一种尖孢镰刀菌及其在植物修复重金属污染土壤中的应用

摘要

本发明首先提供一种尖孢镰刀菌，其分类命名为镰刀菌属尖孢镰刀菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 11607，保藏日期为2015年11月30日。具体地，其ITS1?5.8S?ITS2序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供一种生物修复剂，包括如上所述尖孢镰刀菌。本发明还提供一种如上所述尖孢镰刀菌或生物修复剂在植物修复重金属污染土壤中的应用。本发明提供的植物内生真菌尖孢镰刀菌对重金属耐性强，对土壤重金属污染的修复既安全又环保。

说明书

技术领域

本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种尖孢镰刀菌及其在生物修复重金属污染土壤中的应用，特别涉及将其应用于强化植物富集提取重金属污染土壤中镉等重金属的方法。

背景技术

随着经济的快速发展，尚未得到有效处理的生产和生活废水、废气、废渣及其它废弃物急剧增加，不少有害物质源源不断地进入土壤并积累，土壤污染的总体形势严峻，对生态环境、农业安全和可持续发展产生较大影响。其中，矿冶活动是农田及农产品重金属超标的重要原因之一，矿产资源的开发利用导致矿区及其周边地区的土壤、地下水和作物的砷、铅和镉等重金属污染。污染物通过饮水和食物链传递危及居民健康，重金属污染事件呈高发态势。全国约有1.2万座尾矿库，其中危险库、病库占12.4％，对周围水和土壤环境污染严重，对居民的健康威胁十分突出。尽管可以罗列的土壤污染修复技术很多，但实际实用的很少。目前应用比较成熟的修复技术多是异位处置，多种原位修复技术尚处于研究开发阶段，包括化学修复、生物修复及农艺措施等。化学修复法在消耗大量的化学药剂的同时还产生二次污染，不适合大面积污染农田的修复，生物修复因为依靠微生物和植物自生的生态作用，既生态又环保、成本低、不产生二次污染备受学者和商家青睐。只有利用微生物与植物的功能，才能发挥生态系统循环消化功能，结合农艺措施和物理化学的方法，可以实现污染退化土壤的生态修复。

但本领域在重金属污染修复领域的微生物与植物协同修复方面所做的工作还不多。如中国专利CN201110377736.7涉及一种产ACCD的植物内生细菌及其土壤修复菌剂和应用。植物内生细菌Jp3-3，分类命名为PantoeaagglomeransJp3-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月13日，菌种保藏号为CCTCCNO:M2011250。土壤修复菌剂直接施用可促进植物生长并吸收重金属，强化植物修复重金属污染土壤(尤其是铜污染的土壤)的效率。

而中国专利申请CN201510708559.4提供一种由植物与降解菌联合修复镉及土霉素复合污染土壤的方法，所述方法包括采用盆栽试验，每盆装入镉、土霉素复合污染土壤种植孔雀草或紫茉莉种子，待种子发芽后，在植物根际土壤灌根接种土霉素高效降解菌菌液，采用温室栽培，植物生长到成熟期时将植物从污染土壤中整体移除，再多次反复种植该植物，直至土壤中的污染物达到土壤环境安全标准。该方法修复植物孔雀草或紫茉莉，植株生长强健，具有良好的观赏价值，且对镉具有良好的富集能力；具有成本低、易操作、无二次污染同时亦可美化环境的特点，对于土壤抗生素、重金属污染的防治和农产品安全生产具有重要理论和现实意义。

但对于微生物与植物协同修复重金属污染土壤的领域来说，还值得开发出更多有效且实用的修复方法。

发明内容

本发明首先提供一种尖孢镰刀菌，其分类命名为镰刀菌属尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，菌株号为J-2-1-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11607，保藏日期为2015年11月30日，保藏地为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体地，其ITS1-5.8S-ITS2序列如SEQIDNO：1所示。

本发明还提供一种生物修复剂，包括如上所述尖孢镰刀菌。

本发明还提供一种如上所述尖孢镰刀菌或生物修复剂在植物修复重金属污染土壤中的应用。

在一种具体的实施方式中，所述植物为美洲商陆，所述重金属包括镉、铅、锌以及锰中的一种或多种。

本发明还提供一种修复重金属污染土壤的方法，包括使用所述尖孢镰刀菌或生物修复剂协同植物进行土壤修复，其中，将所述尖孢镰刀菌或生物修复剂与植物种子拌匀撒播，或将所述尖孢镰刀菌或生物修复剂直接置于植物种子萌发或植物生长的土壤中，例如将述尖孢镰刀菌或生物修复剂直接置于植物幼苗生长的土壤中。

在一种具体的实施方式中，所述生物修复剂为固体菌剂，所述固体菌剂中还包含木屑、草糠、棉籽壳和泥炭藓中的一种或多种。

具体地：将该尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2制备成固体菌剂，捣碎成颗粒状，用于跟种子混合撒播于土壤，或直接置于植物幼苗生长的土壤中。施用固体菌剂后，土壤相对含水量维持在65％左右10天，以确保菌丝和种子或幼苗在土壤中成活。

其中，所述的固体菌剂按如下方法制备得到：以木屑(或草糠)加棉籽壳为培养基质、硝酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源、磷酸二氢钾为外源磷钾源，混合拌匀调整至65％的含水量，pH6.5，聚丙烯塑料袋分装，用套环和薄膜封口，120℃高温灭菌90分钟，得到固体培养基，接种尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2，25℃条件下培养30～35天，得到尖孢镰刀(Fusariumoxysporum)J-2-1-2固体菌剂，将培养好的菌剂捣碎成颗粒状，用于拌种或直接置于土壤中，使之感染植物根系。

本发明提供的植物内生真菌尖孢镰刀菌对重金属耐性强，对土壤重金属污染的修复既安全又环保。

本发明至少具有如下优点和积极效果：

1)尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2对促进植物吸收和积累重金属的效果较为显著，对强化植物提取土壤中重金属的效果较为显著，对减少土壤可交换态重金属含量有显著效果。

2)尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明中尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2的形态特征(宏观和微观)，

图2为本发明中尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)在美洲商陆根(图2A)和茎(图

2B)中的感染形态。

生物保藏

本发明提供的尖孢镰刀菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC11607，保藏日期为2015年11月30日。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。

上述菌株J-2-1-2是2013年在湖南省湘西自治州花垣县铅锌矿区电解锌冶炼废渣上生长状况良好的植物美洲商陆根部分离获得，研究发现该菌对美洲商陆在贫瘠、缺水、重金属污染较重土壤的荒地上生长有促进作用，能明显促进美洲商陆定植、抗旱和富集重金属。

尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2的菌落特征如下：

形态学特征观察表明：菌落在PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上生长较快，25℃，培养7天，直径8cm。绒毛状-絮状，白色-浅紫色(见图1)。分生孢子梗直接生于菌丝，不分枝或简单分枝。大型分生孢子镰刀形，小型分生孢子长椭圆形、肾形，柱形，0-3隔，无色，7～20μm×2.5～4μm。

菌株J-2-1-2的具体分离提取方法：

在冶炼废渣堆场选取生长良好的美洲商陆幼苗，采取其根部样品，长约150mm、直径约5mm，带回实验室，先用自来水洗净泥土，然后用无菌水清洗三遍，置于超净工作台。用灭菌后的解剖刀将美洲商陆根切成厚约1-2mm的切片，将根切片置于0.1％升汞溶液中浸泡1-2分钟消毒，取出根切片，用无菌吸水纸吸干水分，然后于酒精灯火焰上方，通过无菌操作，将根切片接种于灭菌的PDA培养剂上，封口包扎后，置于恒温箱中，25℃恒温培养，24小时后白色菌丝萌发，三天后转接提纯，待培养基表面布满白色菌丝，获得所分离菌种，用于鉴定和进一步培养和研究。经中国科学院微生物研究所鉴定，菌株J-2-1-2的rRNA基因的ITS1-5.8S-ITS2序列如序列表中SEQIDNO:1所示。

实施例1

配置含镉、铅、锰的PDA液体培养基，一组镉、锰和锌的浓度分别为10、100、100μM，另一组镉、锰和锌的浓度分别为50、500、500μM，还有一组不加任何重金属的PDA液体培养基做对照，每种处理浓度重复三个，将配制好的培养基置于200ml锥形瓶，封口，灭菌。冷却后，在无菌条件下接种尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2，25℃，培养20天，待菌丝体布满液体培养基，用滤网过滤，纯净水清洗数遍，吸水纸吸干水分，获得尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2菌丝体，80℃烘干至恒重，分析镉、铅、锰和锌含量，数据见表1。

同样，配置含镉、铅、锰的霍格兰氏营养液，一组镉、锰和锌的浓度分别为10、100、100μM，另一组镉、锰和锌的浓度分别为50、500、500μM，还有一组不加任何重金属的PDA液体培养基做对照，每种处理浓度重复三个，将配置好的营养液置于营养钵，用泡沫板打孔结合海绵支撑固定的方法将美洲商陆幼苗支撑在液体营养钵上进行培养，隔天换一次营养液，20天后分别取植物根、茎、叶样品，纯净水清洗后，80℃烘干至恒重，再用玛瑙研钵分别研磨成粉，用于分析镉、铅、锰和锌含量，数据见表1。

从表1可以看出，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2菌丝体富集重金属的能力很强，远超过相同浓度水培条件下的超富集植物美洲商陆根、茎、叶各部位对重金属的富集能力。

表1尖孢镰刀菌J-2-1-2与超富集植物美洲商陆对重金属富集能力的比较

实施例2

配置以木屑(或草糠)加棉籽壳为主的培养基质、硝酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源、磷酸二氢钾为外源磷钾源的固体培养基，水分调至65％，pH6.5，聚丙烯塑料袋分装，用套环和薄膜封口，120℃高温灭菌90分钟。冷却后，无菌条件下，将尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)J-2-1-2接种于该固体培养基，25℃，室内培养30～35天，制备成固体菌剂。

取冶炼厂废渣堆周边污染土壤，风干，捣碎，过20目筛，充分混合均匀，置于聚丙烯塑料袋，每袋2kg土，置于高压灭菌锅中，120℃高温灭菌90分钟，冷却后备用。

将塑料袋中的土置于消毒的塑料盆钵(2kg/盆)。将固体菌剂捣碎成颗粒状，跟美洲商陆种子混合，然后撒播于所准备的盆钵土壤中，土壤相对含水量维持在65％左右，以确保菌丝成活和种子萌发，以不加固体菌剂直接播种所培养的植物做对照，分别做6个重复。待种子萌发，观察根系感染情况，然后进行间苗，每盆留5株，植物生长20天，第一次取植物地上部样品，带回实验室，洗净，烘干，用于分析重金属含量；再过25天，再次取植物再生苗地上部分样品，再过30天第三次取植物三生苗地上部样品，同样分析植物重金属含量，结果见表2。

从表2可以看出，施用固体菌剂的美洲商陆地上部样品富集重金属能力显著高于没有施用固体菌剂的植物。此外，经过在同一土壤中三次种植美洲商陆后，虽然土壤中总镉、总铅、总锰、总锌的含量变化不大，但可交换态重金属的含量明显减少。

表2接种尖孢镰刀菌J-2-1-2对超富集植物美洲商陆吸收重金属的影响

此外，本领域技术人员知晓的，目前土壤中总重金属很难被有效提取出来，即使异位处置的方法也难以实现将重金属提出而基本不损害土壤其它成份。因而目前普遍提倡和推崇的技术是使用植物提取土壤中的重金属，再通过将重金属植物焚烧后所得灰分送入矿企冶炼以实现其有效回收和利用。因为使用植物修复重金属土壤的方法具有生态环保的效果，其一是通过特殊植物的种植可以修复重金属污染土壤的生态系统，促进该地区土壤的生态多样性，且防止重金属向地下水渗透和进入空气中作为扬尘的一部分；其二是通过特殊植物的种植可以逐步将土壤中的重金属导向植物中，在焚烧后可作为矿冶原料。

虽然像上述表2方案中种植1～3次施用菌剂的美洲商陆幼苗后，土壤中总重金属的含量变化不明显。但一个原因是在实验室条件下，美洲商陆只长到幼苗阶段，因而其植物干重与土壤总重间差距明显。第二个原因是在实验室条件下，土壤中重金属从稳定态向游离态的转变速度较慢，因而在连续三次种植施用菌剂的美洲商陆幼苗后，能从表2中看出美洲商陆对土壤中重金属的富集效率在下降。但将该菌种应用在室外美洲商陆的种植中后，一方面因为美洲商陆的植株总干重(尤其是多次种植后)与土壤干重的差别变小，另一方面室外生态系统有助于土壤中固定态重金属向游离态(可交换态)重金属转变，因而整体来说，可预期在室外连续种植施用菌剂的美洲商陆，将会有利于土壤中总重金属含量的实质改善。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。