一种BRDT蛋白抑制剂在雄性抗生育中的应用

摘要

本发明公开了一种BRDT蛋白抑制剂在雄性抗生育中的应用，具体地本发明公开了一种BRDT蛋白小分子抑制剂在雄性抗生育中的应用，同时本发明还公开了一种以BRDT为靶标，利用计算机辅助虚拟筛选的理性化筛选抗生育药物的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及一种BRDT蛋白抑制剂 在雄性抗生育中的应用。

背景技术

在避孕节育技术发展如此成熟的今天，抗男性生育的避孕方式一直是生殖领 域的薄弱环节。目前研发的男性节育药包括激素类和非激素类，激素类男性节育 药以下丘脑-垂体-睾丸轴的负反馈调节为基础，主要机制为：外源性睾酮反馈性 抑制黄体生成激素和卵泡刺激素分泌；降低睾丸内睾酮的分泌水平，抑制精子发 生。非激素类男性节育候选物较多，作用机制包括干扰支持细胞功能；抑制顶体 酶、阻滞离子通道及影响精子活力表达等。但是迄今为止尚无成熟产品问世，有 效节育方法仅有体外排精、避孕套和输精管绝育术。

睾丸特异性含溴结构域蛋白(BRDT)是一种组织特异性的与染色质相关联 的蛋白质，它参与了睾丸中精子生成的染色质重组过程，在粗线期精母细胞、双 线期精母细胞和精子细胞中表达，在减数分裂之后，BRDT通过成对的乙酰基- 赖氨酸识别模块或溴结构域使高度乙酰化的组蛋白重组。它能够调节精母细胞中 的基因表达，并能促进减数分裂之后圆形精子细胞染色质核仁的形成和维持核仁 的结构状态。此外，BRDT在精子细胞伸长过程中其重要作用，BRDT的BD1 是精子细胞完成减数分裂所必需的因子。BRDT作为一种组织特异性蛋白，作为 抗生育药物的作用靶点具有潜在的应用价值。

JQ1是于2012年美国贝勒医学院的研究者发现的一种小分子化合物，可以 与人BRDT结合并以时间和剂量依赖性干扰精子的生成，它作用于减数分裂期 及减数分裂后期的精子细胞，导致精子生成和运动能力受阻。尽管JQ1的抗生育 作用具有良好的可逆性，但是它可能出现生物利用度低的缺点，因此仍需要开发 以BRDT为靶标的新的化合物，但是我国目前尚无关于BRDT抑制剂的研究， 积极开发BRDT抑制剂具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种BRDT蛋白抑制剂在男性抗生育中的应用，为 了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种BRDT蛋白抑制剂在制备雄性抗生育药物组合物中的用 途。

进一步，所述蛋白抑制剂与BRDT的溴结构域相结合。

进一步，所述蛋白抑制剂为BRDT蛋白的小分子抑制剂。

进一步，所述小分子抑制剂为T225。

本发明提供了一种抗生育药物组合物，所述药物组合物包括T225或其药学 上可接受的盐或其异构体或其水合物或溶剂化物，只要具有T225的活性即可。 所述药学上可接受的盐包括但不限于碱金属盐或碱土金属盐如钠盐、钾盐、钙盐、 镁盐、钙盐；氢卤酸盐如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐 如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐如甲酸盐、醋酸盐、丙酸盐、 草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬 酸盐、酒石酸盐、碳酸盐、苦味酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐；有机碱盐如甲胺盐、 乙胺盐、单乙醇铵盐、二乙醇铵盐、三乙醇铵盐、环己基胺盐；氨基酸盐如谷氨 酸盐、天冬氨酸盐、赖氨酸盐。

进一步，所述抗生育药物组合物还包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、粘 合剂、润滑剂、矫味剂、表面活性剂、包衣材料等中的一种或几种。这类试剂包 括(但并不限于)：稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合 剂如单糖浆、淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、 甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷 酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；润滑剂如 硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼 酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、月桂醇硫酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、十 二烷基硫酸镁、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸镁；矫味剂如甘露醇、木糖醇、甜 菊甙、乳糖、果糖、蔗糖、蛋白糖、麦芽糖醇、甘草甜素、环己氨基磺酸钠、明 胶、阿斯巴甜、香蕉香精、菠萝香精、香兰素、香橙香精、桔子香精、薄荷香精、 人参香精、草莓香精、枸橼酸、柠檬酸；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪 酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇；包衣材料如明胶、阿拉伯 胶、海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素盐、醋酸纤维素酞酸酯、乙基纤维素、甲 基纤维素、羟丙甲基纤维素、丙烯酸树脂类、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙 二醇。

所述药物组合物还可包括填充剂如淀粉、蔗糖、甘露醇(粒状或粉状)、木 糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、 糊精；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧 甲基纤维素钠、大豆多糖、干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸 钙和碳酸氢钠等；湿润剂如甘油；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等； 吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土；泡腾剂如苹果酸、柠 檬酸或枸橼酸与碳酸氢钠或碳酸钠等；稳定剂如人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及 纤维素衍生物；糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖，甘露醇、纤维醇、 木糖醇等糖醇，蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖；葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、 透明质酸等多聚糖。纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、 羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

所述抗生育药物组合物的接受体为雄性哺乳动物，如人、猴、鼠、兔等。优 选的，所述哺乳动物为人。

所述抗生育药物组合物可以通过任何途径给予受体，所述途径包括(但不限 于)腹腔内给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、鼻 内给药、肺内给药、直肠内给药。

优选的，所述抗生育药物组合物的给药方式为口服。

本发明所述的药物组合物的核心可以制备成以下形式：粗颗粒、细颗粒、珠 子、球体珠、圆粒、涂覆珠、涂覆圆粒、涂覆颗粒，以及药学上可接受的形状和 尺寸。这些可以多种造粒方法与其他方法来制作，诸如湿式与干式造粒法。所述 抗生育药物组合物的单位剂型可以使用多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如 片剂、丸剂、粉剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如溶液、悬浮液、乳状液、 糖浆、酏剂等。

本发明提供了一种筛选上述BDRT蛋白抑制剂的方法，其特征在于，筛选步 骤如下：

(1)构建人BRDT小分子抑制剂药效团模型

从PDB数据库下载人BRDT与JQ1共结晶活性构象的三维立体结构文件， 输入到DiscoveryStudio3.0的药效团构建模块，利用DiscoveryStudio3.0对 BRDT活性构象立体结构进行加氢和除水的处理，设置各参数，根据乙酰-赖氨 酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别活性位点，然后依据和受体的相 互作用模式对所有的作用位点进行聚类，得到可用于虚拟筛选的药效团模型；

(2)使用利平斯基五规则和ADMET预测对化合物库进行类药性预测；

(3)基于药效团模型对化合物库进行虚拟筛选

将构建好的药效团模型作为3D提问结构输入对大型化合物数据库进行高通 量虚拟筛选，保留匹配一半以上药效特征元素的化合物，然后再次通过利平斯基 五规则进行过滤；

(4)基于分子对接对化合物库进行虚拟筛选

利用Libdock进行对接研究，采用相同的BRDT的活性构象的三维结构和 Charmm力场，定义对接位点，将JQ1对接到BRDT活性位点，以对接构象是否 满足催化机制为依据进行打分函数的选择和参数优化；

(5)体外蛋白水平的筛选

使用BRDTBromodomainTR-FRETAssay试剂盒进行化合物的体外检测；

(6)对阳性化合物与BRDT蛋白进行量效关系检测；

(7)对阳性化合物进行分子对接检测；

(8)对阳性化合物进行ADMET预测。

进一步，步骤(1)中的参数设置为：亲脂性位点密度参数为15，极性位点 参数为20；最小结构特征的参数为4，最大参数特征的参数为6。

进一步，步骤(4)中的对接位点定义为一个以活性位点为中心的直径的球形，这个球形足以覆盖BRDT与JQ1结合位点的关键氨基酸残基。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次建立了一种理性化筛选男性抗生育药物的方法，以人BRDT为 靶点，利用计算机辅助虚拟筛选，减少了人力、物力，缩短了实验周期，大大降 低了药物研究成本。

本发明首次发现了针对BRDT的一种小分子抑制剂T225，所述小分子抑制 剂能与BRDT的溴结构域特异性结合，安全、有效、可逆的实现男性抗生育的 目的。

附图说明

图1显示了BRDT抑制剂的最终药效团模型，其中，图A显示了实验计算得到的最 佳药效团模型；图B显示了药效团模型的3D空间关系和几何参数。

图2显示了药效团模型的结构特征，其中，图A显示了药效团模型和起作用的氨 基酸残基，图B显示了药效团模型与JQ1的匹配结果；图C显示了药效团模型同 BRDT-JQ1晶体复合物的匹配结果。

图3显示了BRDT的活性位点，其中条带代表BRDT蛋白链。

图4显示了JQ1和BRDT的对接图，其中条带代表BRDT蛋白链，棒状结构代表JQ1。

图5显示了JQ1与BRDT蛋白的量效关系。

图6显示了化合物T225的结构式。

图7显示了化合物T225与BRDT蛋白的量效关系。

图8显示了化合物T225的ADMET性质预测。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例仅用 于解释本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1药效团模型的构建

1、方法

从PDB数据库下载人BRDT与JQ1共结晶活性构象的三维立体结构文件输 入到DiscoveryStudio3.0软件；利用DiscoveryStudio3.0的药效团构建模块构建 基于BRDT与JQ1复合物相互作用方式的药效团模型，移除水分子、添加氢键 形成受体结构；设定各参数条件，将最小结构特征和最大结构特征的参数分别设 置为4和6，亲脂性位点密度参数设为15，极性位点参数设为20；根据乙酰-赖 氨酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别活性位点，对所有的作用位点 进行聚类，得到用于虚拟筛选的药效团模型；分析最终的药效团模型的作用残基 及结构特征；

2、结果

BRDT抑制剂的最终药效团模型如图1所示，该药效团模型包含5个特征元 素、一个氢键供体特征(HBD)、4个疏水作用结构特征和14个排除体积特征。 药效团模型的结构特征如图2所示，在该药效团模型中起作用的氨基酸残基有保 守氨基酸残基ASN109、ILE115、LEU61、PHE52、MET118、ASP114，JQ1与 该药效团特征能够很好的匹配，JQ1的三唑环与BRDT活性中心的保守氨基酸残 基Asn109之间形成的氢键，四个疏水结构特征H1、H2、H3和H4分别与JQ1 的甲基、噻吩环、苯环和叔丁基相匹配。这些疏水结构特征对应于BRDT活性 位点的疏水区域，该疏水区域主要由氨基酸残基Trp50、Pro51、Phe52、Leu61、 Leu63、Leu115和Met118组成。

实施例2类药性预测

1、材料

中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室的化合 物数据库和自主研发的微生物天然产物数据库MNPD。

2、方法

使用利平斯基五规则对来自化合物库的80000个化合物进行筛选，筛除有毒 性基团和活性基团的化合物；对经过利平斯基五规则筛选的化合物进行水溶性、 人类小肠吸收性、血耐屏障透过性、细胞色素P4502D6抑制性、肝脏毒性、血 浆蛋白结合率的性质预测，选择相对分子质量在500以下、计算脂水分配系数 CLgP小于5、氢键给体不超过5个、氢键受体不超过10个的化合物，使得所筛 选出的化合物拥有良好吸收性可溶性、非肝脏毒性、不同级别血脑屏障透过性和 血浆蛋白结合性。

3、结果

利用利平斯基五规则筛选出78300个化合物，对化合物性质进行ADMET预 测，进一步筛选出76984个化合物进行后续的研究。

实施例3基于药效团模型的虚拟筛选

将构建好的药效团模型作为3D提问结构输入经利平斯基五规则过滤和 ADMET预测的化合物数据库(76984)进行高通量虚拟筛选；保留匹配一半以 上药效特征元素的化合物；最终筛选出270个符合条件的化合物。

实施例4基于分子对接的虚拟筛选

1、受体的准备

(1)清理修复蛋白

在FilesExplorer中打开人BRDT的PDB文件4FLP；

在“ProtocolsExplorer”中打开“GeneralPurpose”，双击“PrepareProtein”； 打开“InputProtein”，选中4FLP蛋白质分子，将BuildLoops，Protonate都选 为True；

点击运行按钮开始配体优化，一个新的运行档将在工作浏览器中出现；

结果分析：输出档中包括：均方差文件4FLP_RMSD.log； 力场文件4FLP_charmm.log；预测的pK值文件4FLP.pK；处理好的蛋白质结构 文件4FLP_prep.dsv；滴定曲线数据文件4FLP.csv；输入档中包括：需要优化的 蛋白质文件4FLP.dsv；执行的命令文件Protocol.pr_xml。

(2)定义受体分子

在系统视图中，打开档4FLP_prep.dsv；

展开<Cell>，点击选择4FLP_prep；

在工具浏览器中从下拉列表中选择并打Receptor-LigandInteractions工具面 板；

在DefineandEditBindingSite工具面板下的Define工具组中点“Define SelectedMoleculeasReceptor”将前面选择的蛋白分子4FLP定义为受体分子。

(3)定义活性位点

因4FLP是BRDT与小分子化合物JQ1共结晶的三维晶体结构，从图中将小 分子配体JQ1删去，BRDT的活性位点就暴露出来，选择活性区域的球直径为 命名为4FLP_res1。

2、配体准备

(1)导入化合物数据库的结构文件secA270在流程浏览器中，打开General Purpose，双击PrepareLigands；

(2)在打开的PrepareLigands方法中修改参数，在“InputLigands”中输入 secA270，其他参数采用默认值；

(3)点击运行按钮开始配体优化；

(4)在输出档中的配体档secA270是选定的参数应用于配体后的结果；

(5)在输入档中的secA270是需要优化的配体；Protocol.pr_xml是执行的指 令。

3、分子对接

(1)在DS窗口中打开蛋白和配体文件

在DS文件浏览器中，打开文件4FLP_prot.dsv；

在DS档浏览器中找到优化后的配体数据文件secA270.sd，将其拖拽到受 体蛋白所在的三维窗口。

(2)对受体及配体分子赋力场参数

从工具浏览器的下拉列表中选择“Receptor-LigandInteractions”；

打开“Receptor-LigandInteractions”工具栏；

在SimulateStructures|Forcefield工具栏中从下拉列表中选择；CHARmM点 击ApplyForcefield，给受体及小分子配体赋力场；

配体赋好力场后工具浏览器的力场状态显示为：4FLP_prottypedwith CHARMm；

打开刚性对接流程，在参数浏览器中点击InputTypedProteinMolecule参 数，然后从下拉菜单中选择4FLP_prot：1err_prot；

点击InputLigands从下拉菜单中选择secA270：All；

点击InputSiteSphere参数格，从下拉菜单中选择对接区域的坐标；

点击SelectedResidues参数格，从下拉菜单中选择“4FLP_res1”，这一操 作将选择活性部位的一组氨基酸残基，这些氨基酸残基已经预先被选上且定义为 4FLP_res1组；

展开GenerateProteinConformations参数组，点击MaximumNumber参数， 输入数值2；

展开GenerateLigandConformations参数组，点击ConformationMethod参 数，从下拉菜单中选择fast方法；

展开Docking参数，点击参数MaxHitstoSave设置最多保存结果为3。

(3)在流程工具栏，点击运行按钮，等待对接完成。

4、分子对接结果浏览

在工作浏览器中，双击刚完成的任务；

在视图窗口中打开Report.htm文件，在Html窗口中的输出文件(Output Files)部分，点击ViewResults连结，打开对接结果；

点击卷标启动结果窗口按“CTRL+1”隐藏流程浏览器和作业浏览器，按 CTRL+H打开系统视图；

在系统视图中，勾选SBD_Receptor，蛋白所有氨基酸残基都显示出来；

点击浏览表格浏览器中上下键浏览对接的配体构象，随着鼠标点击表格浏览 器中的不同配体对接姿态，视图窗口中的配体对接姿态会随之更新；

在工具浏览器中从下拉列表中选择Receptor-LigandInteractions；

在VisualizeReceptor-ligandInteractions工具面板下点击Receptorligand HydrogenBonds；

在视图窗口中，受体原子与配体对接状态间的氢键通过绿线显示出来；

在表格浏览器中，继续点击剩下的配体对接姿态，这样对接姿态将被添加到 系统视图中并逐一在图形视图中显示出来；

4FLP_res1参数识别出的氨基酸残基侧链构象将随着配体姿态的变化而变 化。

5、分析配体对接结果

在窗口中打开4FLP配体的晶体构象，按CTRL+1使DiscoveryStudio浏览 器恢复通常状态。在档浏览器中找到A链的Site1，右键点击，选择OpenWith |3DWindow，4FLP配体的晶体构象将在一个新的三维窗口中打开。

在DS三维窗口中打开所有对接产生的对接构象，在档浏览器中，打开对 接作业输出文件夹。将晶体构象定义为结构比较的参考构象，在系统视图中，点 击第一个配体构象(4FLP配体)选择它，这个构象即对应晶体构象。从菜单中 选择Structure|RMSD|SetReference，将4FLP晶体构象设置为RMSD计算的 参考构象。

在菜单中选择Structure|RMSD|HeavyAtoms，逐个排查和计算对接产生的 姿态与晶体姿态的差异。

6、结果

BRDT蛋白的活性位点如图3所示，JQ1与BRDT的活性口袋按照libdock 模块进行对接如图4所示，得分值为118.924，以此分值作为确定阳性化合物的 标准。将初筛得到的270个化合物与BRDT的活性口袋按照libdock对接方式进 行虚拟对接，筛选出打分值高于阳性对照的化合物为125个。

实施例5JQ1与BRDT的量效关系

1、方法

将JQ1化合物进行3倍梯度稀释；将5μl样品与10μlBRDT溴结构域铕螯 合物混合，室温下孵育15min进行预平衡；加入5μl的BRDT溴结构域配体/APC 受体混合物引发反应；将板子用铝箔密封在室温孵育1h，检测620nm和670nm 发射光的数值。

2、结果

实验结果如图5所示，随着JQ1浓度的增大，JQ1对人BRDT蛋白结合的 抑制作用增加，其IC₅₀为133nM。

实施例6化合物蛋白水平筛选

1、待测样品预处理

(1)取5mg纯品化合物溶到500μlDMSO中；

(2)筛选的化合物样品用1×TR-FRETAssayBuffer稀释10倍。

(3)阳性化合物JQ1用1×TR-FRETAssayBuffer溶解至四倍的终浓度 10μM。

2、化合物的检测

(1)将5μl样品与10μlBRDT溴结构域铕螯合物混合，室温下孵育15min 进行预平衡；

(2)加入5μl的BRDT溴结构域配体/APC受体混合物引发反应，反应体系 如下面表1所示；

表1筛选模型检测体系

(3)将板子用铝箔密封在室温孵育1h，检测620nm和670nm发射光的数 值。

3、数据分析

以TR-FRET比值(670nm发射光/620nm发射光)计算样品与BRDT蛋白的 亲和力，TR-FRET比值越低，样品与BRDT蛋白的亲和力越强。

4、结果

定义化合物浓度为100μM时抑制率大于30％的化合物为阳性化合物，经过 筛选，得到一抑制率为44.39％的化合物T225，结构式如图6所示。

实施例7T225与BRDT蛋白的量效关系

1、方法

将T225化合物进行2倍倍比的稀释；将5μl样品与10μlBRDT溴结构域铕 螯合物混合，室温下孵育15min进行预平衡；加入5μl的BRDT溴结构域配体/APC 受体混合物引发反应；将板子用铝箔密封在室温孵育1h，检测620nm和670nm 发射光的数值。

2、结果

实验结果如图7所示，随着T225浓度的增大，T225对人BRDT蛋白结合 的抑制作用增加，其IC₅₀为32.12±0.63μM。

实施例8T225与BRDT活性位点的分子对接

按照实施例4所述的方法，进行T225与BRDT蛋白活性位点的分子对接； 结果T225与BRDT蛋白活性位点的虚拟对接分数为119.362。

实施例9T225的ADMET性质预测

1、导入T225化合物文件

在文件菜单中新建BRDT_inhibitors.sd文件，使用DS3.0的“构建与编辑” 模块构画2个已知结构的BRDT抑制剂，构画完成后显示在BRDT_inhibitors MoleculeWindow中。

2、选择计算性质，运行计算流程

在protocols浏览器中，打开ADMET文件夹，双击ADMETDescriptors， 打开参数浏览器。在“InputLigands”右边的栅格中，选择“BRDT_inhibitors”， 选择T225化合物。在“ADMETDescriptors”右边栅格中勾选所有性质，此操作 将计算T225化合物的所有ADMET性质。

3、运行预测

点击Protocolstoolbar中的运行按钮开始预测，等待运行完成后，双击任务 浏览器中刚完成的作业，打开Report.htm，点击该档中Output部分的ViewResults 连结，打开计算的结果。

4、分析预测结果

结果档中包含了预测的6种ADMET性质(25℃下水溶解度、血脑屏障通透 性、细胞色素P4502D6抑制性、肝毒性、人类肠道吸收性和血浆蛋白结合率) 的数值和该数值所对应的级别。

5、结果

实验结果如图8所示，纵坐标从0到3依次代表很好、适中、差和极差，从 图中可以看出化合物T225的血脑屏障通透性(BBB)相对较差，人类肠道吸收 性(HIA)较好，在25℃水溶解度(SOL)较差，无细胞色素P4502D6抑制性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。