铜绿假单胞菌感染肺炎的动物模型的建立方法

摘要

本发明涉及一种铜绿假单胞菌肺炎模型的建立方法，该方法有以下步骤：1)采用异氟烷深麻小鼠；2)铜绿假单胞菌对小鼠滴鼻，建立铜绿假单胞菌感染的肺炎模型。本发明所述方法能够有效感染小鼠，成功建立铜绿假单胞菌肺炎模型。感染后的小鼠模型稳定，可用于疫苗的评价和保护性机制研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌感染肺炎的动物模型的建立方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，为非发酵菌中的假单胞菌属，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，在医院病房及医疗器械中也普遍存在，是临床上最为常见的条件致病菌之一。目前在全球范围内，该菌已成为ICU病房、烧伤、战创伤感染,机械通气相关肺炎(VAP)分离率最高的病原菌之一。PA感染可发生在人体任何部位和组织，如烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心内膜炎、胃肠炎、肺炎甚至败血症等全身感染，全身感染死亡率超过20％。此外，由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。铜绿假单胞菌感染的控制已经成为目前棘手的医学难题，对人民群众的健康生活造成了影响。

疫苗是预防和控制铜绿假单胞菌感染最为经济和有效的手段。而铜绿假单胞菌疫苗的研发的前提条件就是需要有合适的动物模型，可以模拟细菌引发人体疾病的过程，从而评价候选疫苗得保护性效果，阐释疫苗的作用机理等。肺炎是铜绿假单胞菌引发最为常见的疾病之一，所国内外研究者对动物肺炎模型展开了大量的实验，分别用恒河猴、兔、小鼠、猪、大鼠等建立模型。猴类的生理结构特征与人类非常接近，作为实验动物最为理想。但由于数量少，价格贵，其应用受到限制。

由于考虑成本和可操作性的问题，目前国内外多采用啮齿动物(小鼠、大鼠)作为肺炎模型动物。于柏峰等(于柏峰等，重庆医学杂志，2011，40(2)，129-132)将6～8周龄雄性昆明小鼠，气管切开，用富含铜绿假单胞菌PA01(BAA-47^TM)的琼脂糖珠灌注小鼠，立即竖起小鼠,保持2min,使菌液流下进入肺内；又如鄢洁等(鄢洁等，世界最新医学信息文摘，2015，15(27)，8-10)将6-8周龄、体重25～30g的清洁级健康雄性昆明小鼠以氯胺酮麻醉小鼠后固定，常规消毒铺巾，严格无菌操作，切开颈部皮肤，钝性分离至皮下组织，暴露上段气管，经气管内穿刺注入铜绿假单胞菌PA01。以上方法均可以构建肺炎模型。但是这些方法依然存在很大的问题，主要体现在以下方面：1、切开气管的方法虽然可以保证感染剂量，但作为一种有创的方法，在操作过程中容易造成动物器官损伤甚至导致实验动物死亡；2、操作复杂，每只小鼠都要进行手术，很难大批量开展实验；3、已经报道的感染模型所使用的铜绿假单胞菌菌株是来自美国的标准株PA01，不能代表国内流行PA菌株的流行情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌感染肺炎的动物模型的建立方法，本发明所述方法能够有效感染小鼠，成功建立铜绿假单胞菌肺炎模型。感染后的小鼠模型稳定，可用于疫苗的评价和保护性机制研究。

本发明的技术方案是：

铜绿假单胞菌感染肺炎的动物模型的建立方法，有以下步骤：

1)采用异氟烷深麻小鼠；

2)铜绿假单胞菌对小鼠滴鼻，建立铜绿假单胞菌感染的肺炎模型。

步骤1)所述的异氟烷深麻中，具体方法，用氧气为输送载体以4％～6％浓度的异氟烷进行吸入诱导麻醉，待小鼠进入外科深麻醉期后，以2％～4％异氟烷浓度维持麻醉。

较好的技术方案是，用氧气为输送载体以5％浓度的异氟烷进行吸入诱导麻醉。

较好的技术方案是，以3％异氟烷浓度维持麻醉。

步骤2)所述铜绿假单胞菌对小鼠滴鼻的方法：a.滴鼻过程中小鼠头部仰卧幅度不超过鼻咽部的生理弧度；b.顺鼻腔外侧壁滴药；c.小鼠吸气开始的瞬间滴加铜绿假单胞菌液，一次连续滴入。

较好的技术方案是，步骤c所述滴加铜绿假单胞菌液的浓度为总体积为20μL

较好的技术方案是，步骤c所述滴加铜绿假单胞菌液的浓度浓度为3.0×10⁹～3.0×10¹⁰CFU/ml，总量为6.0×10⁷～6.0×10⁸CFU。

所述铜绿假单胞菌的保藏号为CCTCCM2015730。

所述小鼠是SPF级8周龄BALB/c小鼠。

本发明所述的方法，采用无创方法，建模过程中感染条件容易控制，可以避免损伤动物其它器官，避免实验动物死亡。本发明所述方法操作简单、细菌浓度低，细菌用量少，感染率高，感染稳定，可以批量开展实验。由于菌株采用菌株保藏号为CCTCCM2015730的铜绿假单胞菌，使得菌株易得，且更具有代表性，经实验验证，建立的模型可引起小鼠显著的肺炎症状。

本发明建立的肺炎动物模型可用于评价铜绿假单胞菌疫苗免疫保护效果及保护性机制研究。

附图说明

图1为肺炎模型感染剂量的确定结果图；

图2为BLAB/c小鼠经PAXN-1(CCTCCM2015730)感染后各脏器定值计数结果图，图中，#表示未检测到细菌；

图3为肺泡灌洗液中性粒细胞的数量及在白细胞中所占的比例；

图4为肺组织切片图及病理评分；

图5为铜绿假单胞菌全菌灭活疫苗的肺炎模型免疫保护评价图。

具体实施方式

以下将通过具体实施例说明本发明内容，但本发明内容不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验材料及主要试剂如下所示：

1、实验动物

6-8周龄雌性BLAB/c小鼠，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供

2、实验菌株

(1)铜绿假单胞菌标准株(购自ATCC)：

铜绿假单胞菌菌株PA01(BAA-47^TM)，铜绿假单胞菌菌株Boston41501(27853^TM)，铜绿假单胞菌菌株R.Hugh813(9027^TM)，铜绿假单胞菌菌株Hugh815(10145^TM))，铜绿假单胞菌菌株NCTC6750(19429^TM)，由本室保种于-80℃冰箱。

(2)铜绿假单胞菌临床分离株(保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC)

铜绿假单胞菌临床分离株XN-1，分类命名为：铜绿假单胞菌XN-1，拉丁文名称：PseudomonasaeruginosaXN-1，保藏号为CCTCCNO:M2015730，保藏时间：2015.12.9；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地点：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

3.仪器和试剂

细菌培养箱，离心机，分光光度计，超净工作台，摇床等，均为生物学常规仪器。

酵母提取物(购自英国OXOID公司)，胰化蛋白胨(购自北英国OXOID公司)，NaCl(购自国药集团化学试剂有限公司)，生理盐水(购自西南药业股份有限公司)，异氟烷(购自山东科源制药有限公司)。

小动物专用吸入麻醉机(购自美国MATRX公司，型号VMR)。

实施例1：铜绿假单胞菌菌液制备

取冻存的铜绿假单胞菌临床株XN-1，采用LB营养琼脂平板复苏，37℃需氧培养过夜。挑取单个菌落接种20mLLB液体培养基，37℃需氧180rpm振荡培养15h后，取0.2mL接种于20mLLB液体培养基中，37℃需氧230rpm振荡培养6h。6000g离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后用生理盐水重悬浮菌体。采用分光光度计测定菌液的OD₆₀₀值，并用生理盐水调整OD值至1.0，通过梯度稀释，涂布LB平板计数得到铜绿假单胞菌在OD＝1.0时为6.0×10⁹CFU/ml。

实施例2：小鼠麻醉及滴鼻方案的建立

在铜绿假单胞菌肺炎模型的感染实验中，为保证滴鼻过程的顺利进行，首先采用异氟烷将小鼠麻醉。麻醉方法：以氧气为输送载体以5％浓度的异氟烷进行吸入诱导麻醉，待小鼠进入外科深麻醉期后，以3％的浓度维持麻醉，这种方式可以达到较好的麻醉效果。滴鼻剂量的控制是模型稳定性的保证，为了更好的控制滴鼻剂量，同时防止滴鼻过程中菌液进入口腔和产生气泡，采取了以下措施：(1)由于鼻咽部有一个生理弧度，头仰得越厉害，滴鼻液越容易进入口腔，所以滴鼻过程中小鼠头部仰卧幅度不能超过鼻咽部的生理弧度；(2)顺鼻腔外侧壁滴药，尽可能减少滴鼻过程中气泡的产生；(3)把握好滴鼻的节奏，在小鼠吸气开始的瞬间滴加4μL菌液；(4)本实施例中滴鼻量为20μL，单侧鼻孔一次连续滴入。

实施例3：感染剂量的确定

采用生理盐水将实施例1获得的PAXN-1菌液调节至五种不同浓度，将实验动物雌性BALB/c小鼠随机分为5组，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染剂量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。动物的分组和感染情况如表1所示。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO₂吸入法安乐处死。

表1：铜绿假单胞菌肺炎模型感染剂量的确定

组 滴鼻 剂量(CFU) 数量 浓度(CFU/ml) 滴入量(μl) 1 PAXN-1 6.0×10⁸10 3.0×10¹⁰20 2 PAXN-1 3.0×10⁸10 1.5×10¹⁰20 3 PAXN-1 1.5×10⁸10 7.5×10⁹20 4 PAXN-1 7.5×10⁷10 3.75×10⁹20 5 PAXN-1 3.75×10⁷10 1.88×10⁹20 6 生理盐水 - 10 - 20

采用不同浓度(2倍梯度稀释)的铜绿假单胞菌菌株PAXN-1感染BALB/c小鼠时，经过7天的观察，结果如图1所示：感染量为1.5×10⁸CFU时小鼠死亡率为40％，感染量为3.0×10⁸CFU时小鼠死亡率为80％，感染量达到6.0×10⁸CFU时小鼠死亡率100％。确定小鼠感染的优选剂量为3.0×10⁸CFU。

实施例4：感染评价

采用最终确定的感染剂量3.0×10⁸CFU感染雌性BALB/c小鼠20只，于感染后12h处死小鼠，取各脏器生理盐水冲洗后，加1ml生理盐水研磨，其中肺脏取100μL梯度稀释至1:1000000，心肝脾肾稀释1：100，各取100μL涂布于LB营养琼脂平板，需氧培养过夜后，观察培养结果并计数。将计数结果作图。

细菌感染后24h取小鼠肺泡灌洗液，通过流式细胞术分析中性粒细胞占白细胞的比例和中性粒的数量。细菌感染后分别在12h、24h、48h，麻醉后颈椎脱臼处死小鼠。

取小鼠双肺置于10％中性福尔马林溶液中固定过夜，石蜡包埋切片(30μm)，HE染色。同时，采用生理盐水对雌性BALB/c小鼠10只进行滴鼻，作为阴性对照。

感染后12h处死小鼠，取血液、心、肝、脾、肺、肾组织进行培养后，结果如图2所示，PAXN-1感染后小鼠肺组织铜绿假单胞菌培养阳性率为100％，对照组为阴性，证明细菌感染成功且稳定。

感染后24h通过罐洗小鼠肺泡，获得小鼠肺泡灌洗液，通过流式细胞术分析中性粒细胞占白细胞的比例和中性粒的数量，结果如图3所示，PAXN-1感染后小鼠肺泡中中性粒细胞的数量显著增加，同时在白细胞中所占的比例也明显增加，证明细菌感染肺脏成功，引发肺部炎症。

细菌感染12h、24h、48h后，处死小鼠取双肺置于10％中性福尔马林溶液中固定过夜，石蜡包埋切片(30μm)，HE染色。结果表明：病理切片显示实验组中部分肺泡结构消失，组织充血，大量炎性细胞浸润。肺泡隔增厚，肺泡代偿性肿大，大量炎性细胞浸润，如图4所示。通过该方法制作的铜绿假单胞菌感染BALB/c小鼠模型可引起显著的肺炎症状。

实施例5：铜绿假单胞菌全菌灭活疫苗的肺炎模型免疫保护评价

取冻存的铜绿假单胞菌菌株PA01、PABoston41501、PAR.Hugh813、PAHugh815、PANCTC6750、PAXN-1菌株，复苏活化后调整菌液浓度至OD₆₀₀值为1.0，加入浓度为4％的多聚甲醛，25℃处理48h后6000g/min离心5min，去除甲醛，制成全菌灭活疫苗。按照0天、14天、21天的免疫程序尾静脉注射免疫BALB/c小鼠，末次免疫后10～14天，采用生理盐水将实施例1获得的PAXN-1菌液调节至1.5×10¹⁰CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO₂吸入法安乐处死。

结果如图5所示：根据公式保护率计算公式:(对照组发病率-接种组发病率)/对照组发病率×100％,算得PA01全菌灭活疫苗的保护率为66.67％、PABoston41501全菌灭活疫苗的保护率为55.56％、PAR.Hugh813全菌灭活疫苗的保护率为77.78％、PAHugh815全菌灭活疫苗的保护率为55.56％、PANCTC6750全菌灭活疫苗的保护率为66.67％、PAXN-1全菌灭活疫苗的保护率为88.89％。

由此可见，本发明的方法能够有效感染小鼠，成功建立铜绿假单胞菌肺炎模型。感染后的小鼠模型稳定，可用于疫苗的评价和保护性机制研究。