一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法

摘要

本发明公开了一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法。本发明公开一种检测样品中具有雌激素效应的化合物浓度的方法，包括如下步骤：建立雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线，包括如下步骤：制备双杂交酵母菌处于对数生长期的双杂交酵母菌液。本发明为环境混合污染物的毒性检测和风险评估提供了可靠的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法，属于生物技术领域。

背景技术

雌激素受体干扰物是内分泌干扰物研究的热点之一，水环境中的雌激素受体干扰物包括来源于各种渠道的天然雌激素和其他类/抗雌激素物质。它们在较低的暴露浓度下就会造成生物体的不良影响，而环境中的联合暴露往往意味着加和甚至相互作用的可能性。因此监测雌激素受体干扰物的环境水平及其对生物的不良影响是非常重要的。

许多机构和组织——包括美国环境署、美国健康与公共事业部、经济合作与发展组织等——都提出了检测雌激素效应的生物测试方法清单。与化学分析相比，生物检测方法可以提供雌激素诱导/拮抗效应的整体信息，也更利于综合判断和毒性评估。雌激素受体在雌激素效应的发挥上起到重要作用，因此清单中大多数方法都与雌激素受体相关，鼓励使用受体方法检测雌激素类物质。其中，双杂交技术重组人雌激素受体的酵母测试方法已被应用于各种环境水样的检测，具有灵敏度高、重现性好、操作简便、成本低廉等优点。共激活因子的引入使双杂交酵母与活体测试结果有更好的吻合度。例如，单杂交酵母测试结果显示合成雌激素17α-乙炔基雌二醇的雌激素效应弱于天然雌激素17β-雌二醇(Van den Belt K,et al.Aquat.Toxicol.2004,66(2):183-195)；但虹鳟和双杂交酵母作为受试生物时，17α-乙炔基雌二醇的雌激素效应都被证明比17β-雌二醇更强(Thorpe KL,et al.Environ Sci Technol.2003,37(6):1142-1149；Yang R,et al.Environ.Toxicol.Pharmacol.2014,38(3):829-837)。

上述双杂交酵母测试的工作原理是：天然或环境雌激素可与雌激素受体结合并导致其构象改变，此时的配体—受体复合物可在细胞核内进一步结合共激活因子，启动下游报告基因的转录。然而，雌激素受体拮抗物的存在会干扰这一过程，从而造成对雌激素诱导效应的测试结果的低估。目前，研究多集中在(类)雌激素混合物的联合作用上，而较少关注类雌激素和雌激素受体拮抗物的联合作用。但在某些环境样品中(如医院废水、药厂废水等)，雌激素受体拮抗物可以达到较高的浓度，其造成的效应需要研究者给予重视。这时，生物测试结果描述的是两类物质共同作用的联合效应，而不能利用此效应大小反推真实的雌激素物质水平。因此，对这种干扰甚至掩蔽作用加以关注和评估在污染物毒性评价方面具有现实意义。

综上所述，真实环境中有复杂的类雌激素和雌激素受体拮抗物共同存在。在某些废水中高浓度的雌激素受体拮抗物足以影响生物测试方法对雌激素效应的检测，但这 一点在实际研究中较少受到关注，相关信息和结果较少。因此，需要建立一种方法计算并修正化学混合物及环境样品(可看作复杂混合物)中的雌激素受体拮抗物对使用双杂交酵母方法检测出的雌激素受体诱导效应的干扰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是检测样品中的天然雌激素化合物或类雌激素化合物的浓度。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测样品中具有雌激素效应的化合物浓度的方法，包括如下步骤：

(1)建立雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线，包括如下步骤：

A1、制备双杂交酵母菌处于对数生长期的双杂交酵母菌液；

B1、将雌激素化合物溶液与步骤A1的双杂交酵母菌液按照同一体积比混匀，制备成雌激素化合物各暴露液，使得雌激素化合物各暴露液中的所述双杂交酵母菌含量均相同，雌激素化合物含量均不同；将二甲基亚砜与步骤A1的双杂交酵母菌液混匀，制备成二甲基亚砜暴露液，使得二甲基亚砜暴露液中的所述双杂交酵母菌含量与所述雌激素化合物各暴露液中的所述双杂交酵母菌含量相同；将所述雌激素化合物各暴露液和所述二甲基亚砜暴露液分别进行相同的暴露培养，对应得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亚砜暴露后溶液，检测所述雌激素化合物各暴露后溶液在600nm处的吸光度值OD₆₀₀；

C1、分别取所述雌激素化合物各暴露后溶液或所述二甲基亚砜暴露后溶液，向其中加入测试缓冲液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液，反应，再加入碳酸钠水溶液中止反应，得到对应的雌激素化合物各中止反应溶液和二甲基亚砜中止反应溶液，分别取其上清液检测420nm处的吸光度值OD₄₂₀，按照公式1对应得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亚砜暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性：

U＝(OD_420s-OD_420b)×D/(t×V×OD₆₀₀)>

公式1中，U为暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性；

OD_420s为雌激素化合物各中止反应溶液的上清液在420nm处的吸光度值；

OD_420b为二甲基亚砜中止反应溶液的上清液在420nm处的吸光度值；

D为稀释因子，即雌激素化合物中止反应溶液的体积与步骤C1所取的雌激素化合物各暴露后溶液的体积比，将该体积比命名为D_雌；或，二甲基亚砜中止反应溶液的体积与步骤C1所取的二甲基亚砜暴露后溶液的体积比，将该体积比命名为D_砜；所述D_雌等于D_砜；

t为从加入所述测试缓冲液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液后至加入碳酸 钠水溶液中止反应之间的时间，单位为分钟；

V为检测420nm处的吸光度值OD₄₂₀时所取的上清液体积，单位为毫升；

OD₆₀₀为雌激素化合物各暴露后溶液在600nm处的吸光度值；

所述步骤C1中所述雌激素化合物各暴露后溶液或二甲基亚砜暴露后溶液：测试缓冲液：三氯甲烷：β-半乳糖苷酶底物溶液：碳酸钠水溶液的体积比具体为5：12：2：4；10；

D1、按照公式2得到雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率：

诱导率％＝U_s/U_p×100>

公式2中，U_s和U_p分别为雌激素化合物各暴露后溶液和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性；

所述阳性对照为雌激素化合物含量为K的雌激素化合物暴露液经所述暴露培养后得到的暴露后溶液，雌激素化合物含量为K的雌激素化合物暴露液是将雌激素化合物溶液与步骤A1的双杂交酵母菌液按同一体积比混匀得到的液体；K为以雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量为横坐标，以公式1得到的雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性为纵坐标，制成的雌激素化合物的浓度—β-半乳糖苷酶活性曲线的第二个拐点处对应的雌激素化合物的浓度；

所述雌激素化合物的浓度—β-半乳糖苷酶活性曲线为具有第一平台期、上升期和第二平台期的S型曲线；

E1、以所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量为横坐标，以公式2得到的雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，制作雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线，并得到如下公式3：

E_induction＝f_E(x_E2)>

公式3中，E_induction为雌激素化合物各暴露后溶液的的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率；

f_E中的下标_E代表雌激素；

x_E2为所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量，单位为mol/L；

(2)检测待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，包括如下步骤：

根据步骤(1)得到待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率；

(3)得到待测样品的雌二醇当量E2-EQ_bio，包括如下步骤：

采用公式9得到待测样品的雌二醇当量E2-EQ_bio，单位为mol/L：

E2-EQ_bio＝f_E^-1(E_induction)/cf>

公式9中f_E^-1(E_induction)为公式3的反函数；

f_E^-1中的下标_E代表雌激素；

E_induction为待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率；

cf为待测样品到原始样品的浓缩倍数；

(4)确定待测样品的雌激素受体拮抗物当量OHT-EQ_bio，包括如下步骤：

A4、建立雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线，建立雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的方法与步骤(1)的建立雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线的方法区别仅在于将雌激素化合物替换为雌激素受体拮抗物；

B4、按照公式4得到雌激素受体拮抗物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率：

抑制率％＝(1–U_s/U_p)×100>

公式4中，U_s和U_p分别为雌激素受体拮抗物各暴露后溶液和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性；

所述阳性对照与上述的阳性对照一致；

C4、以雌激素受体拮抗物各暴露液的雌激素受体拮抗物含量为横坐标，以公式4得到的雌激素受体拮抗物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，制作雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线，并得到如下公式5：

E_inhibition＝f_O(x_OHT)>

公式5中，E_inhibition为β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率；

f₀中的下标₀代表雌激素受体拮抗物；

x_OHT为雌激素受体拮抗物各暴露液的雌激素受体拮抗物含量，单位为mol/L；

D4、将雌激素化合物溶液A和待测样品共同替换步骤(1)中的雌激素化合物溶液，作为混合组，雌激素化合物溶液A与混合组暴露液中的双杂交酵母菌液的体积比与待测样品与混合组暴露液中的双杂交酵母菌液的体积比相同，且均与步骤(1)B1中的所述体积比一致，混合组暴露液中的雌激素化合物在加入雌激素化合物溶液A而未加待测样品时的暴露液中的浓度与所述阳性对照对应的雌激素化合物暴露液中的雌激素化合物浓度相同，其余步骤不变，按照步骤(1)得到混合组各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性；

E4、按照公式4得到混合组各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率；

F4、采用公式11得到待测样品的雌激素受体拮抗物当量OHT-EQ_bio，单位为mol/L：

OHT-EQ_bio＝f_O^-1(E_inhibition)/cf>

公式11中，f_O^-1(E_inhibition)为公式5的反函数；

f₀中的下标₀代表雌激素受体拮抗物；

E_inhibition为待测样品的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率；

cf为待测样品到原始样品的浓缩倍数；

(5)利用公式12对E2-EQ_bio进行修正，得到修正后待测样品中具有雌激素效应的化合物的浓度：

E2-EQ_bio*＝{EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio+[(EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio)^2+4×EC₅₀(E2)×EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio×OHT-EQ_bio]^0.5}/2×EC₅₀(OHT)>

公式12中，EC₅₀(OHT)为步骤(4)中C4得到的雌激素受体拮抗物的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的雌激素受体拮抗物的半数效应浓度，EC₅₀(E2)为步骤(1)得到的雌激素化合物的浓度—雌激素效应关系曲线的雌激素化合物的半数效应浓度；

所述双杂交酵母为发明名称为“用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法”，授权公告号为CN101469315B的发明专利中权利要求1-3任一所述的双杂交酵母；

所述双杂交酵母中含有pGBKT7-ER酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表达质粒包含授权公告号为CN101469315B的发明专利公开的SEQ ID No.1所示的人雌激素受体基因片段，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含授权公告号为CN101469315B的发明专利公开的SEQ ID No.2所示的雌激素受体共激活因子基因片段，所用酵母为酿酒酵母Y187，所述双杂交酵母具体可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ER-GRIP1,其保藏编号为CGMCC No.2307；

所述测试缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl、MgSO₄·7H₂O、十二烷基磺酸钠和β-巯基乙醇；所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为16.1g/L，所述NaH₂PO₄·H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为5.5g/L，所述KCl在所述测试缓冲液中的浓度为0.75g/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为0.246g/L，所述十二烷基磺酸钠在所述测试缓冲液中的浓度为0.333g/L，所述β-巯基乙醇在所述测试缓冲液中的浓度为2.7mL/L；

所述β-半乳糖苷酶底物溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl和MgSO₄·7H₂O；所述邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为13.3mmol/L、所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为16.1g/L、所述NaH₂PO₄·H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为5.5g/L、所述KCl在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为0.75g/L、所述MgSO₄·7H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为0.246g/L；

所述碳酸钠水溶液的溶质为碳酸钠，溶剂为水；

该方法适用于E2-EQ_bio和OHT-EQ_bio的比值≥1.57×10^-5的条件下；

所述具有雌激素效应的化合物具体为天然雌激素化合物和/或类雌激素化合物，再具体为17β-雌二醇；

所述OD₆₀₀检测时以SD培养基为空白调零；

所述雌激素化合物溶液、受体拮抗物溶液和所述待测样品均用DMSO为溶剂配制；

上述方法中，所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量为5×10^-13-5×10^-9mol/L；

所述K为2.5×10^-10mol/L。

上述任一所述的方法中，所述步骤(1)的B1中，所述体积比为0.5：100；所述暴露培养的条件为29-31℃暴露培养3.75-4.25小时，具体为30℃暴露培养4小时；

所述步骤(1)的C1中，所述加入测试缓冲液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液的反应条件为29-31℃反应55-65分钟，具体为30℃反应60分钟；

所述碳酸钠水溶液的溶质为碳酸钠，溶剂为水，碳酸钠在所述碳酸钠水溶液中的浓度为1mol/L；

所述公式1中所述D为6.6，t为60min，V为0.2mL；

所述公式3为E_induction＝f_E(x_E2)＝-4.3392+106.0969/[1+(x_E2/6.7297×10^-11)]^|-2.9914|；

所述步骤(1)的A1中，所述双杂交酵母菌液的OD₆₀₀为0.6-0.8，具体为0.75。

上述任一所述的方法中，所述步骤(4)中所述雌激素受体拮抗物各暴露液的雌激素受体拮抗物含量为1×10^-9-1×10^-4mol/L；

所述公式5为E_inhibition＝f_O(x_OHT)＝-0.0121+99.8780/[1+(x_OHT/4.7103×10^-7)]^|-1.4745|。

上述任一所述的方法中，所述雌激素化合物为17β-雌二醇。

上述任一所述的方法中，所述雌激素受体拮抗物为4-羟基他莫西芬。

上述任一所述的方法中，所述待测样品由原始样品经过固相萃取富集其中的所述具有雌激素效应的化合物得到；

所述固相萃取具体为反相色谱萃取。

上述任一所述的方法中，所述原始样品为化学混合物或环境样品；

所述环境样品具体为水样。

为了解决以上技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法在检测环境污染物中的应用；

所述环境污染物具体为具有雌激素效应的化合物；

所述具有雌激素效应的化合物具体为天然雌激素化合物和/或类雌激素化合物，再具体为17β-雌二醇。

为了解决以上技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法在评估环境污染中的应用。

上述公式中的^代表乘方，如2的5次方可表示为2^5。

本发明提供的方法可以修正雌激素受体拮抗物对雌激素检测的干扰，准确评估化学混合物及环境样品中雌激素或类雌激素化合物的水平。由于标准化合物当量法(E2-EQ和OHT-EQ)是建立在混合物各组分作用方式相似这一基础上的方法，因此该方法可应用于提供单一作用模式和作用位点的生物测试系统，如双杂交酵母测试。本发明为环境混合污染物的毒性检测和风险评估提供了可靠的技术手段。

附图说明

图1为实施例1中单一雌激素或雌激素受体干扰物的浓度—响应曲线。

图2为实施例1中6组混合物利用双杂交酵母测试进行雌激素效应检测的剂量—效应关系曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

17β-雌二醇为Sigma-Aldrich公司产品。

4-羟基他莫昔芬为Sigma-Aldrich公司产品。

氟维司群为Sigma-Aldrich公司产品。

下述实施例中的双杂交酵母在发明名称为“用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法”，授权公告号为CN101469315B的发明专利中公开过，公众可从中国科学院生态环境研究中心获得，该双杂交酵母中含有pGBKT7-ER酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表达质粒包含授权公告号为CN101469315B的发明专利公开的SEQ ID No.1所示的人雌激素受体基因片段，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含授权公告号为CN101469315B的发明专利公开的SEQ ID No.2所示的雌激素受体共激活因子基因片段，所用酵母为酿酒酵母Y187。实 施例中所使用的该双杂交酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ER-GRIP1,其保藏编号为CGMCC No.2307。

下述实施例中测试缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl、MgSO₄·7H₂O、十二烷基磺酸钠和β-巯基乙醇；所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为16.1g/L，所述NaH₂PO₄·H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为5.5g/L，所述KCl在所述测试缓冲液中的浓度为0.75g/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述测试缓冲液中的浓度为0.246g/L，所述十二烷基磺酸钠在所述测试缓冲液中的浓度为0.333g/L，所述β-巯基乙醇在所述测试缓冲液中的浓度为2.7mL/L；

下述实施例中含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl和MgSO₄·7H₂O；所述邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为13.3mmol/L、所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为16.1g/L、所述NaH₂PO₄·H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为5.5g/L、所述KCl在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为0.75g/L、所述MgSO₄·7H₂O在所述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液中的浓度为0.246g/L。

实施例1、检测并修正化学混合物样品中的雌激素物质水平的方法

一、雌激素化合物17β-雌二醇的浓度—雌激素效应关系曲线的建立

(一)将双杂交酵母接入SD培养基中培养至双杂交酵母处于对数生长期，得到双杂交酵母初始菌液，采用SD培养基调节其在600nm的吸光度值为0.75(以SD培养基调零，)，得到双杂交酵母菌液。

(二)将17β-雌二醇(E2)溶于DMSO，制成浓度为1×10^-10～1×10^-6mol/L的E2标准测试液，将E2标准测试液按照体积比0.5％的比例分别添加至步骤(一)的双杂交酵母菌液中，制备成暴露液，使暴露液中的E2浓度范围为5×10^-13～5×10^-9mol/L；将各暴露液按200μL/孔接种至96孔板中，30℃暴露培养4小时(29-31℃暴露培养3.75-4.25小时均可)，在600nm处检测吸光度值OD₆₀₀，作为E2标准测试液组；同时以等体积的二甲基亚砜(DMSO)代替上述E2标准测试液，其余步骤不变，作为阴性对照；以暴露液中的E2浓度为2.5×10^-10mol/L的E2标准测试液组样品作为阳性对照。

2.5×10^-10mol/L为以E2标准测试液组样品对应的暴露液的E2浓度为横坐标，单位为mol/L，以E2标准测试液组样品对应的β-半乳糖苷酶活性为纵坐标，制成的17β-雌二醇的浓度—β-半乳糖苷酶活性曲线的第二个拐点处对应的E2标准测试液 组样品对应的暴露液的E2浓度，17β-雌二醇的浓度—β-半乳糖苷酶活性曲线为具有第一平台期、上升期和第二平台期的S型曲线。

(三)将50μL暴露培养后的各暴露液转移到一块新96孔板中，向各孔中加入120μL测试缓冲液(16.1g/L>2HPO₄·7H₂O，5.5g/L>2PO₄·H₂O，0.75g/L>4·7H₂O，0.333g/L十二烷基磺酸钠，2.7mL/Lβ-巯基乙醇，余量为水)、20μL三氯甲烷和40μL含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(13.3mmol/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，16.1g/L>2HPO₄·7H₂O，5.5g/LNaH₂PO₄·H₂O，0.75g/L>4·7H₂O，余量为水)，30℃反应60分钟(29-31℃反应55-65分钟均可)，向各孔中添加100μL的1mol/L的碳酸钠水溶液中止反应，静置10分钟后取200μL上清液用分光光度计检测420nm处的吸光度值，按照公式1计算E2标准测试液组样品和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性：

U＝(OD_420s-OD_420b)×D/(t×V×OD₆₀₀)>

公式1中，U为β-半乳糖苷酶活性；OD_420s、OD_420b分别为E2标准测试液组样品或阳性对照在420nm下的吸光度值、阴性对照在420nm下的吸光度值；D为稀释因子(即加入碳酸钠水溶液后的体系与加入测试缓冲液前的体系的体积比，本实验具体为6.6)；t为反应时间(单位为分钟，本实验具体为60min)；V为测定OD₄₂₀时的溶液体积(单位为毫升，本实验具体为0.2mL)；OD₆₀₀为E2标准测试液组样品在600nm下的吸光度值。

(四)按照公式2计算β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率：

诱导率％＝U_s/U_p×100>

公式2中，U_s和U_p分别为E2标准测试液组样品和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性。

(五)以E2标准测试液组样品对应的暴露液的E2浓度为横坐标，单位为mol/L，以E2标准测试液组样品对应的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，绘制17β-雌二醇的浓度—雌激素效应关系曲线(如图1所示)，该曲线由4参数的Logistic函数拟合而成，公式如公式3所示：

E_induction＝f_E(x_E2)＝-4.3392+106.0969/[1+(x_E2/6.7297×10^-11)]^|-2.9914|(公式3)

公式3中，E_induction为诱导率，f_E中的下标_E代表雌激素，x_E2为E2标准测试液组样品对应的暴露液的17β-雌二醇浓度(单位为mol/L)，106.0969、-4.3392、6.7297×10^-11、|-2.9914|四个参数分别代表了最大诱导率、最小诱导率、E2的半数效应浓度EC₅₀(E2)(诱导率为50％时所对应的暴露液的E2浓度(单位为mol/L))和EC₅₀(E2)处的曲线斜率，拟合的决定系数r-square＝0.9927。

二、雌激素受体拮抗物4-羟基他莫昔芬(OHT)和氟维司群(FUL)的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的建立

(一)取处于对数生长期的双杂交酵母细胞，以SD培养基调零，调节其在600nm的吸光度值位于0.6-0.8之间(通常为0.75)，得到双杂交酵母菌液。

(二)将E2、OHT或FUL分别溶于DMSO，制成浓度为5×10^-8mol/L的E2标准测试液、2×10^-7～2×10^-2mol/L的OHT标准测试液或2×10^-7～2×10^-2mol/L的FUL标准测试液，将各标准测试液按照体积比0.5％的比例分别添加至步骤(一)的双杂交酵母菌液中，制备成暴露液，使暴露液中的E2浓度为2.5×10^-10mol/L，OHT或FUL暴露浓度范围为1×10^-9～1×10^-4mol/L；将各暴露液分别按200μL/孔接种至96孔板中，30℃暴露培养4小时(29-31℃暴露培养3.75-4.25小时均可)，在600nm处检测吸光度值OD₆₀₀，分别作为E2标准测试液组、OHT标准测试液组和FUL标准测试液组；同时以等体积的二甲基亚砜(DMSO)代替上述标准测试液，其余步骤不变，作为阴性对照；以E2标准测试液组样品作为阳性对照。

(三)将50μL各暴露液转移到一块新96孔板中，向各孔中加入120μL测试缓冲液(16.1g/L>2HPO₄·7H₂O，5.5g/L>2PO₄·H₂O，0.75g/L>4·7H₂O，0.333g/L十二烷基磺酸钠，2.7mL/Lβ-巯基乙醇，余量为水)、20μL三氯甲烷和40μL含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(13.3mmol/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，16.1g/L>2HPO₄·7H₂O，5.5g/L>2PO₄·H₂O，0.75g/L>4·7H₂O，余量为水)，30℃反应60分钟(29-31℃反应55-65分钟均可)，添加100μL的1mol/L的碳酸钠水溶液中止反应，静置10分钟后取200μL上清液用分光光度计检测420nm处的吸光度值，按照公式1计算各个标准测试液组样品和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性。

(四)按照公式4计算β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率：

抑制率％＝(1–U_s/U_p)×100>

公式4中，U_s和U_p分别为各个标准测试液组样品和阳性对照的β-半乳糖苷酶活性。

(五)以OHT标准测试液组样品对应的暴露液的4-羟基他莫昔芬浓度为横坐标，单位为mol/L，以OHT标准测试液组样品对应的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，绘制4-羟基他莫西芬的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线(如图1所示)。

以FUL标准测试液组样品对应的暴露液的氟维司群浓度为横坐标，单位为mol/L，以FUL标准测试液组样品对应的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，绘制氟维司群的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线(如图1所示)。

上述4-羟基他莫西芬的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线和氟维司群的浓度 —雌激素受体拮抗效应关系曲线均由4参数的Logistic函数拟合而成，分别如公式5和6所示：

E_inhibition＝f_O(x_OHT)＝-0.0121+99.8780/[1+(x_OHT/4.7103×10^-7)]^|-1.4745|(公式5)

E_inhibition＝f_F(x_FUL)＝0.8193+94.6611/[1+(x_FUL/4.0263×10^-7)]^|-2.3868|(公式6)

公式5中，E_inhibition为抑制率，f₀中的下标₀代表4-羟基他莫西芬，x_OHT为OHT标准测试液组样品对应的暴露液的4-羟基他莫昔芬浓度(单位为mol/L)，99.8780、-0.0121、4.7103×10^-7、|-1.4745|四个参数分别代表了最大抑制率、最小抑制率、4-羟基他莫昔芬的半数效应浓度EC₅₀(OHT)(抑制率为50％时所对应的暴露液的4-羟基他莫昔芬浓度(单位为mol/L))和EC₅₀(OHT)处的曲线斜率，拟合的决定系数r-square＝0.9875。

公式6中，E_inhibition为抑制率，f_F中的下标_F代表氟维司群，x_FUL为FUL标准测试液组样品对应的暴露液的氟维司群浓度(单位为mol/L)，94.6611、0.8193、4.0263×10^-7、|-2.3868|四个参数分别代表了最大抑制率、最小抑制率、氟维司群的半数效应浓度EC₅₀(FUL)(抑制率为50％时所对应的暴露液的氟维司群浓度(单位为mol/L))和EC₅₀(FUL)处的曲线斜率，拟合的决定系数r-square＝0.9855。

三、混合物的雌二醇当量(E2-EQ，单位为mol/L)和他莫昔芬当量(OHT-EQ，单位为mol/L)的计算及混合物的生物测试的雌二醇当量的计算和修正

下述步骤中的EC₅₀(E2)为步骤一中的EC₅₀(E2)、EC₅₀(OHT)和EC₅₀(FUL)为步骤二中的EC₅₀(OHT)和EC₅₀(FUL)。

(一)组I包括如下3个混合物：

组I编号为1的混合物：溶质为17β-雌二醇和4-羟基他莫昔芬，溶剂为DMSO；17β-雌二醇和4-羟基他莫昔芬按照EC₅₀(E2):EC₅₀(OHT)的比例溶于DMSO；

组I编号为2的混合物：溶质为17β-雌二醇和4-羟基他莫昔芬，溶剂为DMSO；17β-雌二醇和4-羟基他莫昔芬按照[2×EC₅₀(E2)]:EC₅₀(OHT)的比例溶于DMSO；

组I编号为3的混合物：溶质为17β-雌二醇和4-羟基他莫昔芬，溶剂为DMSO；17β-雌二醇和4-羟基他莫昔芬按照EC₅₀(E2):[2×EC₅₀(OHT)]的比例溶于DMSO；

组II包括如下3个混合物：

组II编号为1的混合物：溶质为17β-雌二醇、4-羟基他莫昔芬和氟维司群，溶剂为DMSO；17β-雌二醇在组II编号为1的混合物中的浓度与组I编号为1的混合物中相等，4-羟基他莫昔芬在组II编号为1的混合物中的浓度为组I编号为1的混合物中浓度的1/2，4-羟基他莫昔芬和氟维司群的比例为EC₅₀(OHT):EC₅₀(FUL)；

组II编号为2的混合物：溶质为17β-雌二醇、4-羟基他莫昔芬和氟维司群，溶剂为DMSO；17β-雌二醇在组II编号为2的混合物中的浓度与组I编号为2的混合物中相等，4-羟基他莫昔芬在组II编号为2的混合物中的浓度为组I编号为2的混合物中浓度的1/2，4-羟基他莫昔芬和氟维司群的比例为EC₅₀(OHT):EC₅₀(FUL)；

组II编号为3的混合物：溶质为17β-雌二醇、4-羟基他莫昔芬和氟维司群，溶剂为DMSO；17β-雌二醇在组II编号为3的混合物中的浓度与组I编号为3的混合物中相等，4-羟基他莫昔芬在组II编号为3的混合物中的浓度为组I编号为3的混合物中浓度的1/2，4-羟基他莫昔芬和氟维司群的比例为EC₅₀(OHT):EC₅₀(FUL)。

上述各组混合物的具体组分浓度如表1所示。

表1 雌激素—雌激素受体拮抗物混合物组分浓度(mol/L)

(二)将混合物的雌激素受体诱导/拮抗效应分别折合成可导致相同效应的E2和OHT浓度的雌二醇当量(E2-EQ，单位为mol/L)和他莫昔芬当量(OHT-EQ，单位为mol/L)分别用来表示混合物的整体雌激素效应水平和整体雌激素受体拮抗效应水平。在已知混合物中各物质浓度的情况下，E2-EQ和OHT-EQ可分别由公式7和8计算得到：

$E2-\mathrm{EQ}={\Sigma }_{i=1}^n(c_i\times \frac{{\mathrm{EC}}_{50}\left(E2\right)}{{\mathrm{EC}}_{50}\left(i\right)})$>

$\mathrm{OHT}-\mathrm{EQ}={\Sigma }_{i=1}^n(c_i\times \frac{{\mathrm{EC}}_{50}\left(\mathrm{OHT}\right)}{{\mathrm{EC}}_{50}\left(i\right)})$>

公式7中，c_i和EC₅₀(i)分别表示雌激素(此处为17β-雌二醇)中第i个种类的雌激素物质的暴露浓度(单位为mol/L)和该物质单独作用的半数效应浓度；

公式8中，c_i和EC₅₀(i)分别表示雌激素受体拮抗物(包括4-羟基他莫昔芬和氟维司群)中第i个种类的雌激素受体拮抗物的暴露浓度(单位为mol/L)和该物质单独作用的半数效应浓度。

(三)根据表1和公式7/8，可知各混合物由化学数据计算得到组I编号为1的 混合物、组I编号为2的混合物、组I编号为3的混合物、组II编号为1的混合物，组II编号为2的混合物，组II编号为3的雌二醇当量E2-EQ分别为4.8×10^-10、9.6×10^-10、4.8×10^-10、4.8×10^-10、9.6×10^-10、4.8×10^-10mol/L，相应的他莫昔芬当量OHT-EQ分别为3.36×10^-6、3.36×10^-6、6.72×10^-6、3.36×10^-6、3.36×10^-6、6.72×10^-6mol/L。

(四)各组的各混合物的生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio，单位为mol/L)计算

1、取处于对数生长期的双杂交酵母细胞，以SD培养基调零，调节其在600nm的吸光度值位于0.6-0.8之间(通常为0.75)，得到双杂交酵母菌液。

2、将各组的各混合物分别按照二倍稀释法用DMSO稀释出7个浓度梯度，制成各组的各混合物的梯度稀释液，将各组的各混合物的梯度稀释液按照体积比0.5％的比例分别添加至步骤1的双杂交酵母菌液中，制备成暴露液；将各暴露液分别按200μL/孔接种至96孔板中，30℃暴露培养4小时(29-31℃暴露培养，3.75-4.25小时均可)，在600nm处检测吸光度值OD₆₀₀。

3、将50μL各暴露液转移到一块新96孔板中，向各孔中加入120μL测试缓冲液(16.1g/L>2HPO₄·7H₂O，5.5g/L>2PO₄·H₂O，0.75g/L>4·7H₂O，0.333g/L十二烷基磺酸钠，2.7mL/Lβ-巯基乙醇，余量为水)、20μL三氯甲烷和40μL含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(13.3mmol/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，16.1g/L>2HPO₄·7H₂O，5.5g/L>2PO₄·H₂O，0.75g/L>4·7H₂O，余量为水)，30℃反应60分钟(29-31℃反应55-65分钟均可)，添加100μL>

4、按照公式2计算各个梯度稀释样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，以各组的各混合物的梯度稀释液样品对应的浓缩倍数为横坐标，以各组的各混合物的梯度稀释液样品对应的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，绘制两组共6个混合物的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线(如图2所示)。

图2中，I-1为组I编号为1的混合物；I-2为组I编号为2的混合物；I-3为组I编号为3的混合物；II-1为组II编号为1的混合物；II-2为组II编号为2的混合物；II-3为组II编号为3的混合物。

5、取位于图2中曲线线性区间内的梯度稀释样品的浓缩倍数及该梯度稀释样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，用公式9计算各组的各混合物的雌激素效应，以生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio，单位为mol/L)表示：

E2-EQ_bio＝f_E^-1(E_induction)/cf>

公式9中，E_induction为位于混合物的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间内样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，cf为样品的浓缩倍数(浓缩倍数即稀释倍数的倒数)。

由此，生物测试获得的组I编号为1的混合物、组I编号为2的混合物、组I编号为3的混合物、组II编号为1的混合物，组II编号为2的混合物，组II编号为3的混合物的E2-EQ_bio分别为2.57×10^-10、6.34×10^-10、1.94×10^-10、2.43×10^-10、6.35×10^-10、2.16×10^-10mol/L，与步骤(三)由化学数据计算得到的组I编号为1的混合物、组I编号为2的混合物、组I编号为3的混合物、组II编号为1的混合物，组II编号为2的混合物，组II编号为3的混合物的雌二醇当量E2-EQ相差较大。

(五)使用E2-EQ_bio和OHT-EQ计算排除雌激素受体拮抗物的干扰得到样品的雌激素物质水平(用带星号的生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio*，单位为mol/L)表示)

1、使用公式10对E2-EQ_bio进行修正：

E2-EQ_bio*＝{EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio+[(EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio)^2+4×EC₅₀(E2)×EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio×OHT-EQ]^0.5}/2×EC₅₀(OHT)>

公式10中，E2-EQ_bio为步骤(四)测得的生物测试的雌二醇当量，OHT-EQ为步骤(二)计算得到的他莫西芬当量，EC₅₀(OHT)为步骤二中4-羟基他莫昔芬的半数效应浓度，EC₅₀(E2)为步骤一中E2的半数效应浓度EC₅₀(E2)。

2、经过步骤1的修正后得到的组I编号为1的混合物、组I编号为2的混合物、组I编号为3的混合物、组II编号为1的混合物，组II编号为2的混合物，组II编号为3的混合物排除雌激素受体拮抗物影响后的E2-EQ_bio*分别为5.03×10^-10、9.53×10^-10、5.39×10^-10、3.92×10^-10、8.21×10^-10、4.48×10^-10mol/L，与E2-EQ_bio相比，修正值后得到的E2-EQ_bio*与由化学数据计算得到的E2-EQ更为吻合。

综上所述，该方法可用于准确预测化学混合物中实际存在的雌激素物质水平。

(六)双杂交酵母测试的检测限为浓度2.5×10^-10mol/L的17β-雌二醇所诱导β-半乳糖苷酶活性的10％(EC₁₀(E2))。因此，当OHT-EQ可以计算得到、而混合物各个梯度稀释样品的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率均小于10％时，可能样品中仍存在雌激素或类雌激素化合物，但其作用被较高浓度的雌激素受体拮抗物掩蔽(在E2-EQ和OHT-EQ的浓度比小于1.57×10^-5时发生)。此时本方法不足以进行雌激素效应的计算和修正。雌激素物质水平的评估需要结合化学分析展开。

实施例2、水源地水样中雌激素化合物和/或类雌激素化合物水平的检测并修正

选取采自16个水源地的水样，这些样点覆盖了我国七大流域中的六个，以其作为未知雌激素受体干扰物种类和浓度的样品，利用双杂交酵母法测试16个水样的雌激素 化合物和/或类雌激素化合物浓度，并对雌激素受体拮抗物造成的低估进行计算修正。

具体步骤如下：

一、采用24小时连续采样技术分别采集中国六大流域16个水源地水样各20L。将各待测水样进行固相萃取后收集洗脱液，即实现对所述各待测水样中雌激素受体干扰物的提取，之后用DMSO按照二倍稀释法将各待测水样的洗脱液稀释出多个浓度梯度，作为待测样品梯度稀释液。

待测水样的前处理、固相萃取和洗脱步骤可参照文献“Jiang WW,et al.J.Environ.Sci.2012,24(2):320-328”。具体为：

A.使用棕色玻璃瓶和Millipore整套过滤装置和玻璃滤膜过滤对水样进行采集和过滤，加入体积百分含量0.5％的甲醇抑制微生物活性；

B.采用500mg、6mL的HLB固相萃取柱用于水样富集，HLB柱在使用前依次用二氯甲烷、甲醇、蒸馏水各5mL清洗，调节好真空度，使水样过柱的流速恒定在10mL/min；

C.富集完毕后将水抽干，以10mL二氯甲烷为洗脱剂，分三次淋洗(4mL、3mL、3mL)，抽干后保持相同真空度30分钟；

D.洗脱液均收集于K-D浓缩器刻度量管中，添加无水硫酸钠脱水，高纯氮气轻柔吹干后置换到二甲基亚砜(DMSO)溶液中，按照体积比1:2的比例经DMSO稀释多个浓度梯度，得到待测样品梯度稀释液。

二、用待测样品梯度稀释液单独暴露双杂交酵母，计算酵母方法实测的水样雌激素效应，以折算成17β-雌二醇(E2)浓度的雌二醇当量(E2-EQ_bio，mol/L)表示

(一)雌激素化合物17β-雌二醇的浓度—雌激素效应关系曲线的建立同实施例1的步骤一。

(二)将步骤一的待测样品梯度稀释液替换实施例1的步骤一中的E2标准测试液，其余步骤不变，按照公式2计算得到待测样品梯度稀释液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率。

(三)以待测样品梯度稀释液对应的浓缩倍数为横坐标，以待测样品梯度稀释的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，绘制各待测样品的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线，取位于各待测样品的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的浓缩倍数及β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，用公式9计算待测样品的生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio，单位为mol/L)：

E2-EQ_bio＝f_E^-1(E_induction)/cf>

公式9中f_E^-1(E_induction)为公式3的反函数。

公式9中，E_induction为位于各待测样品的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，f_E^-1中的下标_E代表雌激素， cf为该梯度稀释液的浓缩倍数(浓缩倍数即稀释倍数的倒数)。

各待测样品的生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio，单位为mol/L)结果如表2所示。

三、用步骤一的待测水样的梯度稀释液和雌激素E2共同暴露双杂交酵母，计算水样的雌激素受体拮抗效应，以折算成4-羟基他莫昔芬(OHT)浓度的他莫西芬当量(OHT-EQ_bio，mol/L)

(一)雌激素受体拮抗物4-羟基他莫西芬的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的建立同实施例1中步骤二。

(二)将用DMSO配制的5×10^-8mol/L的17β-雌二醇和各待测样品梯度稀释液替换实施例1中步骤二的2×10^-7～2×10^-2mol/L的OHT标准测试液，5×10^-8mol/L的17β-雌二醇和各待测样品梯度稀释液均按照体积比0.5％的比例共同添加至双杂交酵母菌液中，其余步骤不变，按照公式4计算各样品的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率。

(三)以待测样品梯度稀释液对应的浓缩倍数为横坐标，以待测样品梯度稀释的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，绘制各待测样品的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线，取位于各待测样品的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的浓缩倍数及β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率，用公式11计算待测样品的雌激素受体拮抗效应，以他莫昔芬当量(OHT-EQ_bio，mol/L)表示：

OHT-EQ_bio＝f_O^-1(E_inhibition)/cf(公式11)

公式11中f_O^-1(E_inhibition)为公式5的反函数。

公式11中，E_inhibition为待测样品梯度稀释的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率，f_O^-1中的下标₀代表4-羟基他莫西芬，cf为待测样品梯度稀释液对应的浓缩倍数(浓缩倍数即稀释倍数的倒数)。

待测样品的他莫西芬当量(OHT-EQ_bio，mol/L)结果如表2所示。

表2 中国六大流域水源地样品雌激素受体干扰效应检测结果(mol/L)

水样E2-EQ_bioOHT-EQ_bio水样E2-EQ_bioOHT-EQ_bio11.91×10^-129.29×10^-1094.92×10^-123.77×10^-922.02×10^-123.87×10^-10108.08×10^-124.52×10^-931.58×10^-121.37×10^-9116.53×10^-122.50×10^-941.36×10^-122.63×10^-9128.81×10^-123.23×10^-955.87×10^-132.53×10^-9137.67×10^-121.63×10^-961.25×10^-121.96×10^-9142.94×10^-133.61×10^-1074.15×10^-123.51×10^-9155.51×10^-131.73×10^-9

83.60×10^-125.01×10^-9169.91×10^-136.45×10^-11

四、利用OHT-EQ_bio对E2-EQ_bio进行修正

(一)修正公式为：

E2-EQ_bio*＝{EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio+[(EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio)^2+4×EC₅₀(E2)×EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio×OHT-EQ_bio]^0.5}/2×EC₅₀(OHT)>

公式12中，E2-EQ_bio为步骤二测试得到的雌二醇当量，OHT-EQ_bio为步骤三测试得到的他莫西芬当量，EC₅₀(OHT)为步骤三中4-羟基他莫西芬的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线表示的4-羟基他莫西芬的半数效应浓度，EC₅₀(E2)为步骤二中17β-雌二醇的浓度—雌激素效应关系曲线表示的17β-雌二醇的半数效应浓度。

得到16个待测样品排除雌激素受体拮抗物影响的雌二醇当量E2-EQ_bio*分别为2.03×10^-12、2.07×10^-12、1.75×10^-12、1.67×10^-12、8.40×10^-13、1.48×10^-12、4.60×10^-12、4.21×10^-12、5.41×10^-12、8.68×10^-12、6.87×10^-12、9.25×10^-12、7.90×10^-12、3.38×10^-13、7.36×10^-13、1.00×10^-12mol/L，分别为E2-EQ_bio的1.07、1.03、1.11、1.23、1.43、1.19、1.11、1.17、1.10、1.07、1.05、1.05、1.03、1.15、1.34、1.01倍。

对于E2-EQ与OHT-EQ之比较低的样品点(如4-5、15等)，修正前和修正后的雌二醇当量值有20％以上差异。

因此，采用双杂交酵母法检测水源水样品的雌激素浓度时，雌激素受体拮抗物的存在可能使测得的雌二醇当量低于其原本的雌激素类物质的水平。在此情况下，同步检测雌激素受体拮抗效应、并对测得的雌二醇当量进行修正是很必要的。

实施例3、污水处理厂水样中类雌激素化合物水平的检测并修正

选取采自中国南方某污水处理厂的进水样品(A)、沙滤出水样品(B)、一线出水样品(C)和二线出水样品(D)作为未知雌激素受体干扰物种类和浓度的水样，利用双杂交酵母法测试其类雌激素化合物浓度，并对雌激素受体拮抗物造成的低估进行计算修正。

具体步骤如下：

一、分别采集中国南方某污水处理厂进水样品(A)、沙滤出水样品(B)、一线出水样品(C)和二线出水样品(D)各10L。将各待测水样进行固相萃取后收集洗脱液，之后用DMSO按照二倍稀释法将各待测水样的洗脱液稀释出多个浓度梯度，作为待测样品梯度稀释液。

待测水样的前处理、固相萃取和洗脱步骤可参照文献“李剑.核受体超家族检测环境内分泌干扰物新技术.北京:中国科学院研究生院,2008”。具体为：

A.使用棕色玻璃瓶和Millipore整套过滤装置和玻璃滤膜过滤对水样进行采集和过滤，加入叠氮化钠(500mg/L)抑制微生物活性；

B.量取5L各待测水样，用Oasis C18柱固相萃取小柱富集，加入甲醇：乙酸乙酯(体积比1:1)的混合溶剂洗脱，收集粗提组分，粗提组分加入无水硫酸钠去除水分后过滤，高纯氮气吹干置换溶剂为0.5mL的二甲基亚砜(DMSO)，粗提组分用角标1表示；

C.余下的5L各待测水样按照上述方法富集洗脱后制备粗提组分，再将其上样硅胶柱净化，采用正己烷：二氯甲烷(体积比1:1)洗脱，去除非极性组分，加入乙酸乙酯洗脱得到净化组分，净化组分经高纯氮气吹干后置换溶剂为0.5mL的DMSO，净化组分用角标2表示；

D.粗提组分和净化组分都按照二倍稀释法用DMSO稀释出多个浓度梯度，得到待测样品的粗提组分和净化组分的梯度稀释液并于-20℃下保存。

二、用待测样品的粗提组分和净化组分的梯度稀释液分别单独暴露双杂交酵母，计算酵母方法实测的水样雌激素效应，以折算成17β-雌二醇(E2)浓度的雌二醇当量(E2-EQ_bio，mol/L)表示

(一)雌激素化合物17β-雌二醇的浓度—雌激素效应关系曲线的建立步骤同实施例1的步骤一。

(二)将步骤一的待测样品的粗提组分和净化组分的梯度稀释液替换实施例1的步骤一中的E2标准测试液，其余步骤不变，按照公式2计算得到待测样品的粗提组分和净化组分的梯度稀释的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率。

(三)以待测样品的粗提组分的梯度稀释液对应的浓缩倍数为横坐标，以待测样品的粗提组分的梯度稀释液对应的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，绘制待测样品的粗提组分的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线；

以待测样品的净化组分的梯度稀释液对应的浓缩倍数为横坐标，以待测样品的净化组分的梯度稀释液对应的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率为纵坐标，绘制各待测样品的净化组分的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线；

分别取位于粗提组分的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线、净化组分的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的浓缩倍数及其对应的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，用公式9计算待测样品的粗提组分和净化组分的生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio，单位为mol/L)：

E2-EQ_bio＝f_E^-1(E_induction)/cf>

公式9中f_E^-1(E_induction)为公式3的反函数。

公式9中，E_induction为位于粗提组分的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线或净化 组分的浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的β-半乳糖苷酶活性参数的诱导率，cf为该梯度稀释液的浓缩倍数(浓缩倍数即稀释倍数的倒数)。

待测样品的粗提组分和净化组分的生物测试的雌二醇当量(E2-EQ_bio，单位为mol/L)结果如表3所示。

三、用步骤一的待测样品的粗提组分和净化组分的梯度稀释液和雌激素E2共同暴露双杂交酵母，计算水样的雌激素受体拮抗效应，以折算成4-羟基他莫昔芬(OHT)浓度的他莫西芬当量(OHT-EQ_bio，mol/L)

(一)雌激素受体拮抗物4-羟基他莫西芬的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线的建立同实施例1中步骤二。

(二)将用DMSO配制的5×10^-8mol/L的17β-雌二醇和待测样品的粗提组分或净化组分的梯度稀释液替换实施例1中步骤二的2×10^-7～2×10^-2mol/L的OHT标准测试液，5×10^-8mol/L的17β-雌二醇和各待测样品的粗提组分或净化组分的梯度稀释液均按照体积比0.5％的比例共同添加至双杂交酵母菌液中，其余步骤不变，按照公式4计算各样品的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率。

(三)以待测样品的粗提组分梯度稀释液对应的浓缩倍数为横坐标，以其对应的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，绘制各待测样品的粗提组分浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线；

以待测样品的净化组分梯度稀释液对应的浓缩倍数为横坐标，以其对应的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率为纵坐标，绘制各待测样品的净化组分浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线；

分别取位于粗提组分浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线或净化组分浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的浓缩倍数及其对应的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率，用公式11计算待测样品的雌激素受体拮抗效应，以他莫昔芬当量(OHT-EQ_bio，mol/L)表示：

OHT-EQ_bio＝f_O^-1(E_inhibition)/cf>

公式11中f_O^-1(E_inhibition)为公式5的反函数。

公式11中，E_inhibition为各待测样品的粗提组分浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线或各待测样品的净化组分浓度—雌激素受体诱导效应关系曲线线性区间的梯度稀释液的β-半乳糖苷酶活性参数的抑制率，cf为梯度稀释液对应的浓缩倍数(浓缩倍数即稀释倍数的倒数)。

待测样品的他莫西芬当量(OHT-EQ_bio，mol/L)结果如表3所示。

表3 中国南方某污水处理厂出水雌激素受体干扰效应检测结果(mol/L)

水样E2-EQ_bioOHT-EQ_bioA₁5.14×10^-117.41×10^-8A₂3.71×10^-111.14×10^-7B₁1.10×10^-118.83×10^-9C₁9.91×10^-121.53×10^-9C₂9.18×10^-121.76×10^-9D₁6.24×10^-122.22×10^-9D₂3.67×10^-122.51×10^-9

四、利用OHT-EQ_bio对E2-EQ_bio进行修正

(一)修正公式为：

E2-EQ_bio*＝{EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio+[(EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio)^2+4×EC₅₀(E2)×EC₅₀(OHT)×E2-EQ_bio×OHT-EQ_bio]^0.5}/2×EC₅₀(OHT)>

公式12中，E2-EQ_bio为步骤二测试得到的雌二醇当量，OHT-EQ_bio为步骤三测试得到的他莫西芬当量，EC₅₀(OHT)为步骤三中4-羟基他莫西芬的浓度—雌激素受体拮抗效应关系曲线表示的4-羟基他莫西芬的半数效应浓度，EC₅₀(E2)为步骤二中17β-雌二醇的浓度—雌激素效应关系曲线表示的17β-雌二醇的半数效应浓度。

得到7个待测样品A₁、A₂、B₁、C₁、C₂、D₁和D₂排除雌激素受体拮抗物干扰的雌二醇当量E2-EQ_bio*分别为6.04×10^-11、4.93×10^-11、1.22×10^-11、1.01×10^-11、9.42×10^-12、6.54×10^-12、4.00×10^-12mol/L，分别为E2-EQ_bio的1.18、1.33、1.10、1.02、1.03、1.05、1.09倍。

对于E2-EQ与OHT-EQ之比较低的样品点(A₂)，修正前和修正后的雌二醇当量值有20％以上差异。

综上所述，雌激素受体拮抗物的存在可能使双杂交酵母测试方法低估其测得的样品雌激素类物质的水平，说明此计算修正方法在混合物毒性评价和风险评估上是必要的。

该方法适用于E2-EQ_bio和OHT-EQ_bio的比值≥1.57×10^-5的情况。