一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方法及应用

摘要

一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方法及应用，该神经支架包括胶原支架、培养在胶原支架上的神经干细胞、以及由肝素固定在胶原支架上的生长因子，所述的生长因子具有肝素结合域，制备时在交联前先将胶原溶液进行冻干，再将冻干后得到的胶原海绵浸没于交联溶液中进行交联，利用肝素将生长因子固定在胶原支架上，维持神经干细胞活性或促进神经干细胞增殖。本发明的制备方法取材方便，步骤简单，避免了酸碱中和、透析等复杂步骤，减少了胶原材料接触有害试剂的机会，所获得的神经支架安全性提高，可以根据需要塑造成不同形状，用于填补神经组织缺损及桥接神经断端，引导神经生长，从而促进神经损伤修复及功能恢复，并且具有良好的稳固性。

说明书

技术领域

本发明属于神经再生生物学领域，具体涉及一种用于神经损伤修复的 神经支架、其制备方法及应用。

背景技术

神经系统损伤主要包括脊髓损伤、脑损伤、周围神经损伤，后果严重， 其治疗一直是研究热点。神经系统损伤发病率随着经济及交通的发展逐年 增高，已经越来越引起临床医生及科研学者的重视。

神经系统一旦发生病变，恢复程度有限，治疗效果欠佳，长久以来， 神经系统疾病在经过传统的治疗后，仍有一部分仍留有严重的后遗症，因 此，选择一种外源性的物质替代已经彻底损伤的组织，促使残存的神经组 织再生，成为攻克神经系统疾病的主要思路。

伴随着生物组织工程的发展，组织工程在神经损伤治疗中具有重要的 地位。胶原材料来源丰富并且具有诸多优点，比如，较好的可降解性、生 物相容性、其低免疫性及可修饰性，而被广泛应用于组织工程。研究表明， 胶原蛋白可以促进神经元的分化；体外实验研究显示，胶原蛋白可以促使 背根神经节的轴突再生，因此，胶原可作为营养因子或者药物的载体，从 而在组织工程中起到协同的应用效果，被广泛应用在神经再生工程中。

现有技术中生产胶原材料时，通常胶原组织需要溶解于醋酸中，若需 要得到固态胶原材料，通常需要碱性溶液将醋酸中和，而中和后生成的盐 分混杂在溶液中，因而需要进一步通过透析除去其中盐分，因此，目前使 用的胶原材料生产方法复杂，成本较高。

然而，单纯使用载体材料不能有效修复神经损伤。近些年，研究神经 干细胞逐渐成为治疗神经系统疾病的热点，在神经再生工程中，修复损伤 的组织时，需要在胶原材料制成的载体上负载起到修复作用的神经干细 胞，神经干细胞是具有自我更新能力与多向分化潜能的一类细胞，具有可 塑性能，它可完成特定的神经功能，分化成体内特定神经功能的细胞，具 有定向分化潜力。神经干细胞移植术是将体外培养和诱导分化的神经干细 胞，通过手术方式移植到颅内某部位达到修复、重建神经功能的过程。在 体外培养的神经干细胞进入体内后分化、增殖和定向迁移，并与人体自身 的神经细胞整合，最终达到修复受损的神经，重建部分或者完全的神经功 能。

在神经再生工程中，移植入宿主体内的神经干细胞能向神经系统所在 病变部位趋化、游走并且聚集，能够生存、增殖分化为神经元和神经胶质 细胞，从而促进患者缺失功能的恢复，然而，前期的研究显示，神经干细 胞在异体移植后由于免疫反应等，存活率很低，因此，神经干细胞的利用 率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方 法及应用，取材方便，制备方法简单，可以获得根据不同需要塑造成不同 形状的神经支架，提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强细胞对神经损 伤的修复作用，将该神经支架用于填补神经组织缺损及桥接神经断端，引 导神经生长，从而促进神经损伤修复及功能恢复，并且具有良好的稳固性。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种用于神经损伤修复的神经支架，包括胶原支架、培养在胶原支架 上的神经干细胞、以及由肝素固定在胶原支架上的生长因子，所述的生长 因子具有肝素结合域。

本发明所述用于神经损伤修复的神经支架的制备方法，包括如下步 骤：

1)配制胶原溶液

获取动物胶原组织，将其溶解于0.05～0.1％冰醋酸-PBS(v/v)中，配 制成胶原溶液；

2)冻干、灭菌

将胶原溶液倒入模具中，再将模具放入液氮冷冻，然后用冻干机冻干， 冻干时间为8～12小时，得到胶原海绵，再进行灭菌处理；所述的胶原海 绵为三维胶原材料，孔径为30～200μm；

3)交联、洗涤

将肝素溶解于交联溶液中，将灭菌的胶原海绵浸没于含肝素的交联溶 液中进行交联，交联温度30～40℃，交联时间3～4小时，交联结束后用磷 酸缓冲盐溶液洗涤4～8小时，再用去离子水洗涤4～8小时；

其中，所述的交联溶液为浓度为1～25mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐和1～12.5mM的N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液；

4)成型

将交联后的胶原海绵吸去水分，浸没于生长因子溶液中成型，成型温 度30～40℃，成型时间0.5～2小时，获得胶原支架；其中，所述的生长因 子具有肝素结合域；

5)培养神经干细胞

将神经干细胞原代培养在步骤4)得到的胶原支架上，获得所述的神 经支架。

进一步，步骤1)中获得的胶原溶液中胶原的浓度为5～20mg/ml。

优选地，步骤2)中利用电子束辐照对胶原海绵进行灭菌处理，处理 条件为6～12kGy⁶⁰Co。

进一步，步骤3)中含肝素的交联溶液中，肝素的浓度为2～4mg/mL。

又进一步，步骤4)所述的生长因子溶液中生长因子的浓度为50～500 μg/mL。

优选地，步骤4)中所述的生长因子为碱性成纤维细胞生长因子或血 管内皮生长因子。

进一步，步骤5)中将神经干细胞经Hoechst标记后，再培养在胶原 支架上，神经干细胞的个数为5～10×10⁵个，所获得的神经支架为神经导 管或圆形、椭圆形、方形或不规则海绵状神经支架。

本发明的0.05～0.1％冰醋酸-PBS(v/v)是指在PBS(磷酸缓冲盐溶液) 中含有体积分数为0.05～0.1％的冰醋酸。

本发明的神经支架应用于神经损伤修复，特别是用于修复脊髓损伤或 修复面神经损伤，除适用于神经损伤修复外，也可用于修复周围神经损伤 及其他组织损伤。

本发明制备的胶原海绵为三维胶原材料，可调节其孔径在30～200μm，以 用于细胞生长和组织修复，并且可以通过模具塑造为不同的形状以适于不同 的神经损伤修复。

本发明使用生长因子与神经干细胞共同促进神经再生，提高神经干细 胞在损伤局部的数量，增强了神经干细胞对神经损伤的修复作用，并且， 生长因子自身能促进神经损伤修复。

本发明的神经支架中，将肝素交联在胶原海绵上，并通过肝素对具有 肝素结合域的生长因子的高亲和力，将生长因子固定在胶原海绵上，以控 制生长因子的释放速度，防止生长因子扩散，避免生长因子因体液冲刷后 大量扩散而造成的流失，同时，固定在胶原海绵上的生长因子一方面自身 能更有效的促进神经损伤修复，另一方面能给神经干细胞提供营养或促进 神经干细胞增殖，提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强了神经干细胞 对神经损伤的修复作用，与神经干细胞共同促进神经损伤修复。

本发明的神经支架中，生长因子通过肝素固定后不易扩散，因此能减 少因扩散带来的副作用，固定的生长因子自身能在治疗局部形成有效浓 度，能促进神经损伤修复。

当生长因子为碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowth factor，bFGF)时，bFGF在胚胎发育过程中能促进中胚层和神经内胚层细 胞的大量增殖，而且在不同的增殖和分化过程中起着调节作用。将碱性成 纤维细胞生长因子加在神经横断伤的近端能够防止损伤后背根神经节中 感觉神经元的死亡。除此之外，在损伤的部位，碱性成纤维细胞生长因子 能够促进轴突再生和血管再生，促进再生的神经纤维通过神经缺损的近远 端。碱性成纤维细胞生长因子被广泛应用于神经修复，神经干细胞直接用 于周围神经损伤处能分化为施万细胞状的细胞，能够分泌神经营养因子， 促进神经再生，本发明将bFGF通过肝素固定在神经支架中，控制其释放 速度。

除此之外，固定的bFGF能促进神经干细胞增殖和维持神经干细胞活 性，而神经干细胞也能有效地促进神经损伤修复，因此，在本发明神经支 架中固定的bFGF和神经干细胞能起到协同作用，促进神经干细胞增殖， 提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强神经干细胞对神经损伤的修复作 用，共同促进神经损伤后的修复，因此，本发明含bFGF和神经干细胞的 神经支架能有效促进神经再生和功能恢复。

本发明通过使用冻干机将溶于醋酸的胶原溶液直接冻干，得到胶原海绵， 其为生长因子和神经干细胞的载体，采用冻干后对其进行交联的方法，避免 了酸碱中和、透析等复杂过程，并可通过不同的胶原浓度调整胶原海绵的孔 径，交联时，交联剂通过催化分子内的羧基和氨基反应进行交联，又称为“零 长度交联剂”，交联后提高了胶原纤维的张力和稳定性，交联剂为1-(3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，EDC/NHS。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1)本发明的神经支架，原料取材方便，制备过程简单，通过利用肝素 将生长因子进行固定，控制生长因子的释放速度，防止生长因子在体液的 冲击下扩散，从而将生长因子固定在损伤局部，在损伤局部达到治疗浓度， 同时，固定的生长因子能有效促进神经支架中神经干细胞的存活，或者促 进神经干细胞增殖，使损伤局部神经干细胞达到更有效的治疗数量，增强 了神经干细胞对神经损伤的修复作用，支架中的神经干细胞和生长因子共 同促进神经再生，从而使得神经损伤修复效果较常规方法更加显著。

2)本发明的制备方法中，使用鼠尾制备胶原溶液取材方便，将获得的 胶原溶液用冻干机直接冻干，制作过程简单，省去了将胶原经酸碱中和， 透析等复杂处理的步骤，减少了胶原材料接触有害试剂的机会，因此其使 用安全性大大提高。

3)本发明使用Hoechst将神经干细胞进行标记，能追踪神经干细胞量 在体内的变化情况。

附图说明

图1为本发明实施例1的胶原海绵形态图。

图2为本发明实施例2的神经导管。

图3为本发明实施例2中通过CCK-8检测细胞增殖与活性比较图。

图4为本发明实施例3中通过CCK-8检测细胞增殖与活性比较图。

图5为本发明实施例4中通过CCK-8检测细胞增殖与活性比较图。

图6为本发明实施例5中面神经损伤后功能恢复比较图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，本发明内容并不 限于所列实施例，研究人员根据上述内容对该神经支架进行的非本质改进 和调整，仍属于本发明的保护范围。

SD大鼠购自复旦大学实验动物部，动物心脏灌注用多聚甲醛购自 boster工程有限公司，去离子水购自invitrogen，冰醋酸购自国药集团化学 试剂有限公司，PBS购自hyclone，EDC和NHS购自sigma；bFGF和VEGF 购自peprotech；Hoechst购自sigma。

实施例1

1)购买180～220g的大鼠，将大鼠通过心脏灌注处死，剪下鼠尾，抽 取鼠尾中的银色尾腱放入去离子水，放于摇床上，温度4℃，转速 50～200rpm，反复洗涤5次，洗涤后的尾腱溶于0.05％～0.1％冰醋酸-PBS 中，温度4℃，静置2～5天，调整胶原浓度至10mg/ml。

2)取上层胶原溶液，放入模具中，将模具放入液氮冷冻，再放于 2.5L&6L冻干机经8～12小时冻干，得到胶原海绵，为三维胶原材料，孔 径为30～200μm，该胶原海绵形态参见图1。

3)利用电子束辐照对胶原海绵进行灭菌处理，处理条件为：12kGy ⁶⁰Co。

4)将肝素溶解于含有4mMEDC和2.5mMNHS的交联溶液中，肝 素的浓度为4mg/mL，将胶原海绵浸没于交联溶液中，于37℃下放置3～4 小时，最后用PBS洗涤4～8小时，去离子水洗涤4～8小时。

5)用滤纸吸去交联后胶原海绵中的水分，将胶原支架浸没于 450μg/mL的血管内皮生长因子(VEGF)溶液中构建胶原支架，37℃，1 小时，获得胶原支架。

6)原代培养神经干细胞

取孕19天左右孕鼠，在超净台内端头处死，取出端脑，使用弯剪将 端脑剪碎，加入0.05％的胰酶消化30分钟，使用胰酶抑制剂终止消化，将 消化后的混合液通过200目滤网，收集滤过液后，转速1800rpm，离心5 分钟，去掉上清，加入培养液培养，得到神经球后用0.05％胰酶将神经球 消化开得到分散的神经干细胞，将神经干细胞与Hoechst在37℃培养箱孵 育10分钟，以将神经干细胞进行标记，将5～10×10⁵个神经干细胞培养在 胶原支架上，获得所述的神经支架。

实施例2

1.用于神经损伤修复放入的神经导管的制备方法，包括如下步骤：

1)购买180～220g的大鼠，将大鼠通过心脏灌注处死，剪下鼠尾，抽 取鼠尾中的银色尾腱放入去离子水，放于摇床上，温度4℃，转速 50～200rpm，反复洗涤5次，洗涤后的尾腱溶于0.05％～0.1％冰醋酸-PBS 中，温度4℃，静置2～5天，调整胶原浓度至10mg/ml。

2)取上层胶原溶液，放入管状模具中，将模具放入液氮冷冻，再放于 2.5L&6L冻干机经8～12小时冻干，得到中空管状的胶原海绵，即胶原管。

胶原海绵为生长因子和神经干细胞的载体，因此，可在所获得的胶原管 的中空部分填充一些胶原海绵，以粘附更多的神经干细胞。

3)利用电子束辐照对胶原管进行灭菌处理，处理条件为：6kGy⁶⁰Co。

4)将肝素溶解于含有4mMEDC和2.5mMNHS的交联溶液中，肝 素的浓度为2mg/mL，将胶原管浸没于该交联溶液中，于37℃下放置3～4 小时，最后用PBS洗涤4～8小时，去离子水洗涤4～8小时。

5)用滤纸吸去交联后胶原管中的水分后将胶原管浸没在 50～500μg/mL的bFGF中成型，温度为37℃，时间为1小时，得到胶原支 架，即胶原导管。

6)原代培养神经干细胞

取孕19天左右孕鼠，在超净台内端头处死，取出端脑，使用弯剪将 端脑剪碎，加入0.05％的胰酶消化30分钟，使用胰酶抑制剂终止消化，将 消化后的混合液通过200目滤网，收集滤过液后，转速1800rpm离心5分 钟，去掉上清，加入培养液培养，得到神经球后用0.05％胰酶将神经球消 化开得到分散的神经干细胞，将神经干细胞与Hoechst在37℃培养箱孵育 10分钟，以将神经干细胞进行标记，将5～10×10⁵个神经干细胞培养在胶 原导管内，获得神经导管，见图2。

2.通过CCK-8检测细胞增殖与活性。

设3组神经支架平行实验，第一组为本实施例组，该组的神经支架中， 通过肝素将bFGF固定在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称HS-bFGF 组)；第二组为对比例组，该组的神经支架中，未使用肝素固定bFGF， 而是将bFGF简单孵在胶原支架上，培养有神经干细胞(简称bFGF组)； 第三组为对照组，该组的神经支架中，未含肝素和bFGF，仅以PBS作为 阴性对照孵在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称PBS组)。

将神经干细胞在上述三组的神经支架上培养7天，每天换液，在第7 天时通过CCK-8检测神经干细胞的增殖与活性。

检测步骤如下：

1)将上述三组样本分别放入多孔板，加入10％CCK8混合液。

2)放入37℃培养箱培养2小时。

3)吸出混合液，测定450nm吸光度。

结果参见图3，图中**表示P<0.01，由图3可以看出，神经干细胞的 增殖与活性在HS-bFGF组要明显高于bFGF组和PBS组，由于每天换液， bFGF组和PBS组中未固定的bFGF不断被扩散、丢失，不能有效地促进 神经干细胞增殖，bFGF组和PBS组神经干细胞增殖与活性较差。

实施例3

1.本实施例中用于神经损伤修复放入的神经导管的制备方法与实施例 2中神经导管的制备方法的区别在于胶原浓度为20mg/ml，交联溶液中交 联剂的浓度为：10mMEDC和5mMNHS，肝素的浓度为4mg/mL，bFGF 的浓度为500μg/mL，其余操作步骤同实施例2。

2.通过CCK-8检测细胞增殖与活性。

设3组神经支架平行实验，第一组为本实施例组，该组的神经支架中， 通过肝素将bFGF固定在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称HS-bFGF 组)；第二组为对比例组，该组的神经支架中，未使用肝素固定bFGF， 而是将bFGF简单孵在胶原支架上，培养有神经干细胞(简称bFGF组)； 第三组为对照组，该组的神经支架中，未含肝素和bFGF，仅以PBS作为 阴性对照孵在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称PBS组)。

将神经干细胞在上述三组的神经支架上培养7天，每天换液，在第7 天时通过CCK-8检测神经干细胞的增殖与活性。

检测步骤如下：

1)将上述三组样本分别放入多孔板，加入10％CCK8混合液。

2)放入37℃培养箱培养2小时。

3)吸出混合液，测定450nm吸光度。

结果参见图4，图中**表示P<0.01，由图4可以看出，神经干细胞的 增殖与活性在HS-bFGF组要明显高于bFGF组和PBS组，由于每天换液， bFGF组和PBS组中未固定的bFGF不断被扩散、丢失，不能有效地促进 神经干细胞增殖，bFGF组和PBS组神经干细胞增殖与活性较差。

实施例4

1.本实施例用于神经损伤修复放入的神经导管的制备方法与实施例2 中神经导管的制备方法的区别在于胶原浓度为7mg/ml，交联溶液中交联剂 的浓度为：1mMEDC和10mMNHS，肝素的浓度为3mg/mL，bFGF的 浓度100μg/mL，其余操作步骤同实施例2。

2.通过CCK-8检测细胞增殖与活性。

设3组神经支架平行实验，第一组为本实施例组，该组的神经支架中， 通过肝素将bFGF固定在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称HS-bFGF 组)；第二组为对比例组，该组的神经支架中，未使用肝素固定bFGF， 而是将bFGF简单孵在胶原支架上，培养有神经干细胞(简称bFGF组)； 第三组为对照组，该组的神经支架中，未含肝素和bFGF，仅以PBS作为 阴性对照孵在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称PBS组)。

将神经干细胞在上述三组的神经支架上培养7天，每天换液，在第7 天时通过CCK-8检测神经干细胞的增殖与活性。

检测步骤如下：

1)将上述三组样本分别放入多孔板，加入10％CCK8混合液。

2)放入37℃培养箱培养2小时。

3)吸出混合液，测定450nm吸光度。

结果参见图5，图中**表示P<0.01，由图5可以看出，神经干细胞的 增殖与活性在HS-bFGF组要明显高于bFGF组和PBS组，由于每天换液， bFGF组和PBS组中未固定的bFGF不断被扩散、丢失，不能有效地促进 神经干细胞增殖，bFGF组和PBS组神经干细胞增殖与活性较差。

可见，本发明中改变胶原溶液浓度、肝素浓度和生长因子浓度所得到 的神经支架中的神经干细胞的增殖与活性均优于简单使用生长因子和阴 性对照组。

实施例5.体内实验验证本发明的神经支架的神经损伤修复作用

选用成年雌性SD大鼠，体重200～220g，将大鼠麻醉后常规消毒铺单， 取左侧面部横行切口，切开皮肤，分离肌肉，结缔组织，暴露出面神经的 颊肌神经分支，剪去8mm长神经，然后用9-0的带针缝合线将本发明实施 例2的神经导管缝合在神经断端，将神经缺损连接起来。

在术后8周观察大鼠两侧胡须运动对面神经功能恢复经行评价。患侧 胡须无运动评为1分；患侧胡须有细微运动评为2分；患侧胡须运动比较 接近于健侧胡须运动幅度及频率评为3分；患侧胡须运动与健侧胡须运动 完全一致，评为4分(即面神经功能正常后恢复完全)。将患侧评分与健 侧评分的比值(vibrissaemovementratio)即恢复率做统计学分析，评分为 双盲实验，结果参见图6。

从图6可以看出，HS-bFGF组术后功能恢复率明显高于其它两组，该 结果与通过CCK-8检测细胞增殖与活性的实验结果趋势相同，HS-bFGF 组中，固定的bFGF一方面能促进神经干细胞增殖维持神经干细胞活性， 增强神经干细胞对神经损伤的修复作用，另一方面固定的bFGF自身在损 伤局部形成的有效浓度能有效促进神经再生，bFGF和神经干细胞相互协 同，共同促进大鼠面神经损伤后神经修复，而bFGF组中，由于生长因子 未经固定，在体内大量扩散丢失，因而在损伤局部的浓度较低，不能有效 促进促进神经干细胞增殖，对神经损伤的修复作用有限。