一种核桃举肢蛾性信息素组分

摘要

本发明公开了一种核桃举肢蛾性信息素组分及其提取、鉴定、合成方法，通过田间饲养条件提取核桃举肢蛾性兴奋期雌虫性腺体，从雌虫性腺体中提取性信息素物质，并对其活性成分进行鉴定，再通过催化偶联反应合成性信息素成分，该核桃举肢蛾性信息素组分是反?5?十六碳烯乙酸酯。本发明的信息素成分可溶解于有机溶剂中制成诱芯，用于核桃举肢蛾的发生期监测、预测预报，为核桃举肢蛾适时有效地防治提供科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于昆虫性信息素技术领域，具体的说，是一种核桃举肢蛾性信 息素组分以及该核桃举肢蛾性信息素组分的提取、鉴定与合成。

背景技术

核桃是我国丘陵山区的一种传统的经济林木，2015年1月国务院办公 厅印发了《关于加快木本油料产业发展的意见》，提出加快木本油料产业发 展，切实维护国家粮油安全。核桃作为重要的木本油料，近年来种植面积一 直在飞速发展。核桃举肢蛾AtrijuglanshetaoheiYang是一种专门危害核桃 的蛀果性害虫，分布于北京、河南、河北、陕西、山西、甘肃、四川、贵州、 山东、湖北等地，以幼虫蛀食核桃青皮乃至果仁，受害果逐渐变黑而内陷、 脱落。其危害可造成核桃减产40－50％，仅在陕西商洛地区，2011年的直 接经济损失达8000万元。已成为长期困扰我国核桃产业发展难以解决的一 个重大问题^[1,2]。核桃举肢蛾具有较强隐蔽性的蛀果性害虫，防治难度大； 加之阴坡、阳坡，沟里、沟外等局部物候的差异，核桃举肢蛾发生期不同， 给防治带来了极大困难。随着当前核桃种植面积的快速发展，集约化、规模 化集中连片的栽培模式，核桃举肢蛾的发生必然愈加严重，因此开展核桃举 肢蛾相关研究也迫在眉睫。

目前，全世界已经鉴定和合成的昆虫信息素及其类似物达两千多种，我 国研制成功的农、林、果、蔬等重要害虫的性信息素也有几十种，为研究和 应用性信息素防治害虫创造了条件^[3--7]。但国内外对举肢蛾科Heliodinidae 昆虫性信息素的研究较少，迄今仅报道了少数几种举肢蛾科昆虫的性诱剂， 如柿举肢蛾(Stathmopodamassinissa)性诱剂E4,Z6-16:OH、E4,Z6-16:Ald和 E4,Z6-16:OAc^[8]，黑莓举肢蛾(Schreckensteinafestaliella)性诱剂 E10,E12-16:Ald^[9]，苹举肢蛾(Schreckensteinaauriferella)性诱剂 Z7,E11-16:OAc和Z7-16:OAc^[10]；这些已报道的举肢蛾科昆虫性信息素在结 构上均含多烯烃类化合物。种源相近的同科同属昆虫性信息素具有化学结构 相似，差别往往只是碳链长短、双键位置、末端功能团或活性组分比例不同 的特点。已报道的举肢蛾科昆虫性信息素中均含多烯烃类化合物的特点，对 进一步研究属于同一科的核桃举肢蛾的性信息素具有一定的启发和借鉴作 用。

关于核桃举肢蛾性信息素的研究，王瑞等^[11]利用触角电位技术从80多 种供试标准化合物中发现Z-8-13:OAc、Z-9-16:OAc等8种化合物对核桃举 肢蛾雄虫具有EAG活性。郝兴宇等^[12,13]在此基础上利用扫描电镜确定了核 桃举肢蛾性信息素腺体的部位、表面形态及雄蛾触角感觉器类型。通过GC 分析确定Z-8-13:OH、Z-8-13:OAc、Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc不是核桃举肢 蛾性信息素的有效成分，但气相色谱分析表明其保留时间与核桃举肢蛾性信 息素的有效成分保留时间相近。而且林间试验表明Z-8-13:OH、Z-8-13:OAc、 Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc也具有一定的诱蛾活性，Z-8-13:OAc和Z-9-16:OH 以2:8组合后诱集活性提高。郝兴宇等推断核桃举肢蛾性信息素的活性成分 是与Z-8-13:OAc和Z-9-16OH结构近似的13碳和16碳的不饱和醇或酯组 成的多组分成分。该研究结果为核桃举肢蛾性信息素的进一步鉴定提供了依 据。

综上所述，国内学者虽然对核桃举肢蛾性信息素化合物进行了一定的研 究，但核桃举肢蛾性信息素关键成分尚未确定，生殖行为过程中性信息素的 合成、释放及交配行为的化学通讯联系尚不清楚。急待通过进一步深入研究 明确其性信息素关键化学组成、结构及活性及相关化学通讯，以便为解决严 重困扰当前核桃产业发展的核桃举肢蛾危害问题提供重要的理论与技术支 持。

以下是申请人检索的相关参考文献：

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[13]郝兴宇，张金桐，王瑞等，核桃举肢蛾性诱剂的合成与林间诱蛾活 性试验，山西大学学报(自然科学版)，2008，28(3):303-305。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种核桃举肢蛾性信息素组分，将该核桃举肢 蛾性信息素组分溶解于有机溶剂中制成诱芯，可用于核桃举肢蛾的发生期监 测、预测预报，指导核桃举肢蛾的田间防治。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种核桃举肢蛾性信息素组分，其特征在于，该核桃举肢蛾性信息素组 分为反-5-十六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)。

根据本发明，上述核桃举肢蛾性信息素成分的提取方法，其特征在于， 通过提取田间饲养条件下核桃举肢蛾性兴奋期雌虫的性腺体，从雌性性腺体 提取物质中鉴定得到反-5-十六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)。

根据本发明，上述核桃举肢蛾性信息素成分的合成方法，其特征在于， 采用格式试剂Coupling反应立体选择性化学合成得到反-5-十六碳烯乙酸酯 (E-5-16:OAc)。

根据本发明，制备的核桃举肢蛾性信息素组分溶解于有机溶剂中制成诱 芯，用于核桃举肢蛾的发生期监测、预测预报的应用，为核桃举肢蛾适时有 效地防治提供科学依据。

附图说明

图1是E-7-十六碳烯-1-醇合成路线；

图2是兴奋期核桃举肢蛾雌蛾腹部末端粗提物的GC图；

图3是核桃举肢蛾雄蛾腹部末端粗提物的GC图；

图4是非兴奋期的核桃举肢蛾雌蛾腹部末端粗提物的GC全图；

图5是性兴奋期核桃举肢蛾雌蛾腺体粗提物中RT＝22-29间的部分GC 图；

图6是RT＝26.75峰的质谱特征图；

图7是E-5-16:OAc标品的质谱特征图；

图8是核桃举肢蛾雄虫对部分化合物的触角电位反应值。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明不限于以下的实施例，在本发明给出的范围内，均可以得到核桃 举肢蛾性信息素组分。

实施例1：核桃举肢蛾性信息素候选化合物的合成

申请人所在的课题组从2008年起开始进行核桃举肢蛾性信息素研究，通 过多年的努力，突破了相关化合物难以合成，产率较低的困境，通过Wttig 反应的优化、催化偶联反应(Coupling)的应用合成了多种13、14、16个碳烯 醇化合物并衍生化。如Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc、Z-9-13:OH、Z-9-13:OAc、 Z-8-13:OAc、Z-8-13:OH、E-9-16:OH、E-9-16:OAc、E-7-16:OH、E-7-16:OAc、 E-5-16:OH、E-5-16:OAc等40余种化合物。为核桃举肢蛾性信息素研究相关 化合物的合成、活性化合物鉴定、标准品的获得奠定了良好的基础。

例如采用格式试剂Coupling反应立体选择性合成E-7-十六碳烯-1-醇 (E-7-16:OH)和E-7-十六碳烯-1-醇乙酸酯(E-7-16:OAc)具体方法如下：

从1,5-戊二醇和E-2-十一碳烯-1-醇出发，先将1,5-戊二醇选择性单溴化、 羟基保护，然后与镁反应制备得格式试剂(BrMg(CH₂)₅OTHP)，在四氯合 铜锂(Li₂CuCl₄)催化下通过Coupling反应、水解产物得到核桃举肢蛾性信 息素的候选化合物E-7-十六碳烯-1-醇，合成路线图见图1。

其合成过程为：

1、5-溴-1-戊醇(2a)的制备

在250mL三口烧瓶中依次加入1a(14g，0.135mol)，40％氢溴酸 (28mL，0.2mol)和60mL苯，70～80℃油浴分水回流15h，TLC检测， 原料点消失。依次用5％氢氧化钠溶液，10％盐酸及饱和食盐水洗涤，无 水硫酸钠干燥。粗产物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯，V/V＝8:1)分离， 浓缩得到无色至淡黄色液体2a(20.1g，收率89.1％)。

核磁共振谱、质谱等数据表明得到的化合物为2a。¹HNMR(500MHz， CDCl₃)δ：3.65(t，2H，J＝6.4Hz，CH₂O)，3.43(t，2H，J＝7.2Hz，Br-CH₂)， 2.27(s，1H，OH)，1.28-1.89(m，8H，-(CH₂)₄-)；¹³CNMR(500MHz，CDCl₃) δ：61.99，33.78，32.32，30.94，24.24。

2、Br(CH₂)₅OTHP(3a)的制备

将2a(8.40g，0.05mol)和一粒TsOH溶于10mL二氯甲烷中。冰盐浴 搅拌下，将新蒸的2,3-二氢吡喃(5.04g，0.06mol)滴加到上述体系中，反 应放热，控制混合物温度不超过10℃，滴完后室温反应4h。TLC检测2a 原料点消失，停止反应，加入等体积乙醚稀释，再用2M氢氧化钠水溶液、 饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥。浓缩，粗产物柱层析分离(石油醚：乙 酸乙酯，V/V＝8:1)，得到无色透明液体3a(12.1g)，产率96.1％。

核磁共振谱、质谱等数据表明得到的化合物为3a。¹HNMR(500MHz， CDCl₃)δ：4.79(s，7.1Hz，1H)，3.69-3.18(m，6H)，1.85-1.21(m，12H)； ¹³CNMR(500MHz，CDCl₃)δ：98.52，66.90，61.92，33.41，32.51，30.61， 28.76，25.43，24.89，19.47。

3、BrMg(CH₂)₅OTHP(4a)的制备

将羟基保护的醚3a(1.51g，0.006mol)溶于10mL四氢呋喃。在N₂保 护下，将镁(0.19g，0.008mol)、少量碘甲烷及15mL无水四氢呋喃置于50mL 三颈瓶中，电磁搅拌下，逐滴加入3a的THF溶液。反应引发后在30min内， 小心滴完剩余的3a的THF溶液。继续室温搅拌1h，即得到格氏试剂4a的 THF溶液，性状为灰色液体，氮气下保存，尽快进行下一步反应。

4、E-2-十一碳烯-1-醇乙酸酯(6a)的制备

室温下将5a(1.70g，0.01mol)，2mL无水吡啶，10mL无水乙醚置于25mL 圆底烧瓶中，剧烈搅拌下将重蒸的乙酸酐(1.28g，0.0125mol)的吡啶溶液在 10min内加入上述的反应体系中，常温搅拌约24h，TLC检测。原料点消失 后将混合物倾倒在10mL的冰水中萃灭反应，20mL×3乙醚萃取，将有机相 分别用浓度5％氢氧化钠洗，10％盐酸洗及饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干 燥，减压蒸除溶剂，粗产物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，V/V＝10:1)得 透明油状液体6a(1.96g)，产率92.5％。

核磁共振谱、质谱等数据表明得到的化合物为6a。¹HNMR(500MHz， CDCl₃)δ：5.74-5.56(m，1H)，5.56-5.31(m，1H)，4.38(t，J＝6.8Hz，2H)， 2.14-1.83(m，5H)，1.41-0.99(m，12H)，0.89-0.69(m，3H)；¹³CNMR(500 MHz，CDCl₃)δ：170.33，136.26，123.78，65.04，32.16，31.79，29.35，29.18， 29.08，28.81，22.56，20.67，13.91。

5、E-7-十六碳烯-1-醇(E-7-16:OH)(Ⅰ)的制备

将6a(1.06g，0.005mol)，0.1mL0.1mol.L^-1四氯合铜锂THF溶液，冰盐 浴冷却至-5℃。电磁搅拌，用注射器将上面新制好的4a的THF溶液滴加 到6a和0.5mL0.1mol.L^-1四氯合铜锂THF溶液中，体系红色很快退去，继 续保持0℃左右反应约3h。饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙醚萃取，旋干乙 醚后得到油状物7a。将上述油状物溶于甲醇：水＝10:1组成的30mL混合液 中，加对甲苯磺酸(0.2g)，水浴约68℃搅拌回流反应3h。除去甲醇和水， 残余物溶于乙醚，有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水洗涤， 无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂，粗产物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，V/V＝8:1) 得无色至淡黄色透明油状液体0.85g，产率71％。

核磁共振谱、质谱等数据表明得到的化合物为E-7-十六碳烯-1-醇。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：5.45-5.32(2H，m，CH＝CH)，3.67-3.53(2H，t， CH2OH)，2.17(1H，s，OH)，2.09-1.92(4H，m)，1.64-1.47(2H，m)，1.43-1.16 (18H，br)，0.89(3H，t，J＝6.6Hz)；¹³CNMR(500MHz，CDCl₃)δ：130.5， 130.1，63.4，32.7，32.6，32.5，32.2，31.9，29.6，29.5，29.3，29.2，28.9， 25.6，22.7，14.1。

6、E-7-十六碳烯-1-醇乙酸酯的合成

在室温及搅拌下，将0.7mL乙酸酐及3mL二氯甲烷的混合液缓慢滴加 至由E7-16:OH(0.4g，1.67mmol)、吡啶(2mL)及二氯甲烷(2mL)组成的 混合液中，反应6h后用6mol/L的盐酸酸化(5mL)，经乙醚萃取(2×5mL)、 无水硫酸钠干燥、减压脱溶后得粗产物，用硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯， V/V＝50:1)得无色透明液体E7-16:OAc(0.42g)，收率89％。

产物GC-MS检测分析(色谱条件：初始温度50℃，保留2min，升温 速率为7℃/min，最终温度220℃，保留时间10min)，R.t：20.12min，MS： 282为目标产物。MS:282(M⁺)，222，180，166，152，138，124，109，96， 82，81，67，55，43；¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：5.38-5.36(2H，m，CH＝CH)， 4.09(2H，t，CH₂OH)，2.10-1.99(7H，m)，1.63-0.91(23H，m)；

¹³C-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：171.2，130.4，130.0，64.1，31.9，31.8，30.9， 29.7，29.6，29.6，29.5，29.3，29.0，26.8，25.8，22.3，20.9，13.9。

采用类似的方法，以1,3-丙二醇和E-2-十三-1-醇为原料合成E-5-十六碳 烯-1-醇；以1,6-己二醇和E-2-癸烯-1-醇为原料合成E-8-十六碳烯-1-醇；以 1,7-庚二醇和E-2-壬烯-1-醇为原料合成E-9-十六碳烯-1-醇；以1,7-庚二醇和 (2E,4E)-壬二烯-1-醇为原料合成(9E,11E)-十六碳二烯-1-醇等系列十六 碳烯醇。再按照上述的方法将烯醇进行酯化反应，便可得到相应的十六碳烯 酯化合物。

实施例2：核桃举肢蛾性信息素田间提取条件探索

通过多年研究发现核桃举肢蛾在目前室内饲养条件下不分泌性信息素。 在室内饲养无核桃枝条条件下核桃举肢蛾性无明显性兴奋行为，在有核桃枝 条的条件下有性兴奋行为，但不如野外条件下强烈。而且发现在室内条件下， 虽然有婚飞、尾动等性兴奋行为，但雌雄个体无交配行为。

研究表明核桃举肢蛾只有在田间条件下才分泌性信息素，通过探索建立 了核桃举肢蛾田间饲养、产生性信息素的条件、提取时机及方法。具体方法 如下：

2014年至2015年，每年5月间在西北农林科技大学山阳核桃试验站示 范园内，在林间用4×4×4.5m的纱网罩住一株株高4m的核桃树，四周用竹 竿固定，纱网上面搭上遮阳网。将埋有虫茧的塑料土框放于纱网内，塑料框 上部用纱网罩住，以便于观察，采集羽化的成虫。在纱网内核桃树四周放置 多个0.6×0.6×0.6m养虫笼，同时在林间放置2×2×2m的纱网，将羽化的成虫 放入纱网或养虫笼内用于田间观察实验。

观察发现，核桃举肢蛾求偶及交配行为集中在活动高峰期 (17:30-19:00)。当进行求偶时，雌雄成虫活跃，来回爬动或短距离飞行。 爬动时触角向前摆动，后足呈划桨式运动，用于辅助爬行及支撑身体平衡。 静止时可见腹部末端出现有节律的抽动，抽动频率约0.9s～1.2s一次，连续 抽动15～30次后，静止0.5min～3min后再次抽动，此过程可持续20min～ 40min。随后雌成虫开始飞翔，活跃5min～10min后，静止时可见雌虫双翅 向后上方稍展开，腹部末端与身体呈70°～90°朝下弯曲，同时向下伸出腹部 末端，裸露出淡黄色的产卵器。雌虫羽化后2d时，主要表现为频繁爬行，腹 部末端出现有节律的抽动，但很少见产卵器伸出现象。羽化后4d～5d后，有 主动伸出产卵器现象。

取羽化2d～6d的核桃举肢雌蛾，在求偶活跃期不同阶段摘取腹部末端 最后3节，在尖底微型试管内用10uL～20uL重蒸正己烷浸泡30min。将浸 提液进行GC-MS分析。发现只有在产卵器伸出体外时，才能提取检测到性 信息素成分，而在之前的活跃的爬行飞跃期，腹部末端有节律的抽动期均检 测不到信息素成分。

通过田间饲养观察实验，初步明确了核桃举肢蛾雌虫求偶行为中重要阶 段--产卵器伸出体外的条件、过程。只有在产卵器伸出体外阶段才可能提取 到性信息素活性成分。

实施例3：核桃举肢蛾性信息素关键组分鉴定

将浸提液进行GC-MS分析，兴奋期的核桃举肢蛾雌蛾腹部末端粗提物 的气相色谱图(GC图)见图2。为了排除在信息素提取过程中来自昆虫体 内的其他组织产生的杂峰。采用理论上不会含信息素的雄性成虫腹部末端、 和非兴奋期的雌成虫腹部末端的正己烷浸提液为对照，在相同的条件下，将 兴奋期的雌虫腹部末端浸提液(含信息素)与雄虫、及非兴奋期的雌成虫腹 部末端正己烷浸提液分别进行气相色谱析。对照1：核桃举肢蛾雄蛾腹部末 端粗提物的气相色谱图(GC图)见图3。对照2：非兴奋期的核桃举肢蛾 雌蛾腹部末端粗提物的GC图见图4。

从兴奋期雌核桃举肢蛾腹末端提取液的GC图中剔除与雄虫及非兴奋期 雌虫的同部位提取液的GC图中的不同组分，再对剩余的GC峰进行分析，以 便找到最可能的信息素峰。在同一色谱条件下，13～16个碳的烯醇极其酯的 GC出峰位置(保留时间RT)都在17.00min～30.00min之间，因此，将兴奋 期雌核桃举肢蛾腹末端提取液的GC图采用保留时间过滤，选择RT＝17.00～ 30.00，滤除超过此范围的其他GC组分。

利用GC/MS分析发现了腺体内含有不饱和16碳烯醇酯性信息素成分， 通过与候选化合物GC/MS图谱对比及结合触角电位试验、田间引诱试验， 最终确定了反-5-十六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)为其性信息素关键活性化 合物，其GC/MS图谱对比见图5-7。

实施例4：核桃举肢蛾对候选性信息素化合物触角电位反应

利用合成和所收集的十六碳性信息素类似物开展了触角电位试验，进一 步了解核桃举肢蛾雄虫对不同十六碳性信息素类似物触角电位反应。EAG 实验在林学院触角电位实验室完成。用手术刀片从触角基部切下触角，基部、 尖端切除少许，用导电胶把触角的两端连接在电极上EAG测定，试虫为2-3 日龄未交配核桃举肢蛾雄虫，每样品平行刺激3次。实验中EAG波形图是 记录触角对待测化合物的EAG反应值的大小，为了消除仪器状态、环境因 素以及触角活性衰减对测试结果的影响，分析结果前对实验数据进行处理。 即以溶剂正己烷作为对照化合物，所有刺激物测得的触角电位反应值均为相 对于正己烷的相对值，测定时，每一个处理各刺激一下对照化合物，消除触 角反应的衰减对测试结果的影响。核桃举肢蛾雄虫对部分化合物的触角电位 反应值见图8。

核桃举肢蛾雄虫对不同双键位置的十六碳性信息素类似物刺激反应大 小为：

E-5-16:OAc>Z-5-16:OAc>Z-7-16:OAc>E-7-16:OAc>Z-9-16:OAc>Z-11-1 6:OAc>Z-13-16:OAc，对同一双键位置的十六碳烯酯的反应大于十六碳烯 醇。

实施例5：候选性信息素化合物对核桃举肢蛾田间诱捕试验

2011年至2015年期间在陕西省商洛市山阳县核桃示范产区，结合性信 息素提取鉴定、触角电位等实验结果，利用合成的性信息素候选化合物进行 了大量的田间诱捕试验。

5.1供试诱捕器

三角柱型诱捕器。自制三角型诱捕器，诱捕器的底边涂有粘虫胶，诱芯 通过细铁丝悬挂在三角型诱捕器的内部，距底部粘虫板2cm左右。

5.2空白诱芯

袖口式空白诱芯购自西安狄寨诱捕厂，颜色为蓝色，重量约为0.6g。

5.3试验方法

5.3.1诱芯配置

空白诱芯经无水乙醇浸泡并超声处理15min后用蒸馏水清洗数次，晾干 后制备诱芯。将供试化合物用正己烷溶解并稀释，用微量进样器按所需剂量 加入到空白诱芯的凹槽中(混合配方则按照相应比例加入)。为使化合物完 全浸入诱芯中，追加三次正己烷，每次50ul。

标准诱芯：

溶剂对照：空白诱芯只加正己烷。

5.3.2试验方法

诱捕器悬挂在核桃树合适的位置上，距地面1.8m～2.2m，间距20m～ 30m，每种试验设三个重复。同时设置溶剂对照组，每天检查记录每个诱捕 器中捕获的核桃举肢蛾头数。

5.4结果与分析

部分诱芯、配比实验结果统计见表1。田间诱捕试验表明虽然 Z-9-16:OH、Z-9-13:OH、Z-8-13:OAc等虽然对核桃举肢蛾雄虫具有一定的 EAG活性，但以Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc、Z-8-13:OAc、Z-8-13:OH等化合 物在陕西商洛市山阳县、洛南县等地田间诱效试验，却诱不到核桃举肢蛾成 虫。但含有E-5-16:OAc组分的单独或混合诱芯可以诱捕到举肢蛾成虫，验 证其为核桃举肢蛾性信息素关键组分。

表1：部分不同化合物诱芯对核桃举肢蛾引诱效果