杀虫晶体蛋白、核酸、杀虫晶体蛋白的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及杀虫晶体蛋白领域，特别涉及对甜菜夜蛾、水稻二化螟、亚洲玉米螟和小菜蛾有杀虫活性的Cry2类杀虫晶体蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及杀虫晶体蛋白领域，特别涉及对鳞翅目有杀虫活性的Cry2类杀虫晶体蛋白。

背景技术

到目前为止，已经发现了约600种的杀虫晶体蛋白，这些杀虫晶体蛋白主要来源于苏云金芽孢杆(Bacillusthuringiensis)。其对9个目500多种昆虫以及线虫、螨类和多种原生动物具有杀虫活性。由于Bt杀虫活性广泛并且与化学农药相比专一性高、安全性好、防治效果好、不污染环境等优点，已经成为目前世界上研究最多，应用最广、最成功的昆虫病原微生物，Bt杀虫剂占生物农药的70％以上，并已经应用于转基因植物，为人类带来很好的经济和生态效益，对其研究还在不断扩展和深入。

但是杀虫晶体蛋白的专一性强的特点是一把双刃剑。一方面其专一性强，意味着其对除目标害虫以外的生物，特别是人畜安全；但是另一方面也使得其杀虫谱过窄，对于多种害虫的综合防治来说，需要开发出针对不同害虫有效的杀虫晶体蛋白才能达到防治的目的。

然而，现有技术中仅发现苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白(Vip蛋白，一种不同于杀虫晶体蛋白的蛋白)对甜菜夜蛾有较好的活性，而在杀虫晶体蛋白中至今还未发现能够对甜菜夜蛾等具有较好活性的蛋白。

因此，有必要从已知或新分离的苏云金芽孢杆菌菌株中寻找能够对甜菜夜蛾等有较好的活性杀虫晶体蛋白。

发明内容

本发明之一提供了一种杀虫晶体蛋白，其为Cry2类蛋白，所述Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。

其中，由于氨基酸序列与杀虫活性之间并不是简单的一一对应关系，有的氨基酸序列高度同源但杀虫活性却有很大的不同。随着新基因的不断发现，一种基因具有两种或多种活性的情况不断被发现，为了避免杀虫谱和氨基酸序列的不一致性，Crickmore等提出了一种根据氨基酸序列同源性进行分类，形成了一个开放式分类系统，共分为四级，杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性小于45％为第一等级；在45％-78％之间为第二等级；在78％-95％之间为第三等级；同源性在95％以上为第四等级。其中第一、第四等级用阿拉伯数表示；第二、第三等级分别用大、小写英文字母表示。只要是来自Bt的伴胞晶体蛋白(又称为杀虫晶体蛋白)，对目标生物具有毒性，或与已知的Cry或Cyt蛋白具有很高同源性，就可以纳入这一分类系统。按照Crickmore等提出的基因分类系统，Cry蛋白约70类，本发明的Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1之间的同源性在45％-78％之间。

现有研究证实，杀虫晶体蛋白原毒素大小约130kDa，但其在130kDa大小的状态下并没有杀虫活性，而是必须经过蛋白酶等作用的切割，切割得到约52-68kDa的蛋白后才能够发挥其活性。其中，所述的切割可以一般发生在有害生物的肠道之内，但也可以人为地有目的地改造为具有相同功能的52-68kDa的蛋白。

因此，在一个具体实施例中，所述杀虫晶体蛋白为利用胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种之后获得的52-68kDa的蛋白；优选所述杀虫晶体蛋白为利用胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶消化所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种之后获得的55-65kDa的蛋白；特别优选所述52-68kDa的蛋白或所述55-65kDa的蛋白与Cry2类蛋白具有相同的功能。在此所述的Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，所述Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。其中，例如与杀虫蛋白Cry2Aa9、Cry2Ab4或Cry2Ah1的相同的功能可以为在防治甜菜夜蛾和/或水稻二化螟中的应用；与杀虫蛋白Cry2Aa17、Cry2Ab29、或Cry2Ba2的相同的功能可以为在防治甜菜夜蛾、亚洲玉米螟和小菜蛾中的应用。

在一个具体实施例中，所述杀虫晶体蛋白为所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸的与所述Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种具有相同功能的蛋白；

优选所述杀虫晶体蛋白为mCry2Aa17，所述mCry2Aa17的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。

本发明之二提供了一种能够翻译为如上的本发明所述的杀虫晶体蛋白的核酸。

在一个具体实施例中，能够翻译为所述Cry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.8所示，能够翻译为所述Cry2Ab29的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.9所示，能够翻译为所述Cry2Ba2的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.10所示，能够翻译为所述Cry2Aa9的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.11所示，能够翻译为所述Cry2Ab4的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.12所示，和能够翻译为所述Cry2Ah1的氨基酸序列的核酸序列如SEQIDNo.13所示，能够翻译为所述mCry2Aa17的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.14所示。这些基因的序列可以从Bt菌株中克隆出来，也可以人工合成。

本发明之三提供了一种制备如上的本发明所述的杀虫晶体蛋白的方法，其包括如下步骤：在活体生物中表达上述杀虫晶体蛋白；优选在含有如上的本发明所述的核酸序列的活体生物中表达所述杀虫晶体蛋白。

本发明之四提供了一种制备杀虫晶体蛋白的方法，其包括如下步骤：在16-20℃下表达杀虫晶体蛋白。

在一个具体实施例中，所述杀虫晶体蛋白为Cry1-70类蛋白中的至少一种，例如表1中的蛋白中的至少一种；优选为Cry1类蛋白、Cry2类蛋白、Cry3类蛋白和Cry8类蛋白中的至少一种，更优选的为在含有能够翻译为如上的本发明所述的杀虫晶体蛋白的核酸，或更具体的讲在含有SEQIDNo.8、如SEQIDNo.9所示、如SEQIDNo.10所示、如SEQIDNo.11所示、如SEQIDNo.12、如SEQIDNo.13所示和如SEQIDNo.14所示所示核酸的活体生物中表达所述杀虫蛋白。其中Cry1-70类蛋白包括如表1所示的杀虫蛋白模式基因。

表1杀虫蛋白的模式基因

在一个具体实施例中，所述活体生物包括微生物和/或植物。

在一个具体实施例中，所述微生物选自芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种。

在一个具体实施例中，所述芽孢杆菌包括苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacilllussubtilis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)中的至少一种；所述假单胞菌包括荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)；所述肠杆菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)。

在一个具体实施例中，所述微生物为野生微生物和/或遗传工程微生物。

其中，野生微生物是指从自然界中分离出的未经过人工改造的微生物。

遗传工程微生物是指将野生微生物人工改造的微生物。

在一个具体实施例中，含有如上的本发明所述的核酸序列被连接在表达载体上，例如能够在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌中穿梭的pSTK表达载体。

在一个具体实施例中，所述植物选自大葱、甘蓝、大白菜、芹菜、菜花、胡萝卜、芦笋、莴笋、蕹菜、苋菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥兰、番茄、菜心、小白菜、青花菜、菠菜、萝卜和四季豆中的至少一种。

本发明之五提供了一种如上的本发明所述的杀虫晶体蛋白在防治有害生物中的应用，优选所述有害生物为昆虫，更优选所述有害生物为鳞翅目昆虫，最优选所述有害生物为甜菜夜蛾。其中所述的鳞翅目昆虫包括甜菜夜蛾、亚洲玉米螟、小菜蛾和水稻二化螟等。例如杀虫蛋白Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2中的至少一种在防治甜菜夜蛾、亚洲玉米螟和小菜蛾中的应用；杀虫蛋白Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种在防治甜菜夜蛾和/或水稻二化螟中的应用。

具体实施方式

以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。

1)液体LB：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl1％，pH7.0，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。

2)固体LB：在液体LB培养基中加1.3％琼脂，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。

3)牛肉膏蛋白胨培养基：0.3％牛肉膏，0.5％蛋白胨，pH7.2，15磅灭菌15min。用于培养含有杀虫晶体蛋白基因的Bt菌株。

4)BH培养基：脑心浸液肉汤，3.7％，15磅灭菌20min。用于制备Bt感受态。

5)抗生素：氨苄青霉素水溶液100mg/ml，用时稀释500倍-20℃保存。其中pEB质粒载体具有氨苄青霉素抗性。

蛋白电泳检测及定量分析

120V预电泳约10-20min，取蛋白样品40μL，加入10μL5×加样缓冲液，混匀，再将上清和沉淀分别梯度稀释，煮沸5-10min，12000rpm离心5min，取10L上清点样。80V恒压电泳至样品浓缩呈直线，150V恒压电泳至指示的溴酚蓝到达凝胶底部。

脱色：电泳后取出凝胶，电泳后取出凝胶并用蒸馏水冲洗，加入50mL溶液Ⅰ，微波炉中加热30s，60rpm振荡10min。

染色：倒掉溶液I后加入溶液II(每50mL溶液II加200L溶液III)微波炉加热30s，60rpm振荡15min以上。

倒掉溶液II，加入无菌水，凝胶成像系统照相保存。

观察结果，根据蛋白条带着色程度比较目的蛋白表达情况，用凝胶成像系统照相保存。目标蛋白大小与预期蛋白大小基本一致。

蛋白定量分析：

制备以下5种不同浓度梯度的BSA：0.8μg/μL、0.4μg/μL、0.2μg/μL、0.1μg/μL、0.05μg/μL，分别将目标蛋白进行梯度稀释，使其终浓度介于0.8-0.05μg/μL，目标蛋白和5种不同浓度的BSA上样量均为10μL，进行蛋白电泳检测。表2为SDS聚丙烯酰氨凝胶的制备表。

表2SDS聚丙烯酰氨凝胶的制备表

实施例1

1.1cry2Aa17、cry2Ab29、cry2Ba2以及mcry2Aa17的克隆

通过本领域的常规方法，从苏云金芽孢杆菌的野生菌株DS415克隆出cry2Aa17基因，如SEQIDNo.8所示；野生菌株LS5115-3克隆出cry2Ab29基因，如SEQIDNo.9所示；野生菌株HD395克隆出cry2Ba2基因，如SEQIDNo.10所示；从苏云金芽孢杆菌的野生菌株克隆出或人工合成cry2Aa9基因，如SEQIDNo.11所示；野生菌株BtB-Pr-88克隆出cry2Ab4基因，如SEQIDNo.12所示；野生菌株BtSC6H8克隆出cry2Ah1基因，如SEQIDNo.13所示。

对克隆的cry2Aa17基因进行定点突变，获得mcry2Aa17基因，如SEQIDNo.14所示。

将8种cry2类基因：cry2Aa17、mcry2Aa17、cry2Ab29、cry2Ba2、cry2Aa9、cry2Ab4和cry2Ah1分别插入到pEB载体Ecl136II位置，连接反应按照以下连接体系进行，充分混匀后，16℃连接4h。

目的DNA4μl

载体DNA1μl

SolutionI5μl

1.2大肠杆菌热激转化

将连接产物10μL加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上，冰浴3min，加入800μLLB液体培养基，150rpm/min、37℃培养1h，取200μL涂布于含有氨苄抗生素的LB固体平板，加入X-gal溶液40μL，IPTG溶液4μL，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选。以载体正向引物pEB_F和克隆基因反向引物cry2_R进行PCR鉴定，筛选出连接方向正确的阳性克隆。

1.3大肠杆菌质粒DNA提取

提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，经PCR鉴定及序列测定，鉴定出正确重组的转化子进行目的蛋白诱导表达。

质粒提取方法具体如下：

(1)挑取阳性转化子于5mLLB液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；

(2)加入250μL含有50mg/mlRNAase的S1溶液悬浮沉淀；

(3)加入250μL细菌裂解液S2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；

(4)加入350μLS3中和液并充分温和地上下翻转6-8次，12000r/min离心10min；

(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，12000r/min离心1min并弃掉滤液；

(6)随后加入500μL洗涤液W1，12000r/min离心1min并弃掉滤液；

(7)随后加入700μLW2，12000r/min离心1min并弃掉滤液，该步骤重复一次；

(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μL预热至65℃的灭菌水，静止1min，12000r/min离心1min，-20℃保存备用。

1.4cry2基因诱导表达

将重组质粒转化通过热激转化的方式导入到大肠杆菌表达宿主Rosetta中，获得含有cry2类杀虫基因的重组菌株V14-F4(cry2Aa17)、V15-A10(mcry2Aa17)、V14-F7(cry2Ab29)、V14-F10(cry2Ba2)、V15-A1(cry2Aa9)、V15-A4(cry2Ab4)和V15-A6(cry2Ah1)。

将上述E.coli的单克隆分别转接于5mL液体LB培养基中(每个样品接种于3管5mL液体LB培养基中)，220rpm、37℃培养12h；按1％的接种量分别转接至含有400mLLB的三角瓶中(每个样品转接至3瓶含有400mLLB的三角瓶中)，220rpm、37℃培养约2.5小时，至OD₆₀₀为0.6；加入IPTG200μL，220rpm,16℃、20℃和30℃(将相同样品的3瓶培养液分别置于此三种温度下)分别培养12小时，诱导蛋白表达。

样品处理：菌液8000rmp离心10min收集菌体；菌体沉淀中加入20mmol/LTris-HCl(pH8.0)，超声波破碎细胞5min(Ampl70％，超声时间3s，超声停止5s)，12000rpm离心15min，将上清转移至一个新的EP管中，沉淀加入20mmol/LTris-HCl(pH8.0)重新悬浮，分别进行蛋白电泳检测定量。

实施例2

杀虫蛋白对亚洲甜菜夜蛾、亚洲玉米螟、小菜蛾和的活性分析

甜菜夜蛾的人工饲料由中国农业科学院植物保护研究所迁飞害虫组提供。

甜菜夜蛾的生测方法：(1)取30g人工饲料置于培养皿中，加入3mL待测样品溶液，充分搅拌均匀，室温放置，根据饲料干湿程度适当室温晾置，直至饲料不能挤出水分；

(2)将全部饲料分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中；

(3)用毛笔轻轻挑取幼虫接于24孔板中，每孔一头小于等于12小时的初孵幼虫；接完后，加盖(内附一层吹塑纸)，并用橡皮筋固定；

(4)放置25℃光照培养箱中培养，光周期为16L:8D，湿度50-75％，每天观察饲料湿度，并做出适当的调整，保持培养箱湿度；

(5)7天后分别调查死、活虫数及活虫的体重，计算抑制率、校正抑制率、死亡率和校正死亡率。

亚洲玉米螟选用初孵幼虫，生测方法参照Heetal进行(HEKL,WANGZY,WENLP,etal.DeterminationofbaselinesusceptibilitytoCry1AbproteinforAsiancornborer(Lep.,Crambidae)[J].AppliedEntomology,2005,129(8):407-412)，并在培养后的调查期间称量活虫的体重。

小菜蛾的人工饲料购于美国SouthlandProductsIncorporated公司，配制方法见说明。

小菜蛾的生测方法：采用人工饲料的方法，人工饲料购于SouthlandProductsIncorporated公司，配制方法见产品说明。称取饲料10g与1mL待测样品稀释液混匀，平均分到3个无菌培养皿中。每个培养皿接2龄幼虫20头，25℃生化培养箱中保温，光周期为16L:8D，湿度50-75％，观察饲料湿度，并做出适当的调整，保持培养箱湿度。培养48h后调查死、活虫数以及活虫的体重，并观察幼虫取食情况。计算抑制率、校正抑制率、死亡率和校正死亡率。水稻二化螟的人工饲料由中国农业科学院植物保护研究所水稻害虫组提供。水稻二化螟的生测方法：

(1)称取15g人工饲料放置于灭菌的培养皿中。

(2)加入待测样品的溶液1.5mL，充分搅拌混匀平均分装于三个培养皿中。

(3)根据饲料的干湿程度室温放置一段时间，直到饲料表面没有水滴。每皿接入20头初孵幼虫，用医用胶带封口，每个浓度重复3次，共处理60头试虫。

(4)将样品置于25℃光照培养箱培养，用黑布遮盖住所有生测样品，不能有光线的进入(水稻二化螟趋光性很强，会咬穿平皿逃逸)，光周期为16L:8D，湿度60％-70％左右，每天观察饲料干湿程度，适当做出微调。

(5)培养6天调查死虫和活虫数以及活虫的体重，计算抑制率、校正抑制率、死亡率和校正死亡率等数据。

其中，校正抑制率(％)＝1-处理组平均体重/对照组平均体重；

校正死亡率(％)＝(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率。

表3杀虫蛋白对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的杀虫活性

表4杀虫蛋白在64μg/ml时对亚洲玉米螟(Ostrinianubilalis)的杀虫活性

蛋白名称表达温度(℃)校正抑制率校正死亡率Cry2Aa172040.9％22.5％mCry2Aa172060.8％50.7％Cry2Ab2920100.0％35.8％Cry2Ba22028.7％36.6％Cry2Ah12087.3％20.0％Cry2Aa92045.8％35.3％Cry2Ab42090.2％45.0％

表5杀虫蛋白在64μg/ml时对小菜蛾(Plutellaxylostella)的杀虫活性

蛋白名称表达温度(℃)校正抑制率校正死亡率Cry2Aa172093.3％62.8％13 -->mCry2Aa172098.9％90.5％Cry2Ab292073.3％50.3％Cry2Ba22027.9％26.1％Cry2Ab42083.1％57.5％

表6杀虫蛋白在64μg/ml时对水稻二化螟(Chilosupperssalis)的杀虫活性

蛋白名称表达温度(℃)校正抑制率校正死亡率Cry2Ah12021.5％18.5％Cry2Aa92025.1％18.5％Cry2Ab42085.4％58.5％