一种固定化单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用

摘要

本发明提供了一种结合牢固、酶活损失少的固定化单胺氧化酶，并用于酶催化合成(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物。相对于其它方法，本发明制备所得的固定化酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，氧化-加成过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化单胺氧化酶，该固定化单胺氧化酶的制备方法，以及该固定化单胺氧化酶作为催化剂在不对称合成手性氮杂双环化合物中的应用。

背景技术

酶是一类由生物体产生的具有催化功能的生物大分子物质，作为一种生物催化剂，酶在常温常压的温和条件下能催化各种有机化学反应。酶催化具有高效性，比一般催化剂的效率高出10⁷～10¹³倍；酶催化具有很高的专一性，可以减少或避免副反应，得到很高纯度的产物；酶催化反应还具有很高的立体选择性和区域选择性，无需保护与脱保护。酶的这些优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。但是，由于酶绝大多数属于蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素(温度、压力、电磁场等)、化学因素(氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH等)和生物因素(酶修饰和酶降解等)均有可能使其丧失生物活性。即使在最适条件下，酶也会逐渐失活，随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降；此外，反应后酶不能回收，只能采用分批法进行生产，这对于现代生物催化工业来说，成本较高。

为了解决以上问题，人们设计了一种固定化酶，就是将酶束缚于某种特殊的介质中，使它与反应体系分开，但仍能与底物进行分子交换。这种固定化酶与一般的固体化学催化剂一样，既具有催化特性，又具有能回收、反复使用等优点，生产工艺也可以实现连续化、自动化。

固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法与共价结合法。其中，吸附法又可以分为物理吸附法与离子吸附法两种，该方法条件温和，酶活损失少，易于再生，但是固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺、尼龙膜或硝酸纤维素微囊包埋，该方法一般较为温和，酶活性损失少，但是传质阻力很大，不利于较大分子或很低溶解度底物的催化。交联法中用得最多的是戊二醛交联，一般操作较为简便，但是反应剧烈，酶活损失大；而且机械性能差，颗粒度细，难以分离。共价结合法常用芳胺载体的重氮化反应、羟基载体的溴化氰-亚胺碳酸盐反应、羧基载体的羰二亚胺反应、巯基载体的二硫键交换反应等，由于其结合牢固、稳定性好等特点，是目前研究与应用最为广泛的一类方法。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大(一般残余酶活在30％左右)。

博昔普韦(boceprevir)及特拉匹韦(telaprevir)是丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂，其化学结构式如下所示：

Ⅲ期SPRINT-2研究显示，与标准治疗相比，24周的博昔普韦标准治疗可提高HCV基因1型初治患者的SVR率。博昔普韦标准治疗24周与博昔普韦标准治疗44周的抗病毒疗效相似。片段A是合成博昔普韦的关键中间体之一，片段A的结构如下：

目前关于片段A主要有如下合成路线：

路线1：WO2007075790公开了利用6,6-二甲基-3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮将内酯内酰胺化、羰基还原、还原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的盐，具体反应路线如下所示：

由于此路线中的氰基加成利用了硝酸银、氰化钾和盐酸，成本较高，对于后处理和三废处理也带来了很大困难，不利于工业化生产。

路线2：文献(JournalofMedicinalChemistry,2006,Vol.49,No.20,6074-6086)中公开了一种以3-苯基四氢吡咯[1,2-c]恶唑-5(1H)-酮为原料，经过去氢、环丙烷化、开环、还原、氧化等一系列反应得到关键片段A，具体反应路线如下所示：

由于此路线中的还原反应采用了氢化锂铝和钯碳，反应条件苛刻，后处理较为繁琐，也不利于工业化生产。

路线3：WO2004113295公开了使用6,6-二甲基-3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮为原料，经过醇解、酰胺化、还原酰胺基和酯基、将氨基保护后氧化醇成醛、成环、氰基化、水解、去保护得到片段A的盐酸盐，具体反应路线如下：

虽然此路线具有起始原料价廉易得的优点，但该路线在制备(1R,3S)-3-氨甲基-2,2-二甲基环丙烷基甲醇时需采取二级还原反应，即，首先利用选自铝烷、在三甲基硅烷基氯存在下的硼氢化锂或硼氢化钠还原酯基，再使用氢化铝锂或三乙酰氧基硼氢化钠还原酰胺基，上述还原反应条件剧烈，温度要求苛刻，反应时间较长，后处理繁琐，安全性低，以致影响了该路线的工业化应用。

路线4：文献(J.Am.Chem.Soc.2012,134,6467-6472)公开了利用来自黑曲霉(Aspergillusniger)的单胺氧化酶的消除-加成反应制备(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2-腈的方法，如下所示：

该方法通过单胺氧化酶将前手性的胺氧化为手性亚胺，在NaHSO₃存在的条件下生成加成产物；后者与NaCN反应得到手性的亚胺加成产物(如上)，后者甲醇解得到氨基酸甲酯盐酸盐。该法立体选择性地构建了3个手性中心，比化学方法简便、易于操作、对环境友好；但是亚胺产物易挥发且闪点较低，需要额外加入NaHSO₃，步骤较为繁琐。

片段B是合成特拉匹韦的关键中间体之一，片段B的结构如下：

目前关于片段B的合成路线主要有如下路线：

路线1：EP0600741公开了如下路线：

由于由该路线合成得到的目标物存在于油状混合物中，需经过硅胶柱层析分离才能得到纯品，不仅后处理繁琐，而且无法实现规模化生产。

路线2：WO0218369公开了如下路线：

由于该路线采用DIBAL-H还原，不仅试剂成本较高，而且制备条件苛刻(需在-78℃下反应)，因此此路线也不适合于工业化生产要求。

路线3：CN101463001中公开了如下路线：

该路线使用了剧毒的羰基钴，不仅成本太高，而且无法满足环保要求，因此该路线也不能满足产业化要求。

路线4：WO2008090819公开了如下路线：

由于该路线的起始原料难以合成、不能批量购得，因此也不适合工业化生产要求。

发明内容

本发明针对单胺氧化酶在酶催化过程中分离困难，以及酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，将商品化的环氧树脂依次用亚胺基二乙酸(IDA)、硫酸镍进行衍生化，得到酶固定化载体，而后用单胺氧化酶进行固定化。该固定化方法反应温和，酶活基本无损失。运用该固定化酶与氧化剂对底物前手性化合物氮杂双环化合物进行氧化反应，然后与MR发生加成反应制备(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物，可以重复利用5批次，且分离简单。

本发明的内容之一是提供了一种重组单胺氧化酶，其是由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列编码。

制备上述的重组单胺氧化酶的方法，包括：将包括SEQNo.2所示的单胺氧化酶基因的质粒和pET28a载体用同样的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收双酶切片段，经T4DNA连接酶连接，形成重组表达质粒pET28a-BYK-MAON；将该重组表达质粒pET28a-BYK-MAON转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，即可获得本发明的基因工程菌株，即E.coliBL21(DE3)/pET28a-BYK-MAON；将基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-BYK-MAON接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.7～0.9时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃，即可表达所述的重组单胺氧化酶。

本发明的内容之二是提供了一种酶固定化载体。

将氨基树脂加到乙二醇二缩水甘油醚中形成环氧树脂，而后置于100mM亚胺基二乙酸(IDA)，pH7.0～10.0(更佳地为pH7.5)的20mM磷酸钠缓冲液中，20～80℃(更佳地为60℃)反应0.5～2小时后，先后用水洗涤，接着用40mMNiSO₄溶液重悬、过滤后用水进行洗涤，即得到酶固定化载体。

在一个特定的实施方案中，本发明所述的氨基树脂是上海华震公司的氨基树脂，特别是型号为355的氨基树脂。

本发明的内容之三是提供了一种固定化单胺氧化酶。

该固定化单胺氧化酶是将本发明的重组单胺氧化酶固定于本发明的酶固定化载体上得到的。

将上述所得的重组单胺氧化酶的pH为7.5的50mM的磷酸钠缓冲溶液，加入1～10倍重量(更佳地为5倍重量)的固定化载体，室温搅拌2～6小时，过滤洗涤即得固定化酶。所得的固定化酶酶活力达到13U/g，回收率为68.4％。

本发明的内容之四是提供了本发明的单胺氧化酶或固定化单胺氧化酶在催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物中的应用。

上述应用中，所述的氧化-加成反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的前手性化合物为氮杂双环化合物，即式I所示的化合物：

其中，R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；n选自0～5的整数。

所述的前手性氮杂双环化合物在固定化单胺氧化酶作用下与氧化剂发生氧化反应，然后与MR发生加成反应生成(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物，即式II所示的化合物：

其中，

R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；n选自0～5的整数；

R选自-CN，-SCN、-SO₃Na、-SO₃H；

M选自碱金属、碱土金属、H。

本发明所述的氧化-加成反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述步骤：在本发明所述的固定化单胺氧化酶和过氧化氢酶的催化下，所述的前手性氮杂双环化合物和MR在pH6.0～8.0的水溶液中，与氧化剂进行不对称氧化-加成反应，形成光学手性纯的取代产物。

其中，所述的前手性氮杂双环化合物在反应液中的较佳浓度为100～1000mmol/L。本发明的固定化单胺氧化酶的用量较佳地为25～250g/L。MR的用量较佳的为100～1200mmol/L。过氧化氢酶的用量为催化有效量，较佳为0.01～0.1g/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在6.0～8.0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸氢二钠缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的氧化-加成反应在室温下进行，较佳地为20～50℃，更佳地为20～35℃。所述的氧化-加成反应的时间较佳地以底物剩余浓度低于5％为准。氧化-加成反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：针对单胺氧化酶在酶催化过程中分离困难，以及已报导的酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，提供了一种结合牢固、酶活损失少的固定化酶，并用于酶催化合成(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物。相对于其它方法，本发明制备所得的固定化酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，氧化-加成过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1单胺氧化酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增的单胺氧化酶基因。

图2单胺氧化酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准，泳道1为全菌蛋白裂解液。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中的材料来源为：

pET28a-BYK-MAON由本公司构建。

氨基树脂335购自上海华震科技有限公司。

pET28a表达质粒、E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受态细胞、2×TaqPCRMasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

实施例1固定化载体的制备

在搅拌下将100克上海华震公司型号为335的氨基树脂，缓慢加到200mL的5％(v/v)的乙二醇二甘油醚的甲苯溶液中，60℃搅拌反应1小时，先后用甲苯与水洗涤，而后置于350mL的含100mM亚氨基二乙酸(IDA)的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，60℃反应2小时，过滤后用水洗涤，再用200mL的40mM硫酸镍溶液重悬，室温搅拌30min，过滤后用水洗涤，即得固定化载体。

实施例2重组单胺氧化酶表达转化体的制备

根据中国专利申请号201410441595.4构建包含单胺氧化酶BYK-MAON(ORF核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示)的重组表达载体pET28a-BYK-MAON。将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，转化条件45℃，热击45秒，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体E.coliBL21(DE3)/pET28a-BYK-MAON，菌落PCR验证阳性克隆。

实施例3重组单胺氧化酶的表达

将实施例3所得的重组E.coliBL21(DE3)/pET28a-BYK-MAON接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有200mLLB培养基的500mL三角瓶中，置37℃、200rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，26℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH7.5的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组单胺氧化酶的粗酶液。用Bradford法测定蛋白浓度。粗酶液与沉淀一起经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组蛋白以可溶的形式存在。将粗酶液用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。

实施例4固定化酶的制备

将20g实施例4中所得的重组单胺氧化酶的冻干粗酶粉用2LpH7.5的50mM磷酸钠缓冲溶液重悬，加入100g实施例1所得的固定化载体，室温搅拌4小时，过滤，用水洗涤，即得固定化酶。

实施例5游离单胺氧化酶与固定化酶酶活力的测定

苯甲醛做标准曲线，范围为0.1mM～0.5mM。酶活定义为1分钟内苯甲醛生成1μmol所需的酶量为1U。

1mL5mM苄胺溶液(50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)加入0.02g固定化酶或者100μL游离酶，在30℃反应10min，之后加入400μLDNPH混匀再加入2400μLNaOH溶液，反应5min，在450nm处测定吸光值。

表1游离酶与固定化酶的酶活力

编号 酶 酶活收率(％) 比酶活(U/g) 1 游离酶 100 19.6 2 固定化载体制得的固定化酶 68.4％ 13

实施例6固定化单胺氧化酶的生物催化

在20mL磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH7.5)中加入10g固定化单胺氧化酶，接着缓慢滴加16mL含1.57mol/L前手性化合物6,6-二甲基-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷和2.25mol/LNaHSO₃的磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH7.5)，加入终浓度为0.1g/L的过氧化氢酶。通入纯氧，保温25℃，反应24h。反应结束按照实施例5的方法测定反应的转化率和残余酶活。

表2不同批次固定化酶催化氧化-加成反应转化率与残余酶活

批次 反应时间(h) 转化率 残余酶活 1 24 >95％ 98％ 2 24 >95％ 97％ 3 24 >95％ 95％ 4 24 93％ 91％ 5 24 90％ 89％

实施例7～11固定化酶的生物催化

基本按照实施例6所述的方法，测试不同批次的固定化酶催化各种底物氧化-加成反应的转化率与残余酶活(如表3所示)。

表3不同批次固定化酶催化多种底物氧化-加成反应转化率与残余酶活

实施例12酯解反应

将1.36g(1S,3aR,6aS)-八氢环戊[c]吡咯-1-腈溶于20mL甲醇中，0～10℃下滴加氯化氢-甲醇溶液15mL，室温搅拌反应2小时，反应结束后减压蒸干溶剂，得到(1S,3aR,6aS)-八氢环戊[c]吡咯-1-甲酸甲酯盐酸盐1.91g，收率92.3％。