一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用

摘要

本发明公开一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用，由下列组分组成：海藻糖2～10 g/100ml、N?正辛基?D?葡萄糖胺2.93～5.87μg/100ml、N?乙酰基?D?葡萄糖胺2.21～4.42μg/100ml、溶剂为水。应用时是按甲型肝炎减毒活疫苗病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶0.7～1.2，在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂。本发明冻干保护剂所生产的冻干后疫苗的滴度不变；热稳定性显著提高；冻干疫苗具有良好的安全性和免疫原性，本发明配方成分明确，配方简单，制备方法简单易行，易于实施，疫苗制备工艺步骤可操作性强，利于产品的标准化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用，属于生 物制品技术领域。

背景技术

甲肝疫苗是预防甲型肝炎的有效手段。目前已经利用冷冻干燥技术将甲型肝炎减 毒活疫苗制成冻干剂型，能够更有效地保障疫苗的热稳定性和免疫原性。

目前制成冻干型甲型肝炎减毒活疫苗是通过加入冻干保护剂实现，冻干保护剂对 疫苗中抗原活性的保持具有非常重要的作用。而目前的冻干保护剂还存在造价较高，冻干 保护剂的溶解速度慢，制备时间长等问题。

因此，有必要研究开发新的冻干保护剂，以有效地维持冻干后疫苗产品的生物学 活性，提高冻干保护剂的溶解速度，一定程度上降低生产成本，节约生产资源，提高经济效 益。

发明内容

为解决现有冻干保护剂存在冻干保护剂溶解速度慢、制备时间长等问题，本发明 提供一种冻干保护剂及其在冻干型甲型肝炎减毒活疫苗中的应用，以达到降低成本，缩短 制备周期的良好效果，并能作为现有冻干保护剂的替代产品。

本发明通过下列技术方案实现：一种冻干保护剂，其特征在于由下列组分组成：

海藻糖2～10g/100ml、

N-正辛基-D-葡萄糖胺2.93～5.87μg/100ml、

N-乙酰基-D-葡萄糖胺2.21～4.42μg/100ml、

溶剂为水。

上述冻干保护剂应用于冻干型甲型肝炎减毒活疫苗时，是按甲型肝炎减毒活疫苗 病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶0.7～1.2，在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保 护剂。

本发明还在于提供一种冻干型甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法，经过下列各步 骤：

A、取人胚肺二倍体细胞KMB₁₇的20～40代，用0.03～0.05%的胰蛋白酶+0.02～0.04%的 乙二胺四乙酸，将单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为8～12转/小时，温度为37± 0.5℃条件下培养3～6天，使细胞长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB₁₇细胞弃营养液，消化后，用含2～5%血清的MEM培养基收集细 胞，在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶40～60地量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒 种，在37℃温度，转速为20～120转/分钟的条件下搅拌0.5～2小时使病毒悬浮吸附，补加含 5～10%血清的维持液至每个转瓶终体积为180ml，35±0.5℃恒温并继续旋转培养至14天， 换新鲜的营养液，共培养26～28天；

C、弃营养液，按1∶10～20的体积比加入细胞消化液，再按10μl/cm²的量加入0.1mmol/ L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液收集细胞，2000～2500rpm离心15～20分钟，弃上清，按10μ l/cm²的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪 进行5～6分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇10～30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水 相，蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇10～30分钟，3000rpm离心 15分钟，吸取水相，如此重复3次；

D、病毒液按1∶0.7～1.2的体积比加入冻干保护剂，该冻干保护剂，按下列组分备料后 混合溶解：

海藻糖2～10g/100ml、

N-正辛基-D-葡萄糖胺2.93～5.87μg/100ml、

N-乙酰基-D-葡萄糖胺2.21～4.42μg/100ml、

溶剂为水；

在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空8～16小时，升温至-25℃，100ubar抽 真空6～10小时，升温至-20℃，100ubar抽真空6～10小时，升温至-10℃，100ubar抽真空2～ 6小时，升温至0℃，100ubar抽真空2～6小时，升温至10℃，20ubar抽真空2～6小时，升温至 20℃，10ubar抽真空4～8小时，即得冻干型甲型肝炎减毒活疫苗。

本发明与现有技术相比，具有下列优点和效果：本发明提高了冻干保护剂的溶解 速度，能有效缩短制备时长，降低产品成本。还能保证冻干后疫苗的滴度不变；热稳定性显 著提高；冻干疫苗具有良好的安全性和免疫原性。本发明配方成分明确，配方简单，制备方 法简单易行，易于实施，疫苗制备工艺步骤可操作性强，利于产品的标准化大规模生产。

又经研究表明，在干燥时海藻糖起着保护细胞与生物大分子的作用，例如，抗血清 抗体在有海藻糖存在时，室温或37℃下空气干燥后，在室温贮存几年其生物活性仍不会发 生明显变化。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成，无毒无害，化学性质非 常稳定，在体内可被酶水解成葡萄糖而被利用。N-正辛基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-葡萄 糖胺的溶解速度较快，成本较低，能一定程度上缩短制备过程的时长，降低产品成本，达到 节约时间成本和经济成本的目的。相比现有配方中加入的甘氨酸，能解决甘氨酸成本较高， 溶解速度较慢的问题。

本发明提供的冻干保护剂与甲型肝炎减毒活疫苗混合后进行冷冻干燥，获得的冻 干疫苗感染性滴度（l0gCCID50/ml）与冻干前比较无明显差异（P>0.05），具有较好的稳定 性，冻干后疫苗的残余水份含量<3.0％，达到生物制品规程要求，经小白鼠安全性试验合 格，经临床研究证实该冻干型甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的临床安全性和免疫原性。

具体实施方式

下面结合实施对本发明做进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。

实施例1

A、取人胚肺二倍体细胞KMB₁₇的30代，用0.04%的胰蛋白酶+0.03%的乙二胺四乙酸，将 单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为8～12转/小时，温度为37±0.5℃条件下培养3 ～6天，使细胞长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB₁₇细胞弃营养液，消化后，用含3%血清的MEM培养基收集细胞， 在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶40～60地量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒种，在 37℃温度，转速为100转/分钟的条件下搅拌1小时使病毒悬浮吸附，补加含8%血清的维持液 至每个转瓶终体积为180ml，35±0.5℃恒温并继续旋转培养至14天，换新鲜的营养液，共培 养26～28天；

C、弃营养液，按1∶15的体积比加入细胞消化液，再按10μl/cm²的量加入0.1mmol/L、pH 为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液收集细胞，2000～2500rpm离心15～20分钟，弃上清，按10μl/ cm²的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪进 行5～6分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇10～30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相， 蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇10～30分钟，3000rpm离心15 分钟，吸取水相，如此重复3次；

D、病毒液按1∶0.7的体积比加入冻干保护剂，该冻干保护剂，按下列组分备料后混合溶 解：

海藻糖8g/100ml、

N-正辛基-D-葡萄糖胺3.55μg/100ml、

N-乙酰基-D-葡萄糖胺3.4μg/100ml、

溶剂为水；

在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空10小时，升温至-25℃，100ubar抽真 空8小时，升温至-20℃，100ubar抽真空8小时，升温至-10℃，100ubar抽真空4小时，升温至0 ℃，100ubar抽真空4小时，升温至10℃，20ubar抽真空4小时，升温至20℃，10ubar抽真空6小 时，即得冻干型甲型肝炎减毒活疫苗。

实施例2

A、取人胚肺二倍体细胞KMB₁₇的20代，用0.03%的胰蛋白酶+0.02%的乙二胺四乙酸，将 单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为8～12转/小时，温度为37±0.5℃条件下培养3 ～6天，使细胞长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB₁₇细胞弃营养液，消化后，用含2%血清的MEM培养基收集细胞， 在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶40～60地量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒种，在 37℃温度，转速为20转/分钟的条件下搅拌2小时使病毒悬浮吸附，补加含5%血清的维持液 至每个转瓶终体积为180ml，35±0.5℃恒温并继续旋转培养至14天，换新鲜的营养液，共培 养26～28天；

C、弃营养液，按1∶10～20的体积比加入细胞消化液，再按10μl/cm²的量加入0.1mmol/ L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液收集细胞，2000～2500rpm离心15～20分钟，弃上清，按10μ l/cm²的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪 进行5～6分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇10～30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水 相，蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇10～30分钟，3000rpm离心 15分钟，吸取水相，如此重复3次；

D、病毒液按1∶1.2的体积比加入冻干保护剂，该冻干保护剂，按下列组分备料后混合溶 解：

海藻糖2g/100ml、

N-正辛基-D-葡萄糖胺2.93μg/100ml、

N-乙酰基-D-葡萄糖胺2.21μg/100ml、

溶剂为水；

在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空8小时，升温至-25℃，100ubar抽真空 6小时，升温至-20℃，100ubar抽真空6小时，升温至-10℃，100ubar抽真空2小时，升温至0 ℃，100ubar抽真空2小时，升温至10℃，20ubar抽真空2小时，升温至20℃，10ubar抽真空4小 时，即得冻干型甲型肝炎减毒活疫苗。

实施例3

A、取人胚肺二倍体细胞KMB₁₇的40代，用0.05%的胰蛋白酶+0.04%的乙二胺四乙酸，将 单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为8～12转/小时，温度为37±0.5℃条件下培养3 ～6天，使细胞长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB₁₇细胞弃营养液，消化后，用含5%血清的MEM培养基收集细胞， 在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶40～60地量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒种，在 37℃温度，转速为120转/分钟的条件下搅拌0.5小时使病毒悬浮吸附，补加含10%血清的维 持液至每个转瓶终体积为180ml，35±0.5℃恒温并继续旋转培养至14天，换新鲜的营养液， 共培养26～28天；

C、弃营养液，按1∶10～20的体积比加入细胞消化液，再按10μl/cm²的量加入0.1mmol/ L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液收集细胞，2000～2500rpm离心15～20分钟，弃上清，按10μ l/cm²的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪 进行5～6分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇10～30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水 相，蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇10～30分钟，3000rpm离心 15分钟，吸取水相，如此重复3次；

D、病毒液按1∶1的体积比加入冻干保护剂，该冻干保护剂，按下列组分备料后混合溶 解：

海藻糖10g/100ml、

N-正辛基-D-葡萄糖胺5.87μg/100ml、

N-乙酰基-D-葡萄糖胺4.42μg/100ml、

溶剂为水；

在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空16小时，升温至-25℃，100ubar抽真 空10小时，升温至-20℃，100ubar抽真空10小时，升温至-10℃，100ubar抽真空6小时，升温 至0℃，100ubar抽真空6小时，升温至10℃，20ubar抽真空6小时，升温至20℃，10ubar抽真空 8小时，即得冻干型甲型肝炎减毒活疫苗。

对以上实施例1～3冻干保护剂的溶解速度做以下对比试验：

对比例1：申请号CN200610010686.8提供的冻干保护剂；

对比例2：申请号CN200610010686.8提供的冻干保护剂。

将实施例1～3和对比例1、2的冻干保护剂，分别按其组分备料后在常温下搅拌混 合溶解，再加入减毒活疫苗或病毒液。此处冻干保护剂的混合溶解，各例自混合开始计时的 溶解耗时见下表。可见，本发明实施例1～3提供的冻干保护剂，相比现有技术，溶解速度快。

以上实施例1～3所制备的冻干型甲型肝炎减毒活疫苗进行相关生物活性及动物 学实验：

1、实施例1～3提供的冻干型甲型肝炎减毒活疫苗与冻干前的相同甲型肝炎减毒活疫 苗的感染性滴度变化见表1。

2、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗在45℃下感染性滴度变化，见表2。

3、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗在37℃下感染性滴度变化，见表3。

4、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗在室温下稳定性，见表4。

5、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下稳定性研究，见表5。

6、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗接种小白鼠反应观察，见表6。

7、冻干保护剂急性毒理反应结果，见表7。

结果如下：

表1甲型肝炎减毒活疫苗冻干前、后感染性滴度变化

表2冻干与液体剂型的甲肝减毒活疫苗在45℃下感染性滴度变化

表3冻干型与液体剂型甲肝减毒活疫苗在37℃下感染性滴度变化

表4冻干型与液体剂甲型肝炎减毒活疫苗在室温下感染性滴度变化

表5冻干与液体甲型肝炎减毒活疫苗2~8℃下感染性滴度变化

（单位：logCCID₅₀/ml）

表6不同批次冻干疫苗接种小白鼠反应观察

表7冻干保护剂急性毒理反应结果

1、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗的感染性滴度研究

从表1看出：经过6批试验，冻干前感染性滴度平均值为7.17logCCID₅₀/ml，冻干后感染 性滴度平均值为7.15logCCID₅₀/ml，两组无显著差异（P>0.05）。经反复验证，冻干前、后两组 感染性滴度平均值无显著差异（P>0.05）。表明该保护剂组合对甲型肝炎减毒活疫苗（H₂株） 耐受冻干具有优良的保护作用。

从表2～表5可以看出，冻干型甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下24个月内其感染性 滴度无显著变化（P>0.05），说明其在2～8℃下具有较好的稳定性。而液体疫苗在6个月内无 显著变化，但6个月后其感染性滴度则逐渐下降。到18个月时其感染性滴度平均下降 2.85logCCID₅₀/ml。

结果表明：冻干型甲型肝炎减毒活疫苗分别在45℃下1天、37℃下6天、室温下28天 感染性滴度维持不变，而液体剂型的甲肝减毒活疫苗在同等条件下感染性滴度明显下降， 说明其具有良好的热稳定性。冻干型甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下24个月内其感染性滴 度无显著变化。说明其在2～8℃下保存2年内稳定，其感染性滴度无显著变化。此外，在45℃ 下、37℃下及室温下冻干型甲型肝炎减毒活疫苗的稳定性明显优于液体疫苗。

2、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗安全性研究

本安全性试验使用实施例1、2、3共3批冻干型甲型肝炎减毒活疫苗，每批成品用注射水 溶解后混合均匀，每一批用5只17～20g小白鼠，每只腹腔注射0.5ml进行安全试验，每日观 察，共观察7天。结果见表6。

从表6可以看出，3批冻干型甲型肝炎减毒活疫苗安全试验合格，证明H2株冻干型 甲型肝炎减毒活疫苗具有很好的安全性。

3、冻干型甲型肝炎减毒活疫苗冻干保护剂急性毒理反应研究

本试验共使用实施例1、2、3的冻干保护剂及所制备的冻干疫苗，并各取2份作为样品共 6个样品。冻干保护剂，系无色透明液体，人用剂量为1ml/次。通过皮下注射，肌肉注射和静 脉注射三种给药途径，观察冻干保护剂的急性毒性反应。试验动物采用7周龄健康昆明种小 鼠，每组20只。各组动物禁食不禁水12小时后，第一、二组以20ml/kg剂量在24小时内分别皮 下注射和肌肉注射冻干保护剂3次，每次间隔8小时；第三组动物以20ml/kg剂量经尾静脉注 射给受试物一次。结果见表7。

各组动物给药后，其外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便、被毛、肤色及呼吸等 均无明显毒性反应。观察7天，无一动物死亡。处死解剖小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾脏内 脏组织，也未见明显异常。

试验结果表明：（1）小鼠一日内以20ml/kg的剂量3次皮下注射和肌肉注射冻干保 护剂，无明显毒性反应发生。小鼠一日内皮下注射和肌肉注射冻干保护剂的最大耐受量为 60ml/kg，此剂量相当于人用量的3000倍。（2）小鼠一次静脉注射冻干保护剂的最大耐受量 为20ml/kg。所选用的冻干保护剂是根据《中华人民共和国药典》，并经急性毒理反应研究证 明无毒副作用。