一种高产、持久穗瘟抗性水稻的育种方法

摘要

本发明公开了一种高产、持久穗瘟抗性水稻的育种方法，包括：亲本选择：对水稻材料进行稻瘟病抗性基因的鉴定，根据以下原则组配优势组合：至少有一个亲本含有累计推广面积在500万亩以上主推品种的亲缘；符合抗稻瘟病多基因聚合模式“Pita+Pib+Pi54+Pb1”，抗性基因互补；适度拓宽双亲遗传距离，使F1产量超亲优势在8％‑15％，F1的株高和播始历期超中亲优势均小于3％；根据育种目标，进行聚合育种，获得高产和持久穗瘟抗性水稻品种；育种目标至少包括高产、聚合“Pita+Pib+Pi54+Pb1”和抗穗颈瘟。利用本发明方法选育的品系在产量和抗性得到较好的协调，在穗瘟的抗谱及持久抗性水平得到了显著提高。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻育种，尤其涉及一种高产、持久穗瘟抗性水稻的育种方法。

背景技术

稻瘟病是全世界公认的影响水稻生产的三大病害之一，是限制水稻高产稳产和稻米品质的重要因子，尤以穗颈瘟危害为重。稻瘟病的发生具有间歇性和突发性的特点，我国每7-10年就会发生一次规模较大的稻瘟病灾害，受害面积高达300-600万公顷，稻谷损失在70-125万吨。随着稻草全量(半量)还田技术的推广，稻田微生态环境中病原菌基数加大，增加该病害暴发的频率；感病品种在生产上推广应用，存在着灾害性隐患。

培育和推广抗稻瘟病育种的高产品种，是解决稻瘟病最有效最经济的途径，已成共识。然而，高产抗稻瘟病育种进展缓慢。据国家水稻数据中心显示：2011-2014年期间，国家审定共水稻品种162个，但达到抗性以上的品种仅6个，仅占3.70％；在江苏省2010-2015年三批主推品种目录中共46品种，其中达中抗以上仅5个，仅占10.8％。

关于抗稻瘟病育种的难度，主要原因：①稻瘟病的生理小种复杂且变异程度高。根据江苏省农科院植保所2011-2014年监测，与(2001-2010年)监测结果相比，江苏省水稻稻瘟病菌优势小种虽仍为ZG，但次优势小种由ZB演化成ZC；且稻瘟病菌毒力发生变化，病菌与主栽品种之间具有较高的亲和性，大多品种推广3-5年后，抗性将丧失或退化。②强抗性与高产存在一定的矛盾。据有关文献研究表明：抗病机制的运行，是要消耗一定的能量(ATP)，即高抗(多抗)品种往往与其产量有一定程度的负相关。③稻瘟病鉴定难度大，易受温度、湿度等环境因子影响。

因此，抗稻瘟病与高产的结合，是培育具有突破性品种的关键。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种高产、持久穗瘟抗性水稻的育种方法，利用本发明方法选育的品系在产量和抗性得到较好的协调，对穗瘟的广谱及持久抗性水平却得到了显著提高。

技术方案：一种高产、持久穗瘟抗性水稻的育种方法，包括：

(1)亲本选择：对水稻材料进行稻瘟病抗性基因的鉴定，在水稻材料中根据以下配组原则组配优势组合：

至少有一个亲本含有累计推广面积在500万亩以上的主推品种的亲缘；

符合抗稻瘟病多基因聚合模式“Pita+Pib+Pi54+Pb1”，抗性基因互补；

根据双亲系谱和形态差异，适度拓宽双亲遗传距离，使F1产量超亲优势在8％-15％，F1的株高和播始历期超中亲优势均小于3％；

(2)根据育种目标，对亲本材料进行聚合育种，获得高产和持久穗瘟抗性水稻品种；所述的育种目标至少包括高产、聚合“Pita+Pib+Pi54+Pb1”和抗穗颈瘟。

本发明通过对不同遗传背景的育种材料进行抗稻瘟基因型分析，在丰富遗传背景的基础上适度拓宽双亲遗传距离增强非F1杂种优势，并可进一步借助抗病基因功能标记辅助选择(MAS)和设施病圃(或病区)鉴定，选育高产持久抗穗瘟水稻品种。利用本发明方法选育的品系在产量和抗性得到较好的协调，对穗瘟的抗谱及持久抗性水平得到了显著提高。

步骤(1)中，符合抗稻瘟病多基因聚合模式“Pita+Pib+Pi54+Pb1”，抗性基因互补，即父本和母本杂交后的配子含有Pi54、Pita、Pib和Pb1基因。

具体的，步骤(1)中，其中一个亲本含抗性基因Pib、Pb1和Pi54，另一个亲本含抗性基因Pita、Pib和Pi54。但是并不局限于本发明所列举的组配方式，只要父本和母本杂交后的配子含有Pi54、Pita、Pib和Pb1基因就可实施。

优选的，亲本中，母本为镇稻18号，父本为镇稻16号。两者具有优良的遗传背景，以镇稻18号和镇稻16号为亲本，可选育出高产、持久穗瘟抗性水稻镇稻448。

步骤(1)中，稻瘟病抗性基因采用功能标记鉴定；步骤(2)中，聚合育种中采用功能标记辅助选择含稻瘟病抗性基因的水稻植株。功能标记操作简单，准确易行，大幅提高育种效率。

Pi54、Pita、Pib的分子标记可采用文献中所报道的，Pb1的分子标记为包含Pb1基因编码区上游926bp～1085bp的DNA片段。

所述Pb1的分子标记如SEQ ID NO.3所示，或为包含SEQ ID NO.3所示序列的DNA片段。SEQ ID NO：3为本发明引物扩增出的159bp片段，扩增区域为Pb1基因编码区上游926bp～1085bp。

所述Pb1的功能标记正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示

所述Pb1的分子标记的检测方法，包括：

(1)根据所述的稻瘟病抗性基因Pb1功能特异性分子标记的核苷酸序列设计引物；

(2)以被检测水稻的基因组DNA作为模板进行PCR扩增；

(3)判断PCR扩增产物中是否存在所述的分子标记。

一种实施方式，所述Pb1的分子标记的引物包括：

正向引物：ATCAACGCTACCTTCCC；

反向引物：GTGCCATCACAATTTCTTC。

采用上述引物时，PCR扩增的体系为：1.5μl基因组DNA，0.5μl 2mM上游引物，0.5μl 2mM下游引物，1.2μl 10×Taq Buffer，0.3μl 1mM dNTP，0.1μl1000U Taq DNA聚合酶，ddH₂O补足至10μl。PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，运行33个循环；最后72℃10min。

F1超亲优势是指杂种(F1)的某一性状平均值减去高值亲本(HP)同一性状平均值所得的差除以高值亲本(HP)，F1超中亲优势是指杂种(F1)的某一性状平均值减去双亲同一性状平均值(MP)所得的差除以双亲均值(MP)，均以百分比表示；本申请中，F1产量超亲优势在8％-15％，进一步为9-11％，常规稻选育主要利用加性效应，增幅过大，往往是是显性效应和上位性效应(常规稻选育难以利用的效应)；同时，F1的株高和播始历期(播种期至始穗期相隔天数)超中亲优势均小于3％。

步骤(2)为：根据育种目标，亲本材料进行杂交，杂交后代筛选出含“Pita+Pib+Pi54+Pb1”、农艺性状优良的个体连续自交，直至抗性基因纯合；对稳定株系进行田间穗瘟病抗性评价和综合农艺性状评价，筛选出聚合“Pita+Pib+Pi54+Pb1”且农艺性状优良的水稻株系；所述的育种目标至少包括高产、聚合“Pita+Pib+Pi54+Pb1”和抗穗颈瘟。

田间穗瘟病抗性评价包括：通过在高氮肥高湿度(每亩施用纯氮22Kg、RH>80％)设有诱发品种的设施病圃，采用稻瘟病不同生理小种的混合液于孕穗期(具体可以为抽穗前3-4天)进行穗瘟的人工接种鉴定，混合液中，品种目标区域的优势小种和次优势小种占比为70～80％；或/和不同生态区稻瘟病重发区的自然诱发鉴定。

综合农艺性状评价包括：根据高产、优质、抗倒等育种目标，当选综合农艺性状突出的个体。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1.多基因聚合“Pita+Pib+Pi54+Pb1”，较好地应对生理小种复杂且变异程度高的现象。Pi54非专化性基因，是激活了水稻的复杂防卫机制，可以较有效解决生理小种复杂且变异程度高的问题，延长抗性使用品种使用年限。申请人对具有不同抗性基因的参试品种对江苏不同生理小种的抗性等级分析，结果表明： Pita与种群B和C的抗性等级呈显著负相关(抗)；Pib对种群D、E、F的抗性等级呈显著负相关(抗)。Pi54+Pita+Pib较好地结合植物体的水平抗性和垂直抗性。

2.穗期抗病基因Pb1的利用，较好地协调高产与抗病的矛盾。在植物病害系统中，病原菌往往通过产生效应子克服寄主植物防卫反应，而植物进化(生产)出相应的识别受体R蛋白，来识别和防御这些效应子而启动特异性的防卫反应(垂直抗性)。所以，抗病机制的运行，是要消耗一定的能量(ATP)，即高抗(多抗)品种往往与其产量有一定负相关。抗病基因Pb1非组成型表达，仅在穗期以后(产量形成最为关键时期)增强表达，是一个“节能型”抗性基因，有利于高产与抗性的结合。此外，Pb1基因来源于抗源Modan，在日本成功应用了30多年，未出现抗性退化，是持久抗穗瘟基因。

3.丰富的遗传背景，是实现高产高抗的遗传基础。亲本中含有推广面积在500万亩以上的主推品种的亲缘，育种的品种的基因组可能存在着主要病害的复杂防卫机制的遗传背景，延长抗性基因的使用年限；在此基础适度拓宽双亲的遗传距离，增强杂种优势，保障抗性能量(ATP)消耗，实现高产与高抗有机结合。

4.关于Pb1分子标记。现有技术中，日本研究者已经开发了与Pb1连锁的RFLP标记。但存在三个不足：①实验操作繁琐，检测效率低。由于RFLP标记需要用限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA片段、转移滤膜及用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段等步骤，实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种。②选择有误差，准确率不高。由于此标记位于抗性基因Pb1的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，在减数分裂过程中选择标记与目标基因可能发生交换，容易出现错选的情况，选择准确率不高。③连锁标记应用有局限性。连锁标记可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中选择，需对亲本的多态性进行检测；限制了标记在非多态群体的使用。在随后利用抗性基因Pb1的研究，也有报道SSR标记RM26998作为连锁标记，虽实验操作简便，但选择效率不高和应用局限性仍未得到解决。

本发明分子标记可特异性检测Pb1基因。因Pb1基因位于一个以60-kb为单位的串联重复序列中，Pb1与抗病基因P5紧密连锁，且Pb1基因与P5基因编码的蛋白只有一个谷氨酸的差异，而Pb1发挥功能取决于基因编码区上游1-2056bp序列，申请人发现P5和Pb1含1-1016bp序列，而Nip(感病品种日本晴，无Pb1基因)无；Pb1和Nip均含1017-2056bp序列，而P5无，因此在Nip和P5序列的边界处设计引物，可特异扩增Pb1片段，检测的准确性高。本发明设计的引物特异性好，采用该引物扩增出的SEQ ID NO：3所示分子标记片段大 小为159bp，可直接用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标条带，成本低，操作简便，适合于大规模的分子育种。

5、采用分子标记辅助选择，可提高育种效率。

附图说明

图1为Pb1与P5基因编码区上游1-1016bp序列比对(框代表后引物位置)；

图2为Pb1基因编码区上游1017-2056bp与对应的Nip基因组序列比对(框代表前引物位置)；

图3为镇稻88系谱图；

图4为镇稻11号、15号、18号系谱图；

图5为江苏省审定品种中Pb1基因检测电泳图；

图6为镇稻448系谱图(高产高抗稻瘟病新品系镇稻448系谱图)，备注：a为推广面积500万亩以上的品种，b为超级稻，c为正在扩大推广品种，1为日本亲缘，2为太湖流域亲缘，3为杭嘉糊亲缘，4、东北稻亲缘，5为籼稻交后代。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

实施例1抗穗瘟基因Pb1的功能标记的开发

一、引物设计

Pb1基因：genebank登录号为AB570371.1；P5基因：genebank登录号AB570370.1。

Pb1位于一个以60kb为单位的串联重复序列中，且Pb1位于第二个重复序列中，与第一个重复序列中的P5相对应。P5编码的蛋白只比Pb1多了一个谷氨酸，Pb1与P5都具有穗瘟抗性，但Pb1抗穗瘟能力显著高于P5，两个基因抗穗瘟的差异并不是这个谷氨酸的差异造成的，而是Pb1的基因表达水平明显高于P5。通过比对Pb1与P5基因编码区上游启动子区发现，基因编码区上游1016bp的启动子序列完全匹配(图1)，而感病品种(以Nip即日本晴为例)不含这段序列；基因编码区上游1017bp-2056bp处，Pb1与Nip序列大部分匹配(图2)，而P5不含这段序列。1-1016bp和1017-2056bp序列同时存在，Pb1才能发挥功能。因此，我们将前引物SEQ ID NO：1设计在1017-2056bp之间，后引物SEQ ID NO：2设计在1-1016bp之间，能够特异检测Pb1基因。

正向引物(即前引物)：ATCAACGCTACCTTCCC

反向引物(即后引物)：GTGCCATCACAATTTCTTC

二、Pb1检测的实验流程

对江苏省审定品种中镇稻88、镇稻11号、武育粳23、镇稻15号、宁9108、镇稻19号、镇稻18号、镇稻14号进行检测。

步骤一、DNA提取(SDS法)：

1、将2cm长的叶片剪碎置2ml的离心管中，加上钢珠，然后放入装液氮的保温瓶中速冻，快速捞取放在48孔模具上，盖好盖子置于磨样机上震动30s，取下离心管，倒出钢珠。

2、在含有液氮磨碎的叶片的2ml离心管中，加入SDS(0.1M Tris-Hcl,PH 8.0；0.025M EDTA,PH 8.0；29.25g/l Nacl；12g/l SDS)600μl，放置65℃水浴锅中，30min。

3、加入150μl KAc(PH 4.8)，放置-20℃冰箱，30min。

4、加入与SDS等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24：1)溶液，放置振荡器充分摇匀，20min。

5、离心，12000rpm，4min，转移200μl上清液置1.5ml离心管中。

6、在上清液中加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，置于-20℃冰箱，20min。

7、离心，12000rpm，4min，弃上清，风干，加入200μl ddH₂O溶解，此为DNA母液。

8、将母液稀释10倍即为DNA工作液。

9、取1.5μl用于PCR扩增反应。

步骤二、PCR扩增：

PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。

1、反应体系如下：

总体积：10μl。DNA 1.5μl；2mM SEQ ID NO：1上游引物0.5μl；2mM SEQ ID NO：2下游引物0.5μl；10×Taq Buffer(GENERAY，捷瑞公司)1.2μl，1mM dNTP 0.3μl，1000U Taq DNA聚合酶(GENERAY)0.1μl，加ddH₂O补足至10μl。

2、PCR的扩增程序如下：

步骤三、PCR产物检测：

用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，取扩增好的PCR产物2μl，以DNA Marker(100bp-ⅠDNA ladder)作为分子量对照，在240V恒压下电泳1小时。银染显示DNA条带，通过比对DNA Marker找到目标条带，根据片段大小判断抗感基因：用引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2检测，159bp为含Pb1，不 含Pb1则扩增不出条带。

结果如图5，样品顺序(从左到右)为：镇稻88、镇稻11号、武育粳23、镇稻15号、宁9108、镇稻19号、镇稻18号、镇稻14号，M代表Marker。在这8个水稻品种中，镇稻88、镇稻11号、镇稻15号和镇稻18号检测到Pb1基因，其余水稻品种未检测到Pb1基因。

三、江苏省审定品种Pb1基因检测

Pb1基因来自籼稻品种Modan，而镇稻88由Modan衍生而来(图3)，镇稻88田间穗瘟抗性好，通过Pb1基因的功能标记检测发现其含有Pb1。而镇稻11号、15号、18号皆由镇稻88衍生而来(图4)，这三个品种也检测到了Pb1基因，与其田间抗穗瘟表型相一致。

实施例2Pi54、Pita、Pib功能标记及引物

Pita、Pib、Pi54功能标记及引物均采用现有技术中已经公开的分子标记及引物序列(表1)。利用Pi-ta引物检测到1042bp片段，同时Npi-ta引物扩增不出目的片段，这样的材料含有Pita基因；利用Pi-b引物检测到365bp片段，同时Npi-b引物扩增不出目的片段，这样的材料含有Pib基因，而Pib不能扩增出目的片段，但是Npi-b引物扩增803bp片段，携带感病基因；抗病基因Pi54功能标记为共显性标记，扩增片段216bp(抗)/359bp(感)。

表1引用的功能标记引物及其扩增片段

抗性基因Pita、Pib、Pi54检测的实验流程按照参考文献(范方军，王芳权，刘永峰，等.Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54对水稻穗颈瘟的抗性评价[J].华北农学报，2014，29(3):221-226)，略作修改：Pita、Pib基因的两对标记的扩增程序中，72℃延伸用的是1min，Pita是用4％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

实施例3镇稻448的选育

以江苏丘陵地区镇江农业科学研究所培育的迟熟中粳新品系镇稻448为例：

亲本的选择：采用实施例1的分子标记对现有的一些水稻材料进行检测，确定水稻稻瘟病抗性基因类型，最终选择携带抗性基因Pib、Pb1和Pi54的镇稻18号以及携带抗性基因Pita、Pib和Pi54的镇稻16号作为亲本。

1.选育经过：

1)、2009年正季，以镇稻18号(抗性基因Pib+Pb1+Pi54)为母本，以镇稻16号(抗性基因Pita+Pib+Pi54)做父本，得F₀种子34粒；

2)、2009年冬在海南种植F₁>

3)、2010年正季种植F2代1206株，根据丰产性(单株产量在>35克)、熟期(抽穗期在8月22日至8月28日)、外观品质(垩白率<25％)性状进行初筛，利用抗稻瘟病基因Pita、Pb1功能标记检测，当选含Pita+Pb1迟熟中粳15株；

4)、2011年正季种植F3代15个株系，当选5个株系，共获含Pita+Pb1基因11株；

5)、2011年冬在海南种植F4代11个株系，当选8个含Pita+Pb1基因株系，按株系混收；

6)、2011年在句容种植F5代8个株系，当选3个含Pita+Pb1基因株系共10株，此时四个抗性基因已经纯合；

7)、2013年在句容种植F6代10个株系，同时在高氮肥(每亩施用纯氮22Kg)、高湿度水平(RH>80％)下进行人工接种穗颈瘟鉴定和产量鉴定试验，选留2个表现为抗穗颈瘟和抗倒伏株系；人工接种穗颈瘟于孕穗期(具体为抽穗期3-5天)用注射器注射1mL孢子悬浮液；孢子悬浮液在已配成10×10倍显微镜下每视野30-40个孢子的生理小种，按生理小种体积比(ZG₁:ZB₂₇:ZC₁₅:ZD₇:ZE₃:ZF₁＝40:20:15:9:8:8)混合而成。

8)、2014年在句容进行品比试验，表现优质高产、尤抗穗颈瘟，上年代号6448，暂定名镇稻448(含抗性基因Pita+Pib+Pb1+Pi54)。

2.特征特性

对镇稻448的特征特性如稻瘟病抗性、农艺性状进行鉴定，鉴定为本领域通用方法。

1)稻瘟病抗性突出，综合抗性好。

镇稻448参加江苏省迟熟中粳预试，抗性表现突出；据江苏省植保所抗性鉴定表明：该品系对六个稻瘟病生理小种ZB₂₇、ZC₁₅、ZD₇、ZE₃、ZF₁、ZG₁分>

2)穗粒结构协调，产量潜力大。

镇稻448在江苏省2015年迟熟中粳预备试验中，平均产量折合亩产723.2kg，产量变幅为669.0-771.0kg，较对照(武运粳24号)增产6.68％。每亩有效穗22.8万，每穗总粒数133.8粒，结实率97.26％，千粒重31.75克；亩颖花量大，产量潜力大，稳产性好。

3)综合农艺性状突出。

镇稻448全生育期150.6天，比对照短(武运粳24号)1.6天，株高适中(94.0cm左右)，比对照矮1.9cm，株型紧凑，倒性强。稻米品质国标3级。

镇稻448的日产量比母本和父本的分别提高3.37和4.48个百分点，抗性等级比母本和父本的分别提高1.4和0.5个等级。在预试中表现为高产稳产、稻瘟病抗性突出、熟期早、耐肥抗倒，进入江苏省2016年迟熟中粳区试。

表2镇稻448与亲本镇稻18号、镇稻16号的主要农艺的比较(2015，江苏句容)

3.优异特性的成因分析。

1)镇稻448具有丰富的遗传背景。融合了大面积500万亩以上主推品种武运粳7号、武育粳3号、镇稻88和武粳15的遗传背景，具有日本亲缘、太湖流域亲缘、杭嘉湖亲缘、东北稻亲缘和籼稻亲缘，具有丰富的遗传背景(图6)，为聚合高产稳产高抗稻瘟病奠定了丰富的遗传基础。F1产量超亲优势在9.6％，F1的株高和播始历期超中亲优势分别为2.5％和-1.3％。

2)“Pita+Pib+Pi54”多基因聚合，实现不同抗病防御机制的有机结合。Pi54为非专化性基因，是激活了水稻的复杂防卫机制；Pita和Pib是完全抗性基因，Pi54+Pita+Pib的组合，产生基因的加性效应，拓宽了抗谱；穗期开始启动的部分 抗性基因Pb1，在水稻抗性脆弱时期也是产量形成的关键时期，起到阶段性加强抗性的作用，大大降低了感病的风险。

3)“节能型”持久抗性基因Pb1的利用，有利于高产与抗性的结合。抗病机制的运行，是要消耗一定的能量(ATP)，即高抗(多抗)品种往往与其产量有一定负相关。Pb1基因来源于抗源Modan，在日本成功应用了30多年，未出现抗性退化；其表达量仅在抽穗期始逐步加大，保障水稻在抗性脆弱时期即产量形成的关键时期对病原菌提高抗性，而在其它非关键时期不表达，减少能量消耗，有利于高产与抗性的结合。