转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列

摘要

本发明提供一种转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列，属于生物技术领域，用于吉生粳3号品系特异性PCR检测。旁侧序列为3’端旁侧序列，序列如SEQ ID NO.7所示，提供了T?DNA 3’端和5’端的巢式引物序列，以待测水稻总DNA为模板，通过基因组步移方法和热不对称PCR方法，用所述引物进行PCR检测，分离T?DNA序列3’旁侧序列，本发明所分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立吉生粳3号品系特异性PCR检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种转基因水稻品系吉生粳3号的外源插入片段 的旁侧序列，用于吉生粳3号品系特异性PCR检测方法中。

背景技术

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一。目前，全球转基因水稻研究进 展迅速，涉及抗虫、抗病、抗除草剂、品质和农艺性状改良等多方面内容。我国转 基因水稻研发与世界同步，其中抗虫转基因水稻处于世界领先水平。对转基因植物 进行品系特异性检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基 础。而转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系特异性检测方法的 重要技术资料。基因组步移技术(Genomewalking)是目前广泛利用于分离外源插 入片段旁侧序列的简单有效方法之一。它是从外源插入片段的已知序列出发，逐步 探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。目前已经有部 分专利和文献报道了转基因植物外源插入片段旁侧序列，然而还没有任何关于转基 因水稻吉生粳3号外源插入片段旁侧序列的文章和专利报道。

发明内容

本发明提供一种转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列，用于吉生粳3 号品系特异性PCR检测。

转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序 列，该3’端旁侧序列如SEQIDNO.7所示。

所述的转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列的制备方法，包括提取转 基因水稻吉生粳3号的基因组DNA，通过基因组步移方法和热不对称PCR方法分离得 到。

转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列在吉生粳3号品系特异性PCR 检测方法中的应用。

本发明利用基因组步移方法和热不对称PCR方法分离得到外源插入片段的3’端 旁侧序列732bp,其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。通过比对分析发现，该序列包括 转化载体序列部分和水稻基因组序列部分，载体序列部分即SEQIDNO.7中的1-68位 核苷酸序列与载体的部分序列完全相同,水稻基因组序列部分即SEQIDNO.7中 68-732位核苷酸序列与水稻日本晴品种2号染色体上(GenBank登记号： NC_029257.1)的2790589-2789925bp区段核苷酸序列具有99％的相似性。因此，外源 插入片段在吉生粳3号基因组中的插入位点可判断为2790589位。通过5’端巢式PCR 方法进一步验证了插入位点的准确性。

本发明优点是首次分离了转基因水稻品系吉生粳3号的3’端旁侧序列，并确定 了外源基因在水稻基因组中的插入位点。本发明所分离的外源插入片段的旁侧序列 可以进一步用于建立吉生粳3号品系特异性PCR检测方法。

附图说明

图1吉生粳3号热不对称PCR扩增结果图，图中：

M：λ-HindⅢdigestDNA分子量标准；1-3：AP1的1st、2nd、3rdPCR产物； 4-6：AP2的1st、2nd、3rdPCR产物；7-9：AP3的1st、2nd、3rdPCR产物；10-12： AP4的1st、2nd、3rdPCR产物；

图2是5’端巢试PCR扩增结果图，图中：

M：100bpDNAladder；1：引物组合C10-Chr2-1496F与C10F-SP4PCR扩增结果； 2：引物组合C10-Chr2-1496F与C10F-SP5PCR扩增结果；3：引物组合C10-Chr2-1496F 与C10F-SP6PCR扩增结果。

具体实施方式

转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序 列，该3’端旁侧序列如SEQIDNO.7所示。

所述的转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列的制备方法，包括提取转 基因水稻吉生粳3号的基因组DNA，通过基因组步移方法和热不对称PCR方法分离得 到。

转基因水稻吉生粳3号外源插入片段的旁侧序列在吉生粳3号品系特异性PCR 检测方法中的应用。

下边通过具体实验例来对本发明作进一步说明。

1.实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫水稻品系吉生粳3号，非转基因水稻吉粳88。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TaKaRaGenomeWalkingKit(CodeNo.6108)，TaKaRaDNA LigationKit(CodeNo.6022)，pMDTM19-TVector(CodeNo.6013)，TakaraLATaq， DNAMarker购自大连宝生物公司。康为世纪2×EsTaqMasterMix(含有EsTaqDNA Polymerase,PCRbuffer，3mMMgCl₂，400uMdNTPmix)购自北京康为生物公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由上海生工生物技术有限公司 合成。

1.3实验仪器

DNA处理仪器：低温混合球磨仪MM400(Retsch)；

PCR扩增仪：BioRAD(ABAppliedBiosystemsveriti96wellThermalCycler (AB))；

核酸电泳仪：DYY-11型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)；

DNA电泳分析系统：GeneSnap凝胶成像分析系统；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养 箱等。

2.实验方法

2.1水稻基因组DNA的提取

水稻单株种植，取幼嫩叶片作为DNA提取材料，用DNA样品提取液TENS[200 mMTris-HCl(pH7.6)，25mMEDTA，250mMNaCl，0.5％SDS]进行水稻基因组 DNA的提取；

a.称取水稻新鲜叶片100mg，剪刀剪碎装入2ml离心管中，放入液氮中预冷， 用低温混合球磨仪充分破碎。加入500μlDNA样品提取液，轻摇20s，60℃水浴 放置30min以充分抽提DNA，间歇摇动；

b.加入500μl氯仿，轻摇10min，12,000rpm离心5min，将上清移至新的离 心管中；

c.加入1/2体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置1h，此时可能会出现絮状沉淀；

d.将所得的溶液或者絮状沉淀，10,000rpm离心5min，弃废液，置于室温放 置20min，以彻底晾干沉淀；

e.加50-100μlTE缓冲液，37℃放置2-5min，以彻底溶解DNA，4℃条件下 保存备用；

2.2DNA浓度和纯度测定

使用NanoDrop2000分光光度计(ThermoScientific)测定DNA的纯度和浓度，并用 去离子双蒸水调节DNA浓度至100ng/μl。

2.3GenomewalkingKitPCR反应

吉生粳3号的3’端旁侧序列利用TaKaRaGenomeWalkingKit(CodeNo.6108)， 通过基因组步移方法(GenomewalkingPCR)和热不对称PCR分离。参照Genome walking试剂盒说明，主要操作步骤如下。在已知的T-DNA序列3’端设计三条同向且 退火温度较高的特异性引物(SP1、SP2、SP3)(表1)，与试剂盒中提供的三种经 过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反 应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的 差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的旁侧序列。

表1T-DNA3’端巢式引物序列

PCR扩增体系为：

1)1stPCR反应。基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板

表2PCR扩增体系

2)2ndPCR反应。将1stPCR反应液稀释1000倍后，取1μl作为2ndPCR反应 的模板，以AP1、AP2、AP3、AP4Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行 2ndPCR反应，PCR扩增体系见表2。

3)3rdPCR反应。将2ndPCR反应液稀释1000倍后，取1μl作为2ndPCR反应 的模板，以AP1、AP2、AP3、AP4Primer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行 3rdPCR反应。PCR扩增体系见表2。

热不对称PCR扩增程序见表3。

表3热不对称PCR扩增体系

取1st，2nd，3rdPCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。切胶回 收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序，各取5ul进行1％ 琼脂糖凝胶电泳。

2.4TA克隆

使用TaKaRaDNALigationKit(CodeNo.6022)中的SolutionI，将吉生粳3号巢式 PCR产物与pMDTM19-TVector(CodeNo.6013)连接，热转化至E.coliCompetentCells JM109(CodeNo.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。分别挑选阳性菌落植菌，提 取阳性克隆质粒，对质粒DNA进行测序，测序引物为M13-47：5’ -CCAGTTCAGCTAATCTTCTT-3’。

2.5序列比对分析

利用NCBIBLAST软件进行目标序列与NCBI数据库中的序列进行比对分析。

2.6T-DNA在水稻基因组中的插入位点验证

根据在前期工作中利用染色体步移方法获得的5’端旁侧序列，用NCBI进行序 列比对分析，确定了包含外源基因的T-DNA在水稻基因组中的插入位点。在插入位 点左侧设计正向引物(C10-Chr2-1496F)，在T-DNA5’端设计3条同向巢式引物 (C10F-SP4，C10F-SP5，C10F-SP6)，进行PCR扩增以进一步确认插入位点的正确 性。引物序列见表2。

表4T-DNA5’端巢式引物序列

PCR扩增体系为：总体系20ul，康为世纪2×EsTaqMasterMix10μl(含有EsTaq DNAPolymerase，PCRbuffer,3mMMgCl₂，400uMdNTPmix)，引物各1μl(10μM)， 水稻DNA2μl(100ng/μl)，剩余用ddH2O补足。

PCR扩增程序为：94℃1min；94℃10s，55℃1min，35个循环；72℃10min。

3.实验结果

3.13’端旁侧序列的获取

吉生粳3号的3’端旁侧序列通过基因组步移方法和热不对称PCR方法获得。 T-DNA序列3’端3条同向巢式引物C10R-SP1、C10R-SP2、C10R-SP3分别与兼并引 物AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。PCR共进行3次，第一次PCR以吉 生粳3号基因组DNA为模板，C10R-SP1引物分别与兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4 进行组合，第二次以第一次PCR产物为模板，C10R-SP2分别与4条兼并引物分别进行 组合，第三次以第二次PCR产物为模板，C10R-SP3分别与4条兼并引物分别进行组合， 进行热不对称PCR。结果3次PCR的所有引物组合均获得比较清晰的PCR条带，但是 只有3条巢式引物与兼并引物AP2的组合获得的条带大小呈递减趋势(泳道4-6)，可 以判断是吉生粳3号3’端旁侧序列的特异性条带(图1)。

切胶回收C10R-SP3与AP2引物组合扩增出的PCR条带(图1中泳道6，AP2-3rd，约 1.8kbp)，通过TA克隆方法获得包含目的片段的载体，经过目的片段的测序最终获得 目的片段的核苷酸序列SEQIDNO.7：

GCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAAC TATCAGTGTTTGAATATGAATGACTTCGTTAATATCAAGATATACTGACATAATCT TTCGAAGATGTTCATATGGGTATATGAATAGGGTGTGTGTGTATTCATTGGAATG CGTGCGCACTTTATATGAGTATATATTTTCGTACTGTGTTAAAAAATTGTTTTTTT CCTGCGATGGAGCCAAGGAAATGTCACAGGCAAACAGTTGGGAGACAAGAGA GCACTGTTCCATTTCAGGTTAGGTGTGCCAACATGCATGGTAAAATATGGCTAC AATATAAAATATCCATGTATACTTGTATGGTACCAATCATAGCATGGGGACAAAG TCACAAAAAGCTGATTGTTTTGTTCATGAGTGTCAATGCACAATTGGTGATATC AATCTTTTTCTTTAGACCAACTAATCACTAATCACTCCACTCAGATAGCACTAAC TAGAGGCATTAGCATTAAGCATTATCTCACAGCTTTGCAAAGCTTAATGCAGGG ATTTTATATGGTTGCAACTACTCATATAGTTGAGACACATGTATATAAGAAGTTGG GTTACAACTAATGCAAGATCTCCTGAATTCAGATTCAGAGGGATCCTGTCTGTG GTGAGTCTAGCAAGCAACAGCTTTGCTATTTTGCAGGTTTATCCATCAGATTATT TTTTTTTCTGAAAGGTCAAAAC

3.2T-DNA在基因组中的插入位点

根据转基因抗虫水稻品系吉生粳3号3’端旁侧序列，用NCBI数据库中的BLAST 工具进行比对确定了T-DNA在吉生粳3号基因组中的插入位点。比对结果表明，吉生 粳3号3’端旁侧序列中1-67bp区段与载体序列3’端的部分序列有100％的相似性， 68-732bp区段与水稻粳稻日本晴品种的2号染色体上的2790589-2789925bp区段具有 99％的相似性，插入位点为2790589。

根据3’端确定的旁侧序列已确定的插入位点，在吉生粳3号插入位点左侧的基 因组中设计了正向引物(C10-Chr2-1496F)，在T-DNA左边界区段设计3条同向T-DNA 特异性巢式引物(C10F-SP4，C10F-SP5，C10F-SP6)，进行PCR扩增以进一步确认 插入位点的正确性。PCR结果获得了3条大小递减的PCR条带，说明根据3’端旁侧序 列判断的T-DNA在水稻基因组中的插入位点是正确的(图2)。

结论：

吉生粳3号的3’端旁侧序列通过基因组步移方法和热不对称PCR方法获得。 T-DNA3’端3条同向巢式引物C10R-SP1、C10R-SP2、C10R-SP3分别与兼并引物 AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。PCR结果，3次PCR的所有引物组合 均获得比较清晰的PCR条带，但是只有3条巢式引物与兼并引物AP2的组合获得的条 带大小呈递减趋势，因此可以判断是吉生粳3号3’端旁侧序列的特异性条带。切胶 回收C10R-SP3与AP2引物组合扩增出的PCR条带，通过TA克隆方法获得包含目的片 段的载体，经过目的片段的测序最终分离获得3’旁侧序列。

利用已分离的转基因抗虫水稻品系吉生粳3号3’端旁侧序列，用NCBI数据库中 的BLAST工具进行比对，分析了旁侧序列与水稻基因组序列的相似性并确定了 T-DNA在吉生粳3号基因组中的插入位点。比对结果表明，吉生粳3号3’端旁侧序列 中1-67bp区段与载体序列3’端的部分序列有100％的相似性，68-732bp区段与水稻粳 稻日本晴品种的2号染色体上的2790589-2789925bp区段具有99％的相似性，插入位点 为2790589。

根据3’端确定的旁侧序列已确定的插入位点，在吉生粳3号插入位点左侧的基 因组中设计了正向引物(C10-Chr2-1496F)，在T-DNA5’端设计3条同向T-DNA特 异性巢式引物(C10F-SP4，C10F-SP5，C10F-SP6)，进行PCR扩增以进一步确认插 入位点的正确性。PCR结果获得了3条大小递减的PCR条带，说明根据3’端旁侧序列 判断的T-DNA在水稻基因组中的插入位点是正确的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要 求保护的范围。