梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记及应用

摘要

本发明属于梨分子育种领域，提供了一种梨果实单果重主效QTL位点的分子标记及应用。利用SSR标记构建‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱，结合梨果实单果重表型鉴定，并利用区间作图法进行QTL分析，在联合连锁图的第11连锁群检测到主效QTL位点的存在，该主效QTL位点贡献率为51.9％。与该主效QTL位点紧密连锁的SSR标记为QS1122?135，其遗传距离为4.37cm。本发明所获得的梨果实单果重主效QTL分子标记可用于单果重这一果实性状进行早期选择，对于提高育种效率具有重要的理论和实践指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于梨分子遗传育种领域，具体涉及一种梨果实单果重主效QTL位 点MSF的分子标记及其筛选方法和应用。

背景技术

梨(PyrusL.)是我国重要的经济作物，栽培面积和产量均居世界首位。梨 果实的营养价值高，酥脆多汁、酸甜适口，并具有一定的医疗价值，受到广大消 费者的喜爱。单果重是梨果实外观品质的重要因素，果实大或小直接决定了梨品 种的产量和经济效益。因此，梨果实单果重是梨品种主要经济性状之一。培育迎 合不同消费者需求的单果重是梨育种目标之一。

梨是多年生木本植物，世代周期长，结果晚。传统育种中，是利用果实表型 性状对梨基因型进行选择，这种方法不仅受到梨童期的影响，而且易受到外界环 境的左右。随着分子育种技术的发展，通过分子标记构建高密度遗传连锁图谱并 对果实单果重进行QTL(Quantitativetraitloci，数量性状基因座)分析和定位成 为现实，也为提高目标数量性状优良基因选择的准确性和预见性奠定了基础。利 用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间 的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状之 间的关系，可直接确定控制数量性状的位点，开发可应用于分子标记辅助选择育 种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功的应用。

目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，针对病害、生长性状 和果实部分性状QTL定位及分子标记的研究已有报道。但针对梨果实单果重的 QTL定位只限于‘八月红’这一亲本，其实用性仍受限于‘八月红’和‘砀山 酥梨’的F₁杂交群体。因此，开展不同群体遗传连锁图谱构建，并进行梨单果 重的QTL定位是拓宽分子标记应用范围的必要手段。本发明采用‘红茄梨’和 ‘晚秀梨’的杂交后代F₁代群体进行遗传连锁图谱构建和单果重的QTL定位是 单果重分子标记辅助选择育种技术的提高和补充。

发明内容

本发明的目的是提供一种梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记以及 该分子标记的引物对。

本发明的另一目的是提供一种梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记 方法。

本发明的又一目的是提供一种梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记 的筛选方法。

本发明的再一目的是提供梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记在梨 梨分子育种中的应用。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一种梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记QS1122-135，该分子标 记QS1122-135的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQID NO.2所示。

上述的分子标记QS1122-135是以梨品种晚秀梨的基因组DNA为底物进行 PCR扩增所得的长度为135bp的DNA片段，该分子标记QS1122-135与MSF之 间的遗传距离为4.37cm。

一种梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记QS1122-135的引物对， 所述引物对的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2 所示。

一种鉴定梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记方法，所述方法是以 梨基因组DNA作为模板，用上述分子标记QS1122-135的引物对为引物进行PCR 扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出长度为135bp的DNA片段，则标志梨 果实单果重主效QTL位点MSF存在。

一种梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记QS1122-135的筛选方法， 包括以下步骤：

(1)利用梨品种‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交，获得F₁代群体单株；

(2)利用SSR分子标记方法分析两个亲本及其F₁群体，统计分析在亲本间 具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，获得多态性标记位点，然后对其进 行连锁分析，构建‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱，其中对多态性标 记位点进行连锁分析时采用Jionmap4.0作图软件；

(3)对‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交后代的F₁群体单株的果实单果重进行测定， 利用MapQTL5.0作图软件的区间作图法(MapQTL5.0作图软件)，将F₁群体每 个单株的单果重与步骤(2)构建的‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱 中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值≥3为标准，大于3说明存在一 个QTL位点，在‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱的第11连锁群上检 测到单果重的QTL位点MSF，其LOD值为8.78，贡献率为51.9％，是主效QTL；

(4)根据步骤(3)得到的主效QTL位点所在区域，选择与其连锁距离小 于5cm的SSR分子标记，其中分子标记QS1122-135能对F₁群体果实单果重性 状进行良好的分型，因此，本发明选择QS1122-135作为梨果实单果重主效QTL 位点MSF的分子标记。所述分子标记QS1122-135的长度为135bp，与MSF之 间的遗传距离为4.37cm，该分子标记可以作为梨果实单果重的标记；所述分子 标记QS1122-135的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQID NO.2所示。

根据上述的梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记QS1122-135的筛 选方法，所述主效QTL位点MSF位于‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传图谱的 第11连锁群上，该位点贡献率为51.9％。

上述的梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记QS1122-135在梨分子 育种中的应用。

上述的梨果实单果重主效QTL位点MSF的分子标记QS1122-135的筛选方 法在梨分子育种中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用的两个亲本‘红茄梨’和‘晚秀梨’果实单果性状差异大， ‘红茄梨’平均单果重200g，‘晚秀梨’平均单果重400g左右，其杂交后代果 实单果重性状进行了很好的分离，因此，可确保梨果实单果重性状QTL位点检 测的准确性和可重复性。

(2)本发明采用了SSR标记方法进行梨果实单果重性状QTL定位和连锁 标记的筛选，SSR标记在分子标记辅助育种中操作更为简便、重复性更好、技术 要求低、准确度高，是共显性和锚定标记，更加容易在分子标记辅助育种中应用。

(3)本发明中确定了‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交群体F₁代单株梨果实单 果重的主效QTL位点，对该数量性状贡献率较高，位点的贡献率为51.9％，因 此，基于此位点筛选连锁分子标记对单果重判断的准确性较好，尤其在单果重极 大与极小之间鉴别准确性较高。

(4)目前普遍认可的应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需 ≤5.0cm，本发明的分子标记QS1122-135与主效QTL位点之间的遗传距离为 4.37cm，连锁很紧密，有效提高了利用分子标记选择梨果实单果重主效QTL位 点的准确性和梨大果型品种的选育效率，因此，本发明开发的梨果实单果重主效 QTL位点及分子标记具有良好的应用价值，可加快对梨果实单果重性状的改良。

附图说明

图1为梨单果重QTL位点MSF在‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱第 11连锁群上的位置。

其中，LG代表的是连锁群，LG后的数字代表的是连锁群数；连锁群上左 侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cm，右侧表示的是SSR分子标记的名 称；连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间MSF。

图2为分子标记QS1122-135的引物对对‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交群体F₁代 PCR扩增的电泳检测图。其中，箭头所指的条带即QS1122-135，子代能扩增出 此条带的表现为大果。

图3为分子标记QS1122-135在‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交F₁代群体果 实单果重的性状的分型效果(图中每一个竖条带表示1株F₁代单株，竖条带从 左到右依次表示果实单果重从小到大排列的F₁代单株)。其中，黑色竖条带表示 无135bp扩增条带的F₁单株；白色竖条带表示有135bp条带的F₁单株；两条黑 色竖线中间的竖条带表示单果重居中类型的F₁代单株。

具体实施方式

实施例1：梨果实单果重主效QTL位点MSF及其分子标记QS1122-135的 获得

(1)利用两个梨品种‘红茄梨’(母本)和‘晚秀梨’(父本)杂交组合， 获得81株F₁群体；

(2)用SSR分子标记方法分析两个亲本及其F₁群体，统计分析在亲本间具 有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，最终获得了207个多态性标记位点。 然后利用Jionmap4.0作图软件对多态性标记位点进行连锁分析，构建了一张包 含187个SSR标记的‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱。其中，SSR 标记的试验操作程序参考YomamotoT.等(Euphytica,2002,124:129-137)的方法， 所用引物由金唯智生物科技公司合成。SSR标记用8％聚丙烯酰胺强碱银染法检 测。

(3)将F₁群体各个标记的分离类型按照“CP”模式转化成lm×ll、nn×np、 hk×hk、ef×eg、ab×cd5种分离类型，无扩增条带或扩增不清晰的标记记为“-”， 统计符合SSR标记在F₁作图群体中的分离数据，经卡方检验，暂时先去除偏分 离标记，选取LOD＝4.0-10.0，最大重组率r＝0.4，以Kosambi作图函数构建遗传 连锁图谱，然后把偏分离的标记逐一插入到图谱中，不改变其它标记的位置关系， 否则去除。用MapChart2.0软件绘制最终的连锁遗传图谱。

(4)在果实成熟期，测定‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交后代F₁代果实单果重。 根据整理调查的果实单果重数据，使用MapQTL5.0软件通过置换检验 (PermutationTest)(次数>1000)确定阈值，采用区间作图(IntervalMapping) 检测出LOD峰值的标记位点。

(5)结果表明，在‘红茄梨’和‘晚秀梨’联合遗传连锁图谱的第11连锁群上 检测到单果重的QTL位点MSF(图1)，LOD值为8.78，贡献率为51.90％。该 QTL位点为主效QTL。

其中，SSR分子标记方法为：

以梨基因组DNA为模板，以分子标记QS1122-135的引物对为引物进行PCR 扩增，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，能扩增出长度为135bp的一 个条带，表明与QTL位点MSF相连锁的分子标记存在，MSF与分子标记 QS1122-135之间的连锁距离为4.37cm。

所述分子标记QS1122-135的引物对的正向引物序列(SEQIDNO.1)为： CGCCTTCTCGATCTCTTC；反向引物序列(SEQIDNO.2)为： CGGTTGCCAGATTCCATA；

具体的PCR扩增体系为(20μL)：10×Buffer(Mg²⁺plus)2μL，2.5mmol/LdNTP 1.6μL，10mmol/L正向引物0.6μL，10mmol/L反向引物0.6μL，TaqDNA聚合 酶0.5U，DNA模板50ng，双蒸水补加至总体积为20μL。

PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。

实施例2：本发明的分子标记QS1122-135在梨分子育种中应用试验

(1)以‘红茄梨’为母本，‘晚秀梨’为父本构建F₁代杂交群体，获得81 株F₁群体单株；

(2)对所获得的81株F₁单株进行QS1122-135标记检测，具体方法为：以 梨基因组DNA为模板，以分子标记QS1122-135的引物对为引物进行PCR扩增， 扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(结果如图2)；电泳后根据分子标记 QS1122-135的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在标记，说明该单株果 实单果重高，不存在说明低，同时用实际测得的果实单果重结果与分子标记检测 结果相验证。

其中，所述分子标记QS1122-135的引物对的正向引物序列(SEQIDNO.1) 为：CGCCTTCTCGATCTCTTC；反向引物序列(SEQIDNO.2)为： CGGTTGCCAGATTCCATA；

PCR扩增体系为(20μL)：10×Buffer(Mg²⁺plus)2μL，2.5mmol/LdNTP1.6μL， 10mmol/L正向引物0.6μL，10mmol/L反向引物0.6μL，TaqDNA聚合酶0.5U， DNA模板50ng，双蒸水补加至总体积为20μL；

PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。

结果显示：在‘红茄梨’和‘晚秀梨’杂交得到的81株F₁群体中，单果重在 45-175克的30株小果型单株中除5株的DNA扩增结果检测到长度为135bp的 扩增条带(QS1122-135)外，其它25株单株均未检测到该条带；单果重在242-584 克的29株大果型单株中除5株未检测到长度为135bp的扩增条带(QS1122-135) 外，其它24株单株均检测到该条带，检测正确率达到83.3％，因此，检出准确 率较高。由此可以看出，用分子标记QS1122-135预测梨果实单果重具有较好的 预测效果。