一种测定棉花钾离子吸收动力学的方法

摘要

本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种测定棉花钾离子吸收动力学的方法，该方法具体为：将棉花幼苗固定在耗竭液中，在耗竭处理的0-1h，间隔5-10min取一次耗竭液样品；耗竭处理的1-10h，间隔30-60min取一次耗竭液样品；耗竭处理的10-30h，间隔2-4h取一次耗竭液样品，分别测定耗竭液样品中的钾离子浓度。通过对实验过程中的相关参数进行优化，尤其是对取样时间间隔的优化，绘制出的吸收曲线能够更加精准的反映棉花的钾离子吸收规律；该方法操作简单，精准度高，吸收动力学曲线平滑，为高效基因型棉花的准确筛选和钾肥的合理施用提供了理论依据。

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，尤其涉及一种测定棉花钾离子吸收动 力学的方法。

背景技术

钾是作物营养的三要素之一，与土壤有效性氮、磷相比，我国 农业土壤中有效性钾含量相对丰富，原来缺钾问题不很突出，但随 着农业生产的发展，作物产量提高，养分带走量增加，归还到土壤 中的养分锐减，传统农家肥和草木灰施用量减少，氮、磷化肥施用 增加，造成养分失调，出现不同程度的缺钾。缓解我国钾源短缺问 题的途径主要由如下两种：一方面依靠提高土壤钾素含量来获得作 物高产；另一方面选育高效品种使植物适应环境。人们通过长期的 研究发现，不同作物或同一作物的不同品种在同一肥力水平下产量 相差很大，这种差异就是不同基因型对环境适应性差异的具体表现， 同时也为优良基因型的开发利用提供了启示和契机。离子吸收动力 学是在20世纪50年代初开创和发展起来的，将米氏 (MichaelisMenten)学说及其方程解释植物对介质中离子吸收的动态 过程的一种理论，该方程中的参数I_max和K_m可定量地描述植物吸收 养分的特征，从而为比较品种间养分吸收特征提供了量化的指标， 可用来评价品种之间耐瘠的能力，因此受到重视。

离子吸收动力学用于植物对离子吸收的研究，为比较品种间养分 吸收特征提供了量化指标，然而在以往研究方法上采用离体的根在不 同的浓度的溶液进行短期的吸收试验，这种方法虽然也能获得有参考 价值的结果，但存在着诸多的不足之处，如离体根与整株植物的吸收 特性是有差别的、测定时要用许多植株样品等，必然存在较大的取样 差异。为了克服这些缺陷，ClaassenandBarber(1974)对完整的植株 植物进行较长时间的吸收试验，提出了离子吸收动力学研究的耗竭 法，通过定期测定溶液中的离子浓度，求出浓度随时间而变化的曲线 方程，经数学计算求出吸收动力学参数。但是大量的试验证明：动力 学参数并非恒定的参数，对于既定的养分离子，它们受许多因素的影 响如植物种类与品种、苗龄、养分的供应情况、PH(GlassandSiddiqi, 1984；Schenk,1996；Nissenetal.1974)等。

针对棉花而言，现有技术中对其钾离子吸收动力学测定采用的方 法是借鉴小麦、水稻等小棵作物的离子耗竭法，存在着作物株型较大 不易操作、吸收曲线波动较大等缺陷，因此，提出一种改良棉花钾离 子吸收动力学的方法很有必要。

发明内容

本发明的目的是针对棉花植株大不易测定，以及现有测定方法粗 糙不精准等缺陷，提供一种改良的测定棉花钾离子吸收动力学的方 法，该方法对测定过程中的相关实验参数进行调整，确立了形成不同 类型吸收曲线的实验条件。

本发明的技术方案之一是：一种测定棉花钾离子吸收动力学的方 法，所述方法为：在耗竭处理的0-1h，间隔5-10min取一次耗竭液样 品；耗竭处理的1-10h，间隔30-60min取一次耗竭液样品；耗竭处理 的10-30h，间隔2-4h取一次耗竭液样品，分别测定耗竭液样品中的钾 离子浓度。

所述固定为采用海绵将棉花幼苗根茎交接处包裹起来，通过海绵 将棉花幼苗固定在盛有饥饿液的容器中。

可采用本领域常规技术手段测定耗竭液中钾离子浓度，本发明优 选采用原子分光光度计进行测量。

现有的取样方法其取样点间隔时间较长，且耗竭实验持续时间较 短，存在着绘制出的曲线不平滑，且只有一个吸收平衡，吸收曲线不 能真正反映棉花吸收动态过程等缺陷。本发明对耗竭实验过程中的取 样时间间隔及取样持续时间进行了优化，即在耗竭实验开始阶段密集 采样，意外的发现对于一叶期和二叶期棉花幼苗而言，其钾离子吸收 动力学曲线存在着两个吸收平衡。

优选地，耗竭处理过程中，取样的时间间隔为：5,10,10,15,30, 30,30,30,30,60,60,60,60,60,60,60,120,120,180,180,240,240 min，采用此种时间间隔取样绘制出的钾离子吸收动力学曲线平滑， 能够更加精准的反映棉花的钾离子吸收规律。

耗竭处理的方法可采用本领域常规的技术手段，即将棉花幼苗固 定在耗竭液中，不断取样测定耗竭液的钾离子浓度。其中，所述耗竭 液可采用本领域常用的液体，本发明优选耗竭液为：4-6mmolL^-1MES、180-220μmolL^-1Ca₂SO₄，pH＝6.5-7.0，100-300μmolL^-1KCl进 一步优选为5mmolL^-1MES、200μmolL^-1Ca₂SO₄，pH＝6.8， 100-300μmolL^-1KCl。

耗竭液中钾离子通过氯化钾提供，其目的是为了避免其它离子的 引入对实验产生不利影响(如采用硫酸钾，由于耗竭液中本身含有硫 酸根，硫酸钾中的硫酸根会使耗竭液中的硫酸根浓度增高，如采用硝 酸钾，由于硝酸钾中的N元素为植物所需要的大量元素之一，其存在 可能影响同样是植物所需要的大量元素钾的吸收)，影响测定结果的 客观性和准确性。

现有技术中为了增加溶氧量及达到搅拌的目的，在测定植物的吸 收动力学时，一般是将实验体系放置在摇床上进行，此种方式适宜于 测定例如小麦、水稻等小棵作物的吸收动力学，对于棉花而言，由于 其植株较大，放在摇床上容易出现茎杆折断或枝叶受到损伤、取样不 方便等问题，最终影响测定结果的精准度。为了克服上述缺陷，本发 明将棉花固定在耗竭液中，通过向耗竭液中通入空气扰动耗竭液以打 到增加溶氧量及搅拌的目的。

优选地，在耗竭处理过程中，用小型充气泵持续向耗竭液中通入 空气，通入空气有助于促进根的有氧呼吸，为钾元素的吸收提供更多 的能量，同时也起到了搅拌作用，使耗竭液更加均匀，确保测定结果 的精准度。小型充气泵的功率以5-10W为宜，功率较高易使耗竭液蒸 腾过快或飞溅，而功率较低又起不到应有的作用。

为了确保测定结果的精准度和客观性，在耗竭处理前尽量使植株 体内过多的K⁺离子排出，消除体内K⁺的干扰，优选地，在耗竭处理之 前，还包括对棉花幼苗进行饥饿处理的步骤，所述饥饿处理的操作具 体为：将棉花幼苗固定在饥饿液中饥饿处理20-30h，每间隔8-10h更换 一次饥饿液。所述饥饿处理的优选操作为：将棉花幼苗固定在饥饿液 中饥饿处理24h，每间隔8h更换一次饥饿液。

同样地，饥饿处理过程中，持续向饥饿液中通入空气。

所述饥饿液可采用本领域常用的液体，本发明优选采用如下饥饿 液：4-6mmolL^-1MES，180-220μmolL^-1Ca₂SO₄，pH＝6.5-7.0，进一 步优选所述饥饿液为：5mmolL^-1MES，200μmolL^-1Ca₂SO₄，pH＝6.8。 为了避免在饥饿液中引入钾离子，在配制饥饿液时，采用低浓度的Tris 和HCl调节pH值。

现有技术中为了进行有效的饥饿，饥饿处理时间一般是36-48h， 但对于棉花而言，由于其植株较大，理论上需更长时间的饥饿处理； 但是，本发明在饥饿处理期间更换饥饿液，加快了K⁺离子的外排效果， 在饥饿处理结束时，更换的饥饿液中的K⁺浓度在5μmoll^-1以下，采用 本发明的饥饿处理手段，在20-30h便可有效的对棉花幼苗进行饥饿处 理。同时在饥饿处理过程中，增加了持续向饥饿液中通入空气搅拌溶 液的操纵，能够迅速的降低根系周围的K⁺离子浓度，也有利于提高 K⁺离子的外排效果。

本发明涉及到的棉花幼苗可以采用本领域公知的方法进行培 养，优选通过如下方法培养得到：将棉花种子消毒后，用去离子水 浸种过夜，选大小一致的露白种子，均匀播种于去离子水洗过的床 上，上面盖四层纱布，再覆一层沙子，发苗3-5天后将幼苗移至容 器内，用如下改良Hoagland营养液进行培养：2～3mMCa(NO₃)₂， 0.5～1.5mMMgSO₄，0.2～0.8mM(NH₄)H₂PO₄，1×10^-4～3×10^-4mM CuSO₄，0.5×10^-3～1.5×10^-3mMZnSO₄，0.05～0.15mMFeNaEDTA， 1×10^-23×10^-2mMH₃BO₃，4×10^-6～5×10^-6mM(NH₄)₆Mo₇O₂₄和 0.5×10^-3～1.5×10^-3mMMnSO₄，0.05mmolL^-1～2.5mmolL^-1K⁺，培养 过程中持续通入空气，每3-5天更换一次培养液。

优选地，所述改良Hoagland营养液为：2.5mMCa(NO₃)₂，1mM MgSO₄,0.5mM(NH₄)H₂PO₄，2×10^-4mMCuSO₄，1×10^-3mMZnSO₄， 0.1mMFeNaEDTA，2×10^-2mMH₃BO₃，5×10^-6mM(NH₄)₆Mo₇O₂₄和1×10^-3mMMnSO₄，0.05mmolL^-1～2.5mmolL^-1K⁺。

本发明还提供一种优选的测定棉花钾离子吸收动力学的方法， 包括如下步骤：

(1)将棉花幼苗固定在饥饿液中进行饥饿处理；

(2)将饥饿处理后的棉花幼苗移入耗竭液中进行耗竭处理，耗 竭处理过程中持续向容器内通入空气，按照如下时间间隔取耗竭液样 品，测定钾离子浓度：耗竭处理0-1h，间隔5-10min取一次样品；耗 竭处理1-10h，间隔30-60min取一次样品；耗竭处理10-30h，间隔2-4h 取一次样品，测定耗竭液中钾离子浓度；

(3)以耗竭处理时间为横坐标，耗竭液样品中钾离子浓度为纵 坐标绘制钾离子吸收动力学曲线。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合， 即得本发明各较佳实施例。

本发明所述试剂和物质均可市购获得。

本发明所述方法具有的优势是：

(1)通过对实验过程中的相关参数进行优化，完善了棉花钾离 子吸收动力学的方法；其中对取样时间间隔及取样持续时间进行了优 化，更加精准的反映棉花的钾离子吸收规律；

(2)在实验过程中用小型充气泵替代摇床，克服了茎杆折断或 枝叶受到损伤、取样不方便等问题；

(3)在饥饿处理过程中采用更换饥饿液和持续向饥饿液中通入 空气的措施，能够在较短的时间内有效对棉花幼苗进行饥饿处理；

(4)该方法操作简单，精准度高，绘制的吸收动力学曲线平滑， 为高效基因型棉花的准确筛选和钾肥的合理施用提供了理论依据。

附图说明

图1是不同耗竭液钾浓度条件下一叶期棉花幼苗的吸收曲线。

图2是不同耗竭液钾浓度条件下二叶期棉花幼苗的吸收曲线。

图3是不同耗竭液钾浓度条件下三叶期棉花幼苗的吸收曲线。

图4是不同耗竭液钾浓度条件下五叶期棉花幼苗的吸收曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施 例中涉及到的棉花幼苗通过如下方法培养得到：

供试材料为中棉所35，由中国农业科学院棉花研究所提供；试 验在光照培养室内进行，光照强度为450μmolm^-2s^-1，光照时间为 14h，白天温度为30℃±2℃，夜间温度为20℃±2℃。种子用9％的 双氧水消毒30min，清水漂洗数次后用去离子水浸种过夜，选大小 一致的露白种子，均匀播种于去离子水洗过的床上，上面盖四层纱 布，再覆薄沙一层。发苗4天后将幼苗转移至体积为32cm×26cm×32 cm的塑料方盒中，分别用含有不同钾浓度(低钾胁迫0.05mmolL^-1和充足供钾2.5mmolL^-1)改良的Hoagland营养液进行培养；营养 液配方为(mM)：2.5mMCa(NO₃)₂，1mMMgSO₄,0.5mM (NH4)H₂PO₄，2×10^-4mMCuSO₄，1×10^-3mMZnSO₄，0.1mMFeNa EDTA，2×10^-2mMH₃BO₃，5×10^-6mM(NH₄)₆Mo7O24和1×10^-3mM MnSO₄。每盒移入6株幼苗，每个浸种处理3株。24h通气，每4d 更换一次营养液；对比排列，每处理重复6盒。试验重复4次以上。

实施例1一叶期棉花幼苗的钾离子吸收动力学测定

饥饿处理：选择在充足供钾2.5mmolL^-1(高钾)条件下培养得 到的一叶期、具代表性生长一致的棉花幼苗6株(组间重量相差不超 过2g)，3株作为一个重复(3个重复)，将幼苗根系用去离子水冲洗 干净，吸水纸擦干水分。取三角瓶，每个三角瓶放600mL饥饿液(5 mmolL^-1MES、200μmolL^-1Ca₂SO₄，pH＝6.8)，将幼苗根茎交接处用 海绵包裹在一起，固定于三角瓶中进行24h的饥饿处理(每8h换一 次饥饿液)；在此过程中应特别注意避免使根系受到损伤，同时向三 角瓶中保持通气状态。

耗竭处理：饥饿处理24h后，将棉花幼苗从饥饿液中取出并用吸 水纸吸干根系水分，放入盛有600ml不同钾浓度的耗竭液(用饥饿液配 制，钾离子由氯化钾提供，浓度分别为106μmolL^-1,163μmolL^-1,210 μmolL^-1)的三角瓶中，并固定于三角瓶中进行耗竭实验(避免根系受 到损伤)；同时计时，分别在不同的时间点从三角瓶中吸出0.5mL置 于标好号的1mL离心管中；取样的时间间隔设置为：5,10,10,15,30, 30,30,30,30,60,60,60,60,60,60,60,120,120,180,180,240,240 min。为了保持棉花幼苗根系的活力以及使耗竭液更加均匀，应持续 向三角瓶中保持通气状态；同时，为弥补由于蒸发散失的水分，由饥 饿液补充使其维持固定的耗竭液体积。耗竭实验结束后，通过原子吸 收分光光度计(SpectAA-50/55，Varian，Australia)测定耗竭液中钾浓 度。

绘制曲线：以耗竭时间为横坐标，钾离子浓度为纵坐标绘制曲线， 结果如图1所示。

实施例2二叶期棉花幼苗的钾离子吸收动力学测定

本实施例的操作方法同实施例2，其区别仅在于耗竭液中钾离子 浓度和苗龄不同，本实施例耗竭液中钾离子浓度分别为：162μmol L^-1，204μmolL^-1，252μmolL^-1，苗龄为二叶期幼苗，绘制得到的吸 收动力学曲线如图2所示。

实施例3三叶期棉花幼苗的钾离子吸收动力学测定

本实施例的操作方法同实施例2，其区别仅在于实验所用的材料 不同；本实施例所用的材料为：在低钾胁迫0.05mmolL^-1(低钾)和 充足供钾2.5mmolL^-1(高钾)条件下培养到三叶期的棉花幼苗；绘 制得到的吸收动力学曲线如图3所示。

实施例4五叶期棉花幼苗的钾离子吸收动力学测定

本实施例的操作方法同实施例3，其区别仅在于实验所用的材料 为五叶期幼苗，绘制得到的吸收动力学曲线如图4所示。

由图1和图2可知，一叶期幼苗在三种不同的耗竭起始浓度条件下 的吸收曲线均表现出两个吸收过程，出现明显的分阶段吸收现象；其 中当耗竭液浓度降低大约25μmol时，一叶期幼苗的三条吸收曲线达 到平衡；吸收平衡持续大约420min后又表现出下一个的吸收过程。 二叶期幼苗在三种不同的耗竭起始浓度条件下的吸收动力学曲线也 表现出类似的情况；但是二叶期幼苗吸收较多的钾离子后吸收曲线才 达到平衡，且吸收平衡持续的时间也较一叶期幼苗短(240min)。

由图3和图4可知，在252μmol起始耗竭液浓度条件下，不同 钾条件培养的三叶期和五叶期幼苗的吸收曲线均为一个吸收过程， 没有出现明显的分阶段吸收现象；低钾培养的幼苗吸收速率大于高 钾条件培养的幼苗，且随着苗龄的增长，不同钾浓度培养幼苗间的 吸收曲线差别在逐渐降低。

综合上述，一叶期和二叶期幼苗的吸收均表现出明显的分阶段 吸收过程且与耗竭液浓度无关，可能是由于棉花幼苗较小，对于钾 的需求比较低所造成的；三叶期和五叶期幼苗对钾的需求较高，吸 收曲线没有出现明显的分阶段现象。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。