一种放射性标记的肿瘤显像剂、其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种放射性标记的肿瘤显像剂、其制备方法和应用，其结构中含有可用于核素标记的α‑氨基酸衍生物结构和肿瘤靶向的叶酸分子，放射性核素为18F，所述α‑氨基酸衍生物结构与叶酸分子以特定的化学形式相连接。本发明还涉及所述化合物的制备方法及其在人或动物体内作为示踪显像剂用于PET显像的用途，特别是用作肿瘤显像剂，其具有制备简单、价格便宜以及靶向性强的优点。

说明书

技术领域

本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一种¹⁸F标记的肿瘤显像剂、其制备方法和应用。

背景技术

α-氨基酸是蛋白质的结构单元，在神经递质和ATP能量转化中起着至关重要的作用。α-氨基酸同时也是肿瘤细胞生存和增殖所必需的营养物质，绝大多数肿瘤都会对氨基酸高摄取，这又会导致高级别肿瘤更高的摄取和肿瘤的转移。氨基酸是肿瘤增殖的信号分子，也起到与肿瘤相关的重新编程代谢网络生物量积累的作用。

另外，叶酸受体在许多肿瘤组织中高表达，如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾丸癌、脑癌、结肠癌、肺腺癌等等。叶酸分子对这些肿瘤具有很高的选择性。

CN103827057A公开了一种被¹⁸F标记的新型的化合物及相应的经¹⁸F标记的化合物本身、其它们的经¹⁹F氟化的类似物以及其它们作为参考标准的用途、制备此类化合物的方法、包含此类化合物的组合物、包含此类化合物或组合物的试剂盒以及此类化合物、组合物或试剂盒用于通过正电子发射断层造影正电子放射断层显像(PET)的诊断成像的用途。

CN101723850A公开了一类新型放射性¹⁸F标记芳香氨基酸，用于肿瘤正电子发射断层(PET)显像研究,其特征在于：一端具有F取代烷氧基苯甲酰基结构；另一端具有α-氨基酸结构，取代基R1位于羧基α位上，R1为苯基、苄基、3-吲哚甲基，R2为甲氧基，n为1-5。R1为苯基、苄基、3-吲哚甲基，R2为甲氧基，n为1-5。

CN101723847A公开了一种¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物，其特征是：同时具有2-¹⁸F-4-硝基苯甲酰和α-氨基酸结构，并有取代基R位于羧基α位上，为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苄基、2-甲硫基乙基、羧乙基、羧丙基、苯基、咪唑甲基。两端结构通过酰胺键直接相连。

CN102126985A公开了¹⁸F标记前体化合物，还同时公开了其制备方法，依次包括以下步骤：1)标记前体化合物的合成：将3,4-二硝基苯甲酸、氨基炔、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶于二甲基甲酰胺中，搅拌反应；反应所得的产物经后处理，得前体化合物；2)前体化合物的标记。上述¹⁸F标记前体化合物能用click>

Bioconjugate Chem.,2008,19,2462–2470公开了一种以¹⁸F标记的叶酸类化合物，其特征是：采用¹⁸F^-离子亲核取代标记前体上的对甲苯磺酰基负离子，然后利用click>

然而，在上述现有技术中，多数小分子显像探针往往只含有一个具有靶向的基团，针对受体或某些物理因素产生靶器官的滞留，但是非靶器官可能因为具有类似受体或具有类似的物理性质对探针同样高摄取，从而导致靶与非靶比值很高。

发明内容

本发明的目的在于克服氨基酸靶向性不强，以及叶酸在肾的高摄取的问题，同时兼具氨基酸的肿瘤高摄取和叶酸在肿瘤的靶向性摄取的优势，提供了一种叶酸与α-氨基酸衍生物偶联的¹⁸F标记的肿瘤显像剂、其制备方法和应用，并通过PET显像将其用于肿瘤或其他疾病的诊断或疗效评估。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种¹⁸F标记的肿瘤显像剂，其结构式如下式Ⅰ所示：

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种上述¹⁸F标记的肿瘤显像剂的制备方法，该制备方法如下反应路线所示：

包括：

1)在第一有机溶剂中，四乙氧基钛催化下，化合物1和化合物2按照摩尔比1:1～1.5的比例，在室温下反应过夜；加入饱和氯化钠溶液淬灭后，硅藻土过滤，滤液取有机相，洗涤干燥，除去溶剂，粗产物用体积比10～20:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液淋洗进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物3；

2)惰性气体保护下，在第二有机溶剂中，(1,3-二环己基-2-亚基)叔丁氧铜(I)催化下，化合物3和化合物4按照摩尔比1:1.5～2.5的比例，在-5～5℃下反应20～48h；除去溶剂，粗产物用体积比10～20:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液淋洗进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物5；

3)惰性气体保护下，在第三有机溶剂中，氯化氢作用下，化合物5与5～15当量的甲醇在室温下反应0.5～3h，生成化合物6；

4)在第四有机溶剂中，氯化氢作用下，化合物6与KHF₂在室温下反应15～25h，除去溶剂，粗产物用体积比10～20:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液淋洗进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物7-1；

5)在pH值为1～3的哒嗪-盐酸缓冲液和DMF的混合溶液中，5～20mCi的¹⁸F和化合物7-1在50～100℃下反应5～20min，生成化合物7-2，即为式Ⅱ所示化合物；

6)在水中，硫酸铜和抗坏血酸钠的催化下，化合物7-2和化合物8在50～100℃反应5～20min，生成化合物9，即为式Ⅰ所示的¹⁸F标记的肿瘤显像剂。

一实施例中：所述步骤5)包括：

a)将¹⁸F从阴离子捕获柱上以碳酸钾、Kryptofix>

b)将化合物7-1溶于体积比为1:0.8～1.2的N,N-二甲基甲酰胺和pH值为1～3哒嗪-盐酸缓冲液中；

c)将步骤a)与步骤b)的产物混合，50～100℃下反应5～30min，冷却，再加适量去离子水稀释后，用硼酸和体积比1:0.5～1.5的PBS-乙醇溶液的体积比1:1.5～2.5的混合液作为淋洗剂进行C18柱纯化，得到化合物7-2。

一实施例中：所述第一有机溶剂、第二有机溶剂、第三有机溶剂、第四有机溶剂为四氢呋喃，甲苯，1,4-二氧六环，N,N-二甲基甲酰胺中的一种，且可以相同或不同。

一实施例中：所述步骤3)中，氯化氢为浓度4M的氯化氢的1,4-二氧六环溶液。

一实施例中：所述步骤4)中，氯化氢浓度为4M。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

上述¹⁸F标记的肿瘤显像剂在制备肿瘤或炎症性相关疾病显像剂中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：

一种可用于制备上述¹⁸F标记的肿瘤显像剂的化合物，其结构式如下式Ⅱ所示：

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：

一种上述式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括：

a)将¹⁸F从阴离子捕获柱上以碳酸钾、Kriptofix>

b)将化合物7-1溶于N,N-二甲基甲酰胺和pH值为1～3哒嗪-盐酸缓冲液中；

c)将步骤a)与步骤b)的产物混合，50～100℃下反应5～30min，冷却，再加适量去离子水稀释后，用硼酸和体积比1:0.5～1.5的PBS-乙醇溶液的体积比1:1.5～2.5的混合液作为淋洗剂进行C18柱纯化，得到化合物7-2。

本发明所指的惰性气体，例如氮气等，用于隔绝实验环境中的空气，避免对反应产生影响；惰性气体保护下进行的反应可以在手套箱内进行。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明克服了现有技术中氨基酸靶向性不强，以及叶酸在肾的高摄取的问题，通过将叶酸与α-氨基酸衍生物偶联来制备得到¹⁸F标记的肿瘤显像剂，有效增加了标记物的极性和水溶性，有利于提高叶酸靶向性和增加肿瘤摄取，使得该肿瘤显像剂兼具氨基酸的肿瘤高摄取和叶酸在肿瘤的靶向性摄取的优势，且二者未出现相互干扰，靶向性强，能够显著地提高靶与非靶比值，经实验证实，小鼠中可获得5以上的靶与非靶比值，且瘤/肌肉比值达9.20，生物评价效果好，有利于临床推广。

2.本发明的制备方法中，通过将氨基酸衍生物与叶酸采用click反应进行偶联，使得反应高效，纯化简单，利于大规模生产。

3.本发明的制备方法中，所用的核素标记方法具有标记能力强，标记时间短，标记产率高，步骤简单的特点，且无需无水标记和HPLC纯化。

附图说明

图1为本发明的¹⁸F标记的肿瘤显像剂在荷KB瘤小鼠体内的PET显像(给药后2h)。

图2为本发明的¹⁸F标记的肿瘤显像剂在荷KB瘤小鼠体内的PET显像(叶酸抑制对照组，给药后2h)。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1：标记前体即化合物7-1和化合物7-2的合成

1)在10ml四氢呋喃中，加入化合物1(0.99g，0.01mol)，化合物2(1.45g，0.012mol)，加入四乙氧基钛(4.56g，0.02mol)，室温下搅拌反应过夜；加入10ml乙酸乙酯稀释后，再加入10ml饱和氯化钠溶液淬灭，搅拌5min，硅藻土过滤除去不溶物，滤液取有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，除去溶剂，粗产物用体积比10～20:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液淋洗进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物3，1.63g；

2)在手套箱中，在2ml甲苯中加入化合物3(0.2g，1mmol)；另将化合物4(0.51g，2mmol)溶于2mL甲苯中，加入至含有化合物3的溶液中；再将(1,3-二环己基-2-亚基)叔丁氧铜(I)(36.6mg，0.1mmol)溶于2mL甲苯中，加入至含有化合物3和化合物4的溶液中；在0℃下反应48h后，加入10ml乙酸乙酯稀释，除去溶剂，粗产物用体积比10～20:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液淋洗进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物5，0.11g；

3)氮气保护下，在0.25ml 4M氯化氢的1,4-二氧六环溶液，加入化合物5(0.33g，1mmol)，甲醇0.41ml，室温下搅拌反应1h，除去溶剂，用体积比2:1的正己烷-乙醚混合液洗涤固体，得到化合物6，0.22g；

4)在1.5mL的Eppendorf管中加入80μL N,N-二甲基甲酰胺，加入化合物6(65mg，8.48μmol)，3M的KHF₂水溶液40μL，4M氯化氢水溶液20μL，20μL水，涡流震荡混匀，在室温下放置反应20h，真空除去溶剂，粗产物用体积比10～20:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液淋洗进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物7-1，3.5mg。

实施例2：¹⁸F标记的肿瘤显像剂即化合物9的制备

(1)制备化合物7-2

a)将¹⁸F从阴离子捕获柱QMA上以碳酸钾、Kriptofix>18F水溶液；

b)在1.5mL离心管中加入pH为2.5的哒嗪-盐酸缓冲液7.5μL，N,N-二甲基甲酰胺7.5μL，实施例1中制备的化合物7-1，1mg；

c)将步骤a)得到的K¹⁸F水溶液(5～20mCi，10μL)加入至步骤b)的溶液中，加热至60℃下反应10min，冷却，再加2ml去离子水稀释后，进行C18Sep-Pak>

(2)在上述含有7-2的溶液中，加入化合物8(1g)，抗坏血酸钠0.1mg，无水硫酸铜0.1mg，加热至80℃反应15min，再将反应物通过制备型HPLC，流动相为乙腈/水，分离得到化合物9，即为式Ⅰ所示的¹⁸F标记的肿瘤显像剂。

实施例3：¹⁸F标记的肿瘤显像剂(化合物9)的生物分布

选用18～20g的裸鼠，在裸鼠前肢腋下注射约细胞数量为5×10⁶的KB细胞液造模。在实验的前一周应改用乏叶酸的食物进行喂食。每只小鼠通过尾静脉注射实施例2制备的¹⁸F标记的肿瘤显像剂即化合物9，注射剂量为10μCi/100μL(生理盐水)，在给药后1h和2h处死，取血和心、肝、肺、肾等主要脏器，称重并计数。在叶酸抑制对照组中，在注射¹⁸F标记的肿瘤显像剂之前10min注射100μg叶酸进行抑制，并在给药2h后将小鼠处死，同样取主要脏器称重计数。结果详见表1和2。

从表1中可见，化合物9在叶酸受体高表达的小鼠肿瘤与肾脏中的摄取都较高，体现了良好的叶酸受体亲和力。而在其他的非靶器官中都没有观察到明显的放射性滞留，能够获得较高的靶与非靶比值(瘤/肌肉比值达9.20)(表2)。经过注射过量未标记叶酸抑制后，肿瘤和肾脏摄取都明显降低(分别减少82.5％和68.2％)，证明该化合物的摄取与叶酸受体特异性高度相关。

表1 ¹⁸F标记肿瘤显像剂即化合物9在荷KB瘤裸鼠体内的生物分布结果(％ID/g，mean±SD，n＝5)

表2 ¹⁸F标记肿瘤显像剂即化合物9在荷KB瘤裸鼠体内的靶/非靶比值

实施例4：¹⁸F标记的肿瘤显像剂(化合物9)的PET显像

肿瘤接种方法同实施例3，待肿瘤长到直径0.5～1cm时，即可进行显像实验。所有显像小鼠在实验前一周喂食乏叶酸食物以避免食物中含有的叶酸成分对实验结果造成的影响。每只小鼠通过尾静脉注射实施例2制备的¹⁸F标记的肿瘤显像剂即化合物9，注射剂量为100μCi/100μL(生理盐水)。在注射放射性标记物之后的2h进行成像。

从图1中可以看出，化合物9在肿瘤与肾脏中的摄取都较高，体现了良好的叶酸受体亲和力。而在其他的非靶器官中都没有观察到明显的放射性滞留，能够获得较高的靶与非靶比值的清晰图像。经过抑制后，肿瘤和肾脏摄取都明显降低(图2)，证明该化合物的摄取与叶酸受体特异性高度相关。结果详见附图1和2。

以上数据表明，采用本发明制备的¹⁸F标记肿瘤显像剂具有标记率高，合成高效等优点。在应用中，靶与非靶比值高，生物评价效果好，有利于临床推广。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。