利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法

摘要

本发明提供一种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下步骤：取新鲜的胚性愈伤组织加酶液酶解；原生质体分别进行IOA钝化和UV钝化，得受体原生质体和供体原生质体按1︰1混合，依次加入PEG融合诱导液、高Ca

说明书

技术领域

本发明属于葡萄体细胞杂交技术领域，具体涉及一种利用原生质体不对称融合技术 获得葡萄杂种植株的方法。

背景技术

植物有性杂交仅限于部分亲缘关系较近的栽培种与野生种之间或种内，有些植物的 有性生殖能力很低甚至不具备，所以很难通过有性杂交的方式来改良与培育新品种，严 重限制了育种工作的进展。我国南方葡萄常规育种的方法包括杂交育种、引种、实生选 种、诱变育种以及芽变选种等。而植物体细胞杂交技术则可以通过异源原生质体的融合， 广泛地重组植物界优良的遗传性状，克服远缘有性杂交不亲和性，缩短育种年限，扩大 基因重组范围，为创造新型植物开辟了广泛的应用前景，也为植物育种和创造育种材料 开创了一条全新的途径，因而已开始应用于农作物、蔬菜、果树、中药材以及其他植物 的品种改良，并且获得了种间、种内、属间的杂种体细胞或胞质杂种。利用细胞融合技 术育种是进行葡萄种质资源创新的一条有效途径，可以缩短葡萄的育种年限，提高育种 效率，创造新的品种和类型。有关葡萄原生质体融合方面的研究报道还很少，筛选适宜 的基因型是葡萄原生质体能否培养成功的重要因素，在葡萄原生质体培养研究中进行了 大量的基因型筛选，而最后仅有少量的基因型材料获得再生植株，还处于摸索阶段。对 葡萄原生质体培养的最适条件，原生质体钝化的最佳剂量，原生质体融合的最佳PEG 浓度、融合后杂种体细胞的培养以及植株再生的相关适宜条件等都研究的不多，还没有 形成成熟的技术体系。

授权公告号为CN101139582A的中国发明专利公开了一种利用原生质体不对称融 合技术获得香蕉体细胞杂种的方法。该方法是将香蕉胚性悬浮细胞在酶解液中进行酶解 获得原生质体，受体原生质体用碘乙酰胺进行处理，供体原生质体用紫外灯进行照射处 理，将供体原生质体和受体原生质体混合后，用聚乙二醇法进行融合。融合产物悬浮于 原生质体液体培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体细胞胚诱导培养基上进行 培养，直至体细胞胚萌发，再进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。授权公告号为 CN102505004A的中国发明专利公开了一种草莓原生质体的提取及融合的方法。该方法 是以草莓的叶片为研究材料，通过前处理和酶解相结合的方式获得高活力的原生质体， 利用30-45％PEG6000结合高Ca²⁺，高pH的方法诱导两者融合，提高了原生质体一对 一融合的概率，分离的原生质体活力在85％以上，一对一融合率最高可达到11.7％。授 权公告号为CN104429939A的中国发明专利公开了一种利用二倍体细胞与花粉细胞融 合育种法培育三倍体霍山石斛的方法。

葡萄较其他果树在原生质体培养以及植株再生技术方面的研究进展缓慢，而且是被 公认的难于进行植株再生和遗传转化的果树品种之一。有关葡萄原生质体分离纯化、培 养以及融合方面存在极少成功范例。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种利用原生质 体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法。该方法以葡萄胚性愈伤组织为材料，对原 生质体的分离纯化、原生质体的培养、原生质体的融合、杂种细胞的选择、杂种细胞的 培养等进行研究。本发明初步建立起了葡萄原生质体的培养和融合技术体系，为培育葡 萄新品种、增强葡萄的抗性、提高葡萄品质奠定了基础，具有十分重要的理论和实际应 用价值。

本发明所采用的技术方案为：

一种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下操作步骤：

(1)原生质体的分离和纯化：取新鲜的胚性愈伤组织加酶液，在26-28℃、黑暗条 件下，60-70r/min振荡酶解2-12h，然后分离纯化得到葡萄原生质体；

(2)原生质体的的钝化处理：

(a)IOA钝化：取步骤(1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质 体密度为0.5-1×10⁵个/mL的悬浮液，然后加入1︰5配比(体积比)的4.0-8.0mmol/L 碘乙酰胺(IOA)溶液钝化处理9-11min，处理完后使用CPW溶液洗涤2-3遍，用KM₈P 液体培养基悬浮，将原生质体密度调整为0.5-1×10⁵个/mL，得到受体原生质体；

(b)UV钝化：取步骤(1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体 密度为0.5-1×10⁵个/mL的悬浮液，在1250-1350μW/cm²紫外光照强度下照射0.5-16min， 得到供体原生质体；

(3)原生质体的融合：将步骤(3)(a)得到的受体原生质体和步骤(3)(b)得 到的供体原生质体按1︰1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1-4倍亲本悬浮液体积的 PEG融合诱导液，在25-30℃下保温15-30min，再加入2-4倍亲本悬浮液体积的高Ca²⁺- 高pH溶液，混合后在25-30℃下保温10-15min，然后使用CPW溶液洗涤2-3遍，离心 得到融合的杂种细胞；

(4)融合体细胞的培养：使用KM₈P固体培养基包埋培养步骤(3)得到的融合杂 种细胞，在25-27℃、黑暗条件下静置培养，直至长出再生胚性愈伤组织颗粒；

(5)再生胚性愈伤组织胚状体的诱导：将再生胚性愈伤组织颗粒转接至分化培养 基上诱导胚状体，直至长出不定芽，再将不定芽转接到生根培养基上培养；

(6)炼苗与移栽：当组培苗长到5-7cm、且根系生长旺盛时，将组培苗移栽入炼 苗室中进行炼苗，即得到体细胞杂种植株。

所述步骤(1)中酶液的配方为：2.50％(g/100mL，下同)纤维素酶、0.25％果胶 酶、0.75％离析酶、0.40mol/L甘露醇、0.1％MES(2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸)，pH5.8。

所述步骤(1)中每1g胚性愈伤组织加酶液的量为10mL。

所述步骤(3)中PEG融合诱导液的配方为：以CPW溶液为基液，每100mL中含 PEG30-50g、CaCl₂·2H₂O150mg、KH₂PO₄10mg、甘露醇3g。

所述步骤(3)中高Ca²⁺-高pH溶液由甘氨酸-NaOH缓冲液和Ca(NO₃)₂溶液等量混 合而成。其中所述甘氨酸-NaOH缓冲液的配方为：甘氨酸3.75g/L、甘露醇15g/L，并 使用0.2mol/LNaOH溶液调pH至9-10.5；所述Ca(NO₃)₂溶液的浓度为94.4g/L。

所述步骤(5)中分化培养基的配方为含6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L的MS培养基，pH5.8。

所述步骤(5)中生根培养基的配方为含萘乙酸(NAA)1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA) 0.5mg/L^-1的1/2MS培养基，pH5.8。

所述CPW溶液的配方为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)27.2mg/L、硝酸钾(KNO₃)101.0 mg/L、二水合氯化钙(CaCl₂·2H₂O)1480.0mg/L、七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)246.0 mg/L、碘化钾(KI)0.16mg/L、五水合硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg/L。

原生质体从分离纯化、培养、胚状体诱导以及到再生植株的过程极其漫长复杂，这 一过程中的各个步骤对原生质体的培养及植株再生都有着决定性的作用。合适的基因 型、原生质体的分离材料、渗透压稳定剂的浓度、酶解时间、离心转速和时间、培养温 度以及pH值等都对植株再生有一定的影响，以上这些影响因素在原生质体的培养过程 中影响也较大。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)以葡萄胚性愈伤组织分离的原生质体为材料，比叶片、茎段、普通愈伤组织 等分离的材料分化能力更强，更易获得再生植株，且取材方便，不受时间、季节等气候 条件的限制，可根据需要随时进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养；

(2)采用的原生质体培养基为KM₈P培养基，比MS、B₅、D₂以及CPW-13M等培 养基的Ca²⁺浓度高，NH⁴⁺浓度低，碳源丰富，原生质体生长所需的各种营养物质丰富， 如维生素、水解酪蛋白、微量元素等，因此，取得了较好的培养效果；

(3)受体和供体原生质体在融合前分别进行钝化处理，可达到只有融合产物才能 够再生植株，因此所获得的再生植株绝大多数为杂种，可减少培养过程的工作量及后期 对杂种的筛选和鉴定工作；

(4)原生质体融合采用的是不对称的融合方式，所获得的杂种植株为不对称杂种；

(5)本发明步骤简单，耗时短，对设备和培养条件的要求较低，有效地解决了葡 萄原生质体培养及融合困难的问题，为建立起葡萄原生质体分离纯化、培养以及融合的 成熟技术体系提供了一定的理论依据和技术支持。

附图说明

图1所示的是本发明胚性愈伤组织分离的原生质体照片；

图2所示的是本发明葡萄原生质体融合的照片；

图3所示的是本发明葡萄原生质体培养的照片；

图4所示的是本发明葡萄胚性愈伤组织体细胞胚的照片；

图5所示的是本发明葡萄原生质体经融合获得的杂种植株照片；

图6所示的是本发明葡萄杂种植株生根炼苗的照片。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性 的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术 语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

本实施例利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下步骤：

1.葡萄原生质体的分离和纯化

原生质体的分离是原生质体培养成功的一个重要环节，原生质体的酶解不仅受到分 离材料的影响，而且还与酶的种类和浓度、酶解时间、温度、pH、渗透压及其他因素有 关。如表1、表2列出不同的纤维素酶、果胶酶、离析酶、甘露醇及酶解时间对原生质 体分离数量和活力的影响。

本发明将预做原生质体分离的新鲜的胚性愈伤组织置于黑暗中培养24h，取1g愈 伤组织加10mL酶液，27±1℃、黑暗条件下60-70r·min^-1，振荡酶解2-12h。在原生质 体酶解过程中，从酶解后2h开始取样，之后每隔2h再取样1次放于倒置显微镜下观 察原生质体酶解情况并计数，至原生质体数比前一次所计个数不再增加时停止酶解。

酶解结束后，在超净工作台上把混合液依次通过200目和400目不锈钢细胞筛，去 除未酶解彻底的组织，用1-2mL的CPW溶液洗涤网，收集滤液置于15mL无菌离心管 中，在700r·min^-1下离心8min，使原生质体沉降。离心结束后弃去上层酶液及微小细 胞残片，剩余1-2mL左右的沉淀，用移液枪吸取10mLCPW溶液沿离心管壁缓慢加入 悬浮管底的原生质体。悬浮液700r·min^-1离心8min.，弃去上清液，再用CPW溶液洗 涤1-2次。沉淀重悬于1-2mL原生质体洗涤液后铺层于15mL无菌离心管内5mL CPW-23S蔗糖液层上，500r·min^-1离心5min，轻轻吸取0与CPW23S蔗糖界面的原生 质体，转至15mL无菌离心管中5mL洗涤液内，在700r·min^-1下离心8min，去除上清 液，再用CPW溶液洗涤2-3次。最后，再加入CPW溶液，制成原生质体悬浮液，再根 据需要调节密度(10⁵-10⁶左右)后备用。

表1各因素对葡萄原生质体分离数量的影响

由表1可以看出，不同的组合对原生质体酶解数量的影响不一样，以10号组合的 效果最好，原生质体的产量达12.33×10⁵个·mL^-1。由极差分析可以得出，不同处理组合 对葡萄原生质体的酶解数量影响差异显著。各因素水平对原生质体酶解数量影响的大小 顺序为：R(果胶酶浓度)>R(纤维素酶浓度)>R(甘露醇浓度)>R(酶解时间)>R (离析酶浓度)，说明5个因素中果胶酶浓度对原生质体酶解数量影响最大，其次是纤 维素酶浓度、甘露醇浓度、酶解时间和离析酶浓度。各因素的最优水平分别是甘露醇浓 度第一水平，酶解时间第二水平，果胶酶浓度和离析酶浓度第三水平，纤维素酶浓度第 四水平。

表2各影响因素对葡萄原生质体分离活力的影响

由表2可以看出，不同的试验组合对葡萄原生质体活力的影响不一样。以3号组合 的效果最好，原生质体的活力最高为76％。由极差分析可以得出，不同处理组合对葡萄 原生质体活力的影响差异显著。各因素水平对原生质体活力影响的大小顺序为：R(酶 解时间)>R(离析酶浓度)>R(甘露醇浓度)>R(果胶酶浓度)>R(纤维素酶浓度)， 说明5个因素中酶解时间对原生质体活力影响最大，其次是离析酶浓度、甘露醇浓度、 果胶酶浓度，最后是纤维素酶浓度。各因素的最优水平分别是甘露醇浓度第一水平，酶 解时间第三水平，纤维素酶浓度第一水平，果胶酶浓度第一水平和离析酶浓度第一水平。

结合以上数据和分析，最终确定本发明酶液配方如下：2.50％纤维素酶、0.25％果胶 酶、0.25％离析酶、0.40mol/L甘露醇、0.1％MES，pH5.8。酶解时间最佳为6h。

本发明胚性愈伤组织分离的原生质体照片如图1所示。

2.葡萄原生质体的IOA和UV钝化处理

(1)碘乙酰胺(IOA)能够破坏细胞质中的细胞器，导致细胞质失活。IOA溶于 KM₈P液体培养基中，试验设置5个浓度梯度(1，2，4，8，16mmol·L^-1)，pH值均调 至5.8，溶液经0.45um微孔滤膜过滤灭菌后放于4℃冰箱备用。将醉金香葡萄原生质体 分别用不同浓度的IOA黑暗4℃条件下静置钝化处理10min，使其细胞质失活，夏黑葡 萄原生质体不做处理。或者夏黑原生质体钝化处理而醉金香原生质体不做处理。处理后 的原生质体700r·min^-1离心5min，离心后弃上清液，用CPW溶液洗2-3遍后，加KM₈P 培养基洗涤一次，最后将钝化后的原生质体用KM₈P液体培养基悬浮，原生质体密度调 整为1×10⁵个·mL^-1备用。取1滴原生质体悬浮液于载玻片上测定其活力，其余转入小培 养皿(直径6cm)中。以KM₈P为基本培养基，27±1℃黑暗条件下进行低熔点琼脂糖固 体包埋培养，以不做钝化处理的为对照。每隔2d放置于倒置显微镜下观察其形态及分 裂情况。

表3不同IOA浓度对醉金香原生质体的影响

从表3可知，不同浓度的IOA处理对醉金香原生质体活力的钝化作用差异显著。经 1.0，2.0，4.0，8.0mmol·L^-1IOA处理后，醉金香原生质体活力分别比对照下降了33.8％， 52.2％，74.96％和76％，表明醉金香原生质体对IOA十分敏感。随着IOA浓度的增加， 原生质体细胞的破碎程度呈加大趋势。经4.0mmol·L^-1IOA处理后99％左右的醉金香原 生质体都被灭活且细胞破碎程度不是很高。说明4.0mmol·L^-1IOA能有效钝化醉金香葡 萄的原生质体。

(2)夏黑葡萄的胚性愈伤组织经分离纯化后，将其原生质体密度调成1×10⁵个·mL^-1， 分别吸取1mL夏黑原生质体于无菌塑料小培养皿(直径3cm)中，使其刚好铺成一层 并做好记，将小培养皿放入紫外线灯箱(有2根15W紫外灯，箱底距紫外灯管25cm) 中连续照射0.5min，1min，2min，4min，6min，8min，16min，每个处理5皿，重 复3次。照射后分别取1滴原生质体悬浮液于载玻片上测定其活力，其余转入小培养皿 (直径6cm)中。以KM₈P为基本培养基，27±1℃黑暗下进行低熔点琼脂糖固体包埋培 养，以不做钝化处理为对照。每隔2d放置于倒置显微镜下观察其形态及分裂情况。

表4不同UV处理时间对夏黑原生质体的影响

从表4可以看出，不同浓度的UV处理对夏黑葡萄原生质体活力的钝化作用差异显 著。经0.5min，1min，2min，4min，6min，8min，16minUV处理后，夏黑原生质 体活力分别比对照下降了18.5％，33.9％，51.9％、59.5％、65.5％，70.8％和76％。随着 UV照射时间的延长，UV对夏黑原生质体活力的钝化作用增强，且细胞破碎程度加深。 其中8minUV照射处理原生质体的细胞破碎程度开始增大，如再延长处理时间会增强 原生质体的钝化，出现更多的原生质体细胞死亡、破碎。因此，UV照射8min能有效 钝化夏黑葡萄的原生质体。

将IOA(醉金香)和UV(夏黑)钝化处理后的原生质体按体积比1：1在离心管中 混合备用。

3.葡萄原生质体的融合

本发明采用PEG-高pH-高Ca²⁺法诱导葡萄原生质体的融合，影响PEG融合的因素 主要有PEG的种类、分子量、处理时间、浓度、原生质体的密度以及生理状态等。PEG 融合法所需设备简单，操作简单，处理量大，没有明显的融合特异性。PEG融合法的不 足之处在于处理时间较长，操作过程比较复杂，对原生质体融合时所需的密度较大，而 且对原生质体的伤害也较大。因此，试验过程中要严格控制各因素对原生质体融合的影 响。

本发明将PEG的浓度设置为20％，30％，40％，50％。用小试管进行融合处理时， 取混合好的两亲本原生质体悬浮液0.5-1mL，吸取1-2mL的PEG融合诱导液沿小试管 壁缓慢加入，同时转动小试管，使PEG溶液与原生质体充分接触，促使原生质体相互 粘连。此过程在25-30℃下约需15-30min，镜检可以看到两亲本原生质体聚集粘连。保 温后，用同样的方法加入约2mL的高Ca²⁺-高pH溶液，混合后保温约10-15min。

表5PEG浓度对细胞融合的影响

从表5可知，随着PEG浓度的增加，异源融合率呈先上升后下降的变化，其中PEG 浓度为40％时，融合率最大，为7.8％，但高于40％以后，融合率下降。但当PEG浓度 为50％时，融合产物不能存活，大量的原生质体破碎，逐渐死亡。由于PEG本身对原 生质体具有一定的毒性，为减少其对融合产物生长发育的副作用，选择40％的PEG浓 度作为醉金香和夏黑原生质体融合的适宜浓度，此时多数原生质体呈一对一融合，异源 融合率为7.8％。

根据以上试验，最终确定本发明PEG融合诱导液的配方为：以CPW溶液为基液， 每100mL中含PEG30-50g、CaCl₂·2H₂O150mg、KH₂PO₄10mg、甘露醇3g。

高Ca²⁺-高pH溶液由甘氨酸-NaOH缓冲液和Ca(NO₃)₂溶液等量混合而成，其中甘 氨酸-NaOH缓冲液的配方为：甘氨酸3.75g/L、甘露醇15g/L，并使用0.2mol/LNaOH 溶液调pH至9-10.5；Ca(NO₃)₂溶液的浓度为94.4g/L。

本发明葡萄原生质体融合的照片如图2所示。

4.融合体细胞的培养

将融合后的杂种细胞，加入KM₈P液体培养基调节密度至1×10⁵个·mL^-1，以KM₈P 为基本培养基，采用低熔点琼脂糖固体包埋的方法培养原生质体，封口膜封口后在培养 箱中25℃恒温暗培养。由胚性愈伤组织分离的原生质体在KM₈P培养基上6-7d左右原 生质体复壁，14-15d左右出现第一次分裂，20-25d出现第二次分裂，65-70d左右出现 肉眼可见小愈伤组织。葡萄原生质体培养的照片如图3所示。

5.再生胚性愈伤组织胚状体的诱导

逐步、即时将再生胚性愈伤组织颗粒转接至分化培养基MS+6-BA0.1mg·L^-1+ NAA0.1mg·L^-1上诱导胚状体，在25℃下暗培养2周后移置光照强度为1000-1500lx下 培养，照光1周后生出不定芽，再将不定芽转接到生根培养基1/2MS+NAA1.0mg·L^-1+ IBA0.5mg·L^-1上培养。葡萄胚性愈伤组织体细胞胚的照片如图4所示。

6.炼苗与移栽

当组培苗长到5～7cm，且根系生长旺盛时，将组培苗放在炼苗室中进行炼苗6～9d， 开瓶炼苗分阶段进行，即首先松盖2～3d，然后部分开盖2～3d，最后完全揭去盖。逐步 使试管苗适应温室环境，以防止叶片萎蔫。用镊子轻轻将试管苗从瓶中取出，放在水中 彻底清除根部的培养基，然后用0.1％的多菌灵浸泡根部10～30min后，移入经灭菌后的 基质中。移栽后浇透水，喷施除去有机物的1/2MS营养液，并附上塑料膜保持相对湿度。 在移入基质后的第5d、10d、15d、20d去掉附上的塑胶膜进行敞开炼苗，并在相同条 件下取小苗的叶片，观察叶片的气孔大小。移栽前期用除去有机物的1/2MS对小苗进行 喷雾，当小苗茎杆颜色加深，叶片油亮时或长出新叶后用自来水浇灌。葡萄原生质体经 融合获得的杂种植株照片如图5所示。炼苗过程见图6。

本发明实施例涉及的CPW溶液配方：磷酸二氢钾27.2mg/L、硝酸钾101.0mg/L、 二水合氯化钙1480.0mg/L、七水合硫酸镁246.0mg/L、碘化钾0.16mg/L、五水合硫酸 铜0.025mg/L。

本发明实施例涉及到的主要培养基如表6所示；所使用的主要试剂有a-萘乙酸 (NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、盐酸(HCL)、氢氧化钠(NaOH)、 琼脂、无水乙醇、甘露醇、甘露醇、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硝酸钾、二水氯化钙、七 水硫酸镁、碘化钾、五水硫酸铜、蔗糖、硼酸、肌醇、叶酸、柠檬酸、苹果酸、生物素、 水解酪蛋白、纤维素酶(Cellulase)、离析酶(Macerozyme)、果胶酶(Pectolyase)、2- (N-吗啡啉)乙磺酸、低熔点琼脂糖、聚乙二醇6000(PEG)、甘氨酸、Ca(NO₃)₂·4H₂O、 碘乙酰胺(IOA)等；所使用的主要仪器有高压蒸汽灭菌锅、雷磁Phs-3c精密pH计、 电子分析天平、超净工作台、微量移液器(Eppendorf)、人工气候箱、水浴冷冻恒温振 荡器(LSHE-300D)、普通光学显微镜(OLYMPUSDp70.)、倒置显微镜(NikonMODEL C-LEDS)、荧光倒置显微镜(NikonECLIPSETi-S)、血球计数板、细胞筛、低速离心机 (TDL-40B)等；其他用到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合原生质 体不对称融合技术领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰 也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改 变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

表6MS和KM₈P培养基配方(mg/L)