一种利用虾蟹下脚料制备调味品原料的方法

摘要

本发明公开了一种利用虾蟹下脚料制备调味品原料的方法，包括以下步骤：步骤一、制备虾头粗酶及虾头酶；步骤二、虾头粗酶酶解虾壳；步骤三、虾头酶酶解蟹壳及蟹脚。本发明利用从虾头中的提取的虾头粗酶水解虾蟹下脚料制备海鲜味调味料。本发明虾蟹酶解液中含有人体所必需的多种氨基酸，营养价值高，利用其制备成的产品，产品中的氨基酸和矿物质等营养物质利于人体的吸收。冷冻干燥后的酶解液可添加于各类食品，如海鲜调味料、食用色素、儿童及孕妇的营养米糊等。

说明书

技术领域

本发明涉及养殖加工的技术领域，尤其涉及一种利用虾蟹下脚料制备调味品原料的方法。

背景技术

我国拥有蕴含着巨大潜能的丰富渔业资源的黄金海岸线，总长度超过3.2万公里位于全世界第四。随着时代进步，国民越来越越重视生活质量和身体健康，因此，鱼虾蟹等健康产品需求量与日俱增，我国的渔业迎来了难得的发展春天。其中，渔业生产中的副产物的深加工是我国渔业发展的新方向和新机遇。例如，在生产虾仁和蟹肉等产品中，积累了大量虾蟹下脚料。据相关专业研究，虾头和虾壳中含有15％左右的几丁质，蛋白质含量为30％左右，剩余的为矿物质元素、脂溶性维生素A和维生素E等，其中钙的含量最为丰富达35％左右，其次为磷为4％-5％。虾壳和虾头中的蛋白质含有必需的八种必须氨基酸。除赖氨酸的含量略低，其他七种必须氨基酸含量均达到人体必须氨基酸的需求的最低要求。蟹下脚料中的蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸、卵磷脂、类胡萝卜素、脑磷脂、甲壳素、纤维素等营养成分含量丰富，还有有钙、镁、磷等微量矿物质以及各种氨基酸。因此，虾蟹下脚料是极好的工业加工原材料可运用到各个方面，具有较高的商业利用价值。如果能将这些加工下脚料进行综合利用而不是简简单单的抛弃，一方面可以给企业带来经济效益，另一方面也会减少环境污染。

随着虾蟹产业的蓬勃发展，虾蟹副产物的回收再利用也成为各界的研究的热点。目前的研究主要集中在采用各种方法将虾蟹下脚料中的蛋白，色素和油脂等，回收再利用，再加工适当的深加工，制成高营养，低成本的新产品。

陈利梅等人用柠檬酸和氢氧化钠处理虾壳，制备不含蛋白质和钙的甲壳素。段杉等人探究乳酸菌的自溶作用对于虾头和虾壳中的蛋白质回收的方法。IslemYounes利用从鲉内脏中提取的碱性蛋白酶去除虾壳中的蛋白质以制备甲壳素。

在传统工业加工蟹肉、蟹黄等蟹产品时会产生的大量的蟹下脚料，其中数量最多的是蟹脚，蟹的背壳。蟹下脚料的开发时目前的一个科研热点，许多科研工作者围绕着蟹下脚料开发用途多样的产品。比如，范建风等人以梭子蟹下脚料为原材料，在不同反应阶段添加不同的商业酶，用以提取蟹下脚料中的抗氧化肽和抗菌肽。王晓倩等人探究梭子蟹中天然色素的提取、纯化方法，用以替代人工合成色素。以及陶学明利用无水乙醇作为溶剂提取梭子蟹下料中的蟹油作为保健品的原料。

张连富等人以虾壳蛋白酶解液为原料，再添加适当比例的木糖和葡萄糖制成具有浓浓虾风味的调味料。陈海华等人通过响应曲面法优化紫贻贝酶的最佳酶解条件制备海鲜味调味料。任仙娥等人先用的水提取虾壳中的蛋白，剩余的虾壳再用木瓜酶提取蛋白，提取液再经浓缩等制备海鲜味调味料。

虽然近年来，国内外对于虾蟹的综合利用取得了较大的进步，但是仍然有加工步骤较为繁琐，转化为工业生产可行性低等缺点。通过实验探求操作性高，步骤简单，成本低的虾蟹下脚料制备海鲜味调味品生产方法，对于渔业产业线的升级和完善有着重大的意义。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种利用虾蟹下脚料制备调味品原料的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用虾蟹下脚料制备调味品原料的方法，以解决现有技术中虾蟹下脚料被大量浪费的问题。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种利用虾蟹下脚料制备调味品原料的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备虾头粗酶及虾头酶：

将虾头捣碎，加入缓冲液，用冷冻离心机在12000r/min、4℃下离心20min，离心完后经8层滤布过滤以除去脂肪，取上清；将上清静置2小时后再在12000r/min、4℃下离心20min，制得虾头粗酶；

将所制得的虾头粗酶，缓慢加入饱和质量分数为80％的硫酸铵溶液，4℃下静置2h后，再在12000r/min、4℃下离心20min，弃上清液；在沉淀中加入少量缓冲液溶解，用3.5Kda孔径大小的透析袋透析24h，制得虾头酶，在-20℃下保存备用；

步骤二、虾头粗酶酶解虾壳：

将虾壳解冻，经烘干、粉碎后，加入虾头粗酶进行酶解，酶解条件为：时间4-8h，pH3.5-6.5，温度30-50℃，加酶量500-2300U/g，酶解液进行灭酶活后脱腥处理，再经液固分离，浓缩干燥后，制成海鲜调味品原料；

步骤三、虾头酶酶解蟹壳及蟹脚：

将蟹壳及蟹脚解冻，经烘干、粉碎后，加入虾头酶进行酶解，酶解条件为：时间5-9h，pH3.5-6.5，温度30-50℃，加酶量1475-1878U/g，酶解液进行灭酶活后脱腥处理，再经液固分离，浓缩干燥后，制成海鲜调味品原料。

作为实施例的优选方式，所述步骤二中，酶解条件为：时间7h，pH6.0，温度40℃，加酶量1678.93U/g。

作为实施例的优选方式，所述步骤三中，酶解条件为：时间7h，pH6.0，温度40℃，加酶量1678U/g。

本发明利用从虾头中的提取的虾头粗酶水解虾蟹下脚料制备海鲜味调味料。首先利用简单的捣碎和冷冻离心，从虾头中提取的内源性虾头粗酶；然后采用虾头酶分别酶解虾壳、蟹壳及蟹脚制备各种调味品原料。虾蟹酶解液中含有人体所必需的多种氨基酸，营养价值高，利用其制备成的产品，产品中的氨基酸和矿物质等营养物质利于人体的吸收。冷冻干燥后的酶解液可添加于各类食品，如：海鲜调味料、食用色素、儿童及孕妇的营养米糊等。

附图说明

图1虾头酶液的SDS-聚丙烯胺凝胶电泳；

图2时间对于虾头酶液水解度的影响；

图3加酶量对于虾酶解液水解度的影响；

图4不同加酶量酶解液的电泳分析图；其中，M：Marker，1：虾壳(反应前)，2：虾头酶液(反应前)，3：酶解液(加酶量为1229.475U/g)，4：酶解液(加酶量为1721.265U/g)，5：酶解液(加酶量为2213.055U/g)，6：空白酶解液(不加虾壳，反应后)；

图5pH对虾头酶液水解度的影响；

图6温度对虾头酶液水解度的影响；

图7最佳酶解条件下虾头粗酶水解虾壳的电泳图；其中，M：Marker，1：虾头粗酶液，2：虾壳酶解液(最优条件下)；

图8最优酶解条件下，虾头粗酶水解蟹脚的电泳图；其中，M：Marker，1：虾头粗酶液(反应前)，2：蟹脚(反应前)，3：虾壳酶解液(最优条件下)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式以对本发明作进一步说明。实施例所用的原料：虾头：由厦门市集美区农贸市场购买的新鲜南美对虾，经剥离虾头收集得到；虾壳：来自于福建省漳州市漳浦县黄仓开发区盈丰食品有限公司，虾仁加工中产生虾壳下脚料；蟹脚：来自于福建省漳州市漳浦县黄仓开发区盈丰食品有限公司，蟹肉加工中产生蟹下脚料。

实施例1制备虾头粗酶及虾头酶

将虾头捣碎，加入缓冲液，用冷冻离心机在12000r/min、4℃下离心20min，离心完后经8层滤布过滤以除去脂肪，取上清；将上清静置2小时后再在12000r/min、4℃下离心20min，制得虾头粗酶；

将所制得的虾头粗酶，缓慢加入饱和质量分数为80％的硫酸铵溶液，4℃下静置2h后，再在12000r/min、4℃下离心20min，弃上清液；在沉淀中加入少量缓冲液溶解，用3.5Kda孔径大小的透析袋透析24h，制得虾头酶，在-20℃下保存备用。

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法测定虾头酶的分子质量，以标准蛋白Marker(14.3-97.2kDa)作为标准对照。其中，SDS-PAGE的分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。

从图1中可以知道，在分子量14.3-97.5kDa中，虾头内源性蛋白粗酶液中存在多条条带。因此，虾头酶粗液可能是由多种蛋白酶组成的，值得继续研究其对于虾壳和蟹脚的水解效果。

实施例2虾头粗酶酶解虾壳

将虾壳解冻，经烘干、粉碎后，加入虾头粗酶进行酶解，酶解条件为：时间4-8h，pH3.5-6.5，温度30-50℃，加酶量500-2300U/g，酶解液进行灭酶活后脱腥处理，再经液固分离，浓缩干燥后，制成海鲜调味品原料；

本发明考察了时间对虾头粗酶水解度的影响，在保持加酶量为658.71U/g、pH为5和温度为40℃的酶解条件下，选取6个不同时间(4、5、5.5、6、6.5、8h)分别考察其对于水解度的影响。由图2可知，随着反应时间的增长，体系中的底物减少，反应产物增加，底物和酶之间的有效碰撞减少，水解度在6.5小时之后变化缓慢。因此，选取6.5小时为反应时间。

本发明在保持时间为6.5h、pH为5.5，温度为35℃的酶解条件下，考察了加酶量对于水解度的影响。实验结果见图3。在酶促反应当中，当底物中酶的浓度接近饱和时，其反应速度变化将变缓。有关文献报道，采用商业酶时，当酶的浓度过高时，会导致酶之间的相互抑制和水解，使酶活降低。而在本实验中，由于虾头酶只经过粗提取，酶液中还含有大量的虾头自身的蛋白，导致水解度会随着加酶量的增加而一直增加。从图3中可以看出，当加酶量从0-1000U/g时，水解度上升迅速。当加酶量从1229.475-2213.055U/g时，水解度上升变缓。因此，最大的加酶量应在1229.475-2213.055U/g之间，为了进一步确定，采用SDS-PAGE分析酶解液酶解程度，结果如图4。随着加酶量的增加，位于66.4-97.2kDa间的蛋白被酶解，其中第4泳道中的蛋白水解最为彻底，第5泳道中29.0kDa以下又出现了蛋白，可能是因为虾头酶液自身蛋白酶解所致。因此，选用加酶量为1721.265U/g为宜。

本发明在加酶量为658.71U/g，时间为6.5h，温度为40℃的酶解条件下，改变体系的pH，考察其对于水解度的影响，实验结果见图5。从图5中看出，当pH小于5.5时，水解度随pH的增加而增加，当pH为6.5时水解度降低。因此，最佳pH为5.5。

本发明在加酶量为658.71U/g、酶解时间为6.5h、pH为5.5的酶解条件下，在不同温度下考察了其对于虾头酶水解情况的影响，结果如图6所示。从30℃至35℃时，水解度增加迅速，在35℃时达到第一峰值。从40℃开始，水解度随着温度增加而缓慢增加。在实验过程中发现，在35℃反应条件下的酶解液具有较浓的虾香味，而在与35℃相似水解度的45℃条件下，有臭味。并且出于实际生产中低碳减排的考虑，选取35℃为最佳反应温度。

以上单因素条件优化结果，确定了一个较适宜的虾头酶酶解虾壳的反应条件：时间为6.5h、pH为5.5、温度为35℃及加酶量为1721.265U/g。但是，单因素实验无法考察不同因素之间的相互作用，为此，本发明人进一步采用响应曲面方法获得最佳的酶解条件。

在单因素实验结果的基础上，采用Box-Behnken设计原理(BBD)，以虾头粗酶液水解虾壳的酶解液的水解度为响应值，选取时间、pH、温度、加酶量四个相互独立响应因素，从而进行四因素三水平分析。采用响应曲面方法，优化后的结果为，所述酶解最优条件为：时间7h，pH6.0，温度40℃，加酶量1678.93U/g。

本发明在酶解最优条件下，对酶解液进行了电泳分析，如图7所示，通过泳道1和泳道2中的条带的对比，可以知道经过虾头酶液的水解，酶解液中的分子量为97.5-44.3左右的蛋白被水解的比较彻底。泳道2中分子量从44.3至14.3左右的蛋白条带颜色较浅。因此，在最优的酶解条件下，虾头粗酶能高效的水解虾壳，使虾头和虾壳中的蛋白水解成氨基酸和小肽。

实施例3虾头酶酶解蟹壳及蟹脚

将蟹壳及蟹脚解冻，经烘干、粉碎后，加入虾头酶进行酶解，酶解条件为：时间5-9h，pH3.5-6.5，温度30-50℃，加酶量1475-1878U/g，酶解液进行灭酶活后脱腥处理，再经液固分离，浓缩干燥后，制成海鲜调味品原料；

同理，本发明人对虾头酶酶解蟹壳及蟹脚也进行了单因素试验及响应面分析，最终确定所述酶解最优条件为：时间7h，pH6.0，温度40℃，加酶量1678U/g。在此条件下，SDS-PAGE检测结果，如图8所示。

其中，泳道1和2为反应前虾头酶和蟹脚，泳道3为虾头酶酶解液。通过这三条泳道的对比，可以发现水解的蛋白主要集中在分子量40-120kDa之间。

本工艺流程对多个产品的生产工艺进行合理的组合，使得虾蟹加工下脚料得到充分的利用。一方面，该工艺流程充分利用了虾加工下脚料中自身含有的内源酶进行生产过程中酶解过程，从而大大降低了生产成本；另一方面，本发明均采用酶解法生产调味品原料，其与现有技术中的溶剂提取法和酸碱提取法相比，条件更为温和，且不会产生二次污染，更适合于工业生产。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。