反射进入上显微镜头6，被上显微镜头6汇聚到样品面；从样品下表面出射后，被下显微镜头8收集，之后被第二二色镜9反射，经过第三透镜10、柱面镜11后被第一CMOS相机12收集并成像。

本实施例中，第一偏振分束镜3、第二偏振分束镜4均是对垂直偏振分量透射、对水平偏振分量进行反射的偏振分束镜。

由于柱面镜11会产生像散，当上显微镜头6、下显微镜头8处于共焦点的位置时，第一CMOS相机12收集的光斑非完美轴对称，记录此时的光斑位置和形状，记为锁定位置聚焦光斑。上显微镜头6、下显微镜头8之间如果在沿着光束传输方向发生相对位置的变化，会造成第一CMOS相机12收集的光斑单一方向的压缩或者拉伸。通过第一CMOS相机收集的光斑的拉伸或压缩，计算出上显微镜头6和下显微镜头8在沿光束传播方向的相对位移，从而进行该方向的反馈锁定。

上显微镜头6、下显微镜头8之间如果在垂直光束传输方向发生相对位置的变化，会造成第一CMOS相机12收集的聚焦光斑位置的移动。根据对聚焦光斑位置的移动的判断，可实现在垂直于光束传输方向上，显微镜头6、下显微镜头8之间相对位置的锁定。

入射到第一偏振分束镜3后光束中的水平偏振分量被反射，经过偏心孔径光阑13后，形成细光束，并被第一反射镜14反射，经第三透镜15会聚到第二反射镜16表面，并被第二反射镜16反射，进入第二偏振分束镜4后再次被反射到第一二色镜表面5；经过第一二色镜5反射后，进入上显微镜头6。由于第三透镜15的聚焦位置为上显微镜头6的后焦平面的位置，因此光束会聚在样品表面；由于是细光束，因此在样品表面的入射角较大，被样品表面反射回上显微镜头6，再次经过第一二色镜5后，被第二偏振分束镜4反射到第二反射镜16表面；之后通过第三透镜15，形成平行细光束，平行细光束的光斑被第二CMOS相机17收集并成像。

沿光束传播方向，当上显微镜头6与样品的相对位置发生变化时，会造成细光束在样品表面入射角发生变化，因此经过样品表面反射的细光束 角度也会发生变化，经过第三透镜15后形成的平行细光束在第二CMOS相机的像面的相对位置会随之发生变化。通过对第二CMOS相机像面上光斑位置的移动，可以判断上显微镜头6与样品的相对位置的变化，从而进行锁定。

本实施例中，上显微镜头6和下显微镜头8可选用奥林巴斯公司的UPLSAPO100XS超级复消色差物镜，放大倍率100倍，数值孔径1.35，可以全面补偿近红外区域的球差和色差。本实施例中第一CMOS相机12和第二CMOS相机17可选用Thorlabs公司的DCC1545M型高分辨率黑白CMOS相机，像素为1280×1024。

实施例

下面结合实施例来对本发明所提出一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统进行进一步说明，但本发明并不限于此。

波长为980纳米的光束从光纤激光器1出射，经过第一透镜2后被扩束准直，扩束准直后的光束直径为5毫米。

经过扩束准直的激光入射到第一偏振分束镜3后，占光束总能量50％的垂直偏振分量继续沿原方向传输，入射到第二偏振分束镜4后沿着原方向出射；出射后被第一二色镜5反射进入上显微镜头6，被上显微镜头6汇聚到样品面；从样品下表面出射后，被下显微镜头8收集，之后被第二二色镜9反射，经过第三透镜10、柱面镜11后被第一CMOS相机12收集并成像。

本实施例中上显微镜头6和下显微镜头8的数值孔径为1.35，焦距为1.8毫米，柱面镜11焦距大于500毫米，优选1000毫米；柱面镜11通光口径大于12.5毫米，柱面镜11会产生像散。

当上显微镜头6和下显微镜头8共焦时，由于柱面镜11产生的像散，第一CMOS相机12收集的光斑如图2所示，此时的光斑定义为锁定位置聚焦光斑。当上显微镜头6和下显微镜头8沿着光束传播方向远离时，第一CMOS相机12收集的光斑形状沿横向拉伸，如图3所示；当上显微镜头6和下显微镜头8沿着光束传播方向靠近时，第一CMOS相机12收集 的光斑形状沿纵向拉伸，如图4所示。通过比较实时聚焦光斑与锁定位置聚焦光斑的形状差异，建立闭环负反馈控制回路(PID控制器)，实时反向补偿上显微镜头6和下显微镜头8之间轴向位置漂移。

根据控制理论，实时输出控制信号u(t)可以表述为：

$u\left(t\right)=K_{p}e\left(t\right)+K_I\int e\left(t\right)dt+K_D\frac{d}{dx}e\left(t\right)$

其中e(t)为实时聚焦光斑形状与锁定位置聚焦光斑形状差异，有多种评价函数，较简单的方式是直接计算二者形状的互相关函数值。由于在本实施例中仅使用单一输入控制并且仅有一个控制信号，因此上述公式可以通过拉普拉斯变换进一步简化为：

$u\left(t\right)=(K_p+K_I\frac{1}{t}+K_{D}t)·e\left(t\right)=K\left(t\right)·e\left(t\right)$

则过量补偿参数K(t)可以直接通过忽略系统架构而通过试误法直接得到。在本实施例中，闭环负反馈控制过量补偿参数K(t)根据实测数据优选设置为1.05。

上显微镜头6、下显微镜头8之间如果在垂直光束传输方向发生相对位置的变化，会造成第一CMOS相机12收集的聚焦光斑位置的移动，如图5所示。可以判断出在垂直于光束传输方向上，上显微镜头6、下显微镜头8产生了相对移动。通过实时比较聚焦光斑与锁定位置聚焦光斑的位置差异，建立闭环负反馈控制回路，实时反向补偿上显微镜头6、下显微镜头8之间径向位置漂移。闭环负反馈控制过量补偿参数优选设置为1.05。

入射到第一偏振分束镜3后占光束中能量50％的水平偏振分量被反射，经过偏心孔径光阑13后，形成细光束，光束直径为0.2～0.5毫米。并被第一反射镜14反射，经第三透镜15会聚到第二反射镜16表面，并被第二反射镜16反射，进入第二偏振分束镜4后再次被反射到第一二色镜5表面；经过第一二色镜5反射后，进入上显微镜头6。由于第三透镜15的聚焦位置为上显微镜头6的后焦平面的位置，因此光束会聚在样品表面；由于是细光束，因此在样品表面的入射角较大。当样品处于上显微镜头6的焦平面上时，细光束在样品表面的入射角达到67度，大于玻片/样品界面全反射角，细光束发射全反射。

之后细光束被样品表面反射回上显微镜头6，再次经过第一二色镜5后，被第二偏振分束镜4反射到第二反射镜16表面；之后通过第三透镜15，形成平行细光束，平行细光束的光斑被第二CMOS相机17收集并成像到CMOS传感面的中心位置，如图6所示。

沿光束传播方向，样品下沉时，细光束经过样品表面反射后，在上显微镜头6后焦平面上的聚焦点位置会发生改变。因此，经过第三透镜15后形成的平行细光束在第二CMOS相机17的像面的相对位置会随之发生变化，如图7所示。样品上浮时，则上显微镜头6后焦平面上的聚焦点位置发生反向的变化。通过对图5上两个光斑相对位置的计算，可以判断上显微镜头6与样品的相对位置的变化，从而实现闭环控制锁定并进行反向补偿。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。