一种乌骨鸡肤色性状相关的SNP分子标记及应用

摘要

本发明提供了一种SNP分子标记在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示，第171？bp处碱基突变类型为A/G。本发明还提供了用于检测该SNP位点的引物序列及PCR-RFLP方法，根据DraI酶切后、电泳条带的不同可区分位点的基因型，进而判断样本Fm基因的纯合与杂合。出现342？bp一条带，为GG纯合基因型；出现171？bp、342？bp两条带，为AG杂合基因型；出现171？bp一条带，为AA隐性纯合基因型。利用本发明所提供的SNP标记和检测方法，在乌骨鸡的雏鸡阶段就可以判断个体基因型，做到肤色性状的早选择早淘汰，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测与乌骨鸡肤色性状相关的Fm基因纯合与杂合的SNP标 记，属农业生物技术领域。

背景技术

乌骨鸡在我国的饲养历史非常悠久，通常具有乌皮、乌骨、乌肉等特征，是我国传 统的、珍奇的药食两用鸡种，据明代《本草纲目》记载“其性甘、平、无毒，补虚劳嬴弱，治消 渴，益产妇，治女人崩中带下，一切虚损诸病”，因此深得消费者青睐。乌骨鸡品种主要有泰 和丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、江山乌骨鸡等，均是当前乌骨鸡育种中常用的优秀素材，但 随着外来鸡种的引入及血缘混杂，乌骨鸡群体中存在着黑肤不全不纯的情况。例如，据对东 乡绿壳蛋鸡保种群的肤色观察，群体肤色以黑色或浅黑色为主，少数个体为白色，这种情况 影响到后期杂交利用的肤色整齐度和均匀性。

已有研究表明，鸡的黑色肤色为质量性状，是由单基因Fm(Fibromelanosis，纤维 化黑色变)控制的常染色体显性遗传。因此，无法根据个体的表型来判断其基因型是否纯 合，虽然通过与白色肤鸡种测交可以进行验证，但测交周期长、耗资大，难以做到全群实施。 现代分子生物技术的迅猛发展为解决这个问题提供了可能。据基因组研究，Fm基因位于鸡 20号染色体的10.3-13.1Mb区域，包含了由417Kb中间区域间隔的两段重复碱基序列，其中， 第一段重复序列有EDN3、ATP5E等功能基因；中间区域有GNAS、STX16、ANKRD60等功能基因。 另一方面，物种DNA序列的单核苷酸突变(SNP)是继微卫星之后的新一代遗传标记，数量多 且分布广泛、稳定性高。因此，通过对Fm基因区间的SNP筛选和标记，可以方便准确地鉴定候 选个体的基因型，从而有效加快育种进程，降低育种成本。

发明内容

本发明提供了一种与乌骨鸡肤色性状相关的Fm基因纯合与杂合的SNP分子标记及 其检测方法。

本发明对家鸡基因组(NC_006107.3)20号染色体的Fm基因区段进行单核苷酸多态 性检测，得到1个与乌骨鸡肤色性状相关的SNP分子标记，该分子标记位于核酸序列SEQID No.1所示第171bp处，突变碱基为A/G。

本发明首先提供了SNP分子标记在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，其特征在于，所 述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，第171bp处碱基突变类型为A/G。

另外，本发明提供了一种引物对在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，其特征在于，所 述引物对的DNA序列为：

F5’-ACGACAGCAGGAAACGT-3’

R5’-TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT-3。

本发明的第三个目的在于提供用于判断乌骨鸡Fm基因纯合或杂合的SNP检测方 法。

乌骨鸡肤色性状检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以待测样本的基因组DNA为模板，利用引物对通过PCR方法扩增目标序列；所述 引物对的DNA序列为：

F5’-ACGACAGCAGGAAACGT-3’

R5’-TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT-3；

(2)利用限制性内切酶DraI对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离；

(3)SNP分子标记第171bp处碱基A/G突变位点为GG纯合时，酶切产物电泳出现 342bp一条带；A/G突变位点为AG杂合时，出现171bp、342bp两条带；A/G突变位点为AA纯合 时，出现171bp一条带。

(4)所述SNP分子标记用于判断乌骨鸡肤色Fm基因的纯合与杂合，GG代表Fm基因纯 合；AG代表Fm杂合；AA代表Fm隐性纯合。

SNP分子标记与检测方法可在辅助选育乌骨鸡肤色性状的过程中应用，通过标记 检测，能够区分出同样表现黑肤外观的Fm纯合与杂合型乌骨鸡。根据DraI酶切后、电泳条带 的不同可区分位点的基因型，进而判断样本Fm基因的纯合与杂合。出现342bp一条带，为GG 纯合基因型；出现171bp、342bp两条带，为AG杂合基因型；出现171bp一条带，为AA隐性纯合 基因型。利用本发明所提供的SNP标记和检测方法，在乌骨鸡的雏鸡阶段就可以判断个体基 因型，做到肤色性状的早选择早淘汰，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实 用价值。

附图说明

图1为SEQIDNo.1的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

图2为SNP标记的DraI酶切产物琼脂糖凝胶电泳图

图3为SNP标记的各基因分型的测序峰图

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。

实施例1黑色素主效基因Fm的SNP分子标记检测方法

1、实验仪器设备

超低温冰箱(Thermo，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf5417R，德国)；梯度PCR 仪(ABIPCRsystem9700，美国)；可调式微量移液器(Eppendorf，德国)；GELEQ电泳凝胶 成像系统(Bio-Rad，美国)；紫外可见分光光度计(BioSpec-nano，日本)。

2、鸡血液基因组DNA提取

采集鸡翅静脉血液，于75％乙醇中保存。用AxyPrep总血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen，美国)提取鸡血液全基因组DNA。提取后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；紫外 可见分光光度计测定DNA浓度。

3、引物设计

针对NCBI数据库Gallusgallus基因组(NC_006107.3)20号染色体的Fm基因区段 设计特异性引物，引物信息见表1。扩增产物的核酸序列见SEQIDNo.1。

表1引物信息

4、实时荧光定量PCR扩增

以样本DNA为模板，用PCR仪进行扩增。PCR反应体系为：DNA20ng，2×TaqPCR MasterMix12.5μL，上下游引物各10μM，加水补至25μL。反应条件为：94℃5min，然后进入 PCR循环，94℃30sec，57℃30sec，72℃40sec，35个循环；最后72℃延伸10min。反应完全 后，取扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，确保产物单一且大小正确，电泳结果见附图1。

5、RFLP酶切

将PCR产物用限制性内切酶DraI进行酶切，酶切位点位于SEQIDNo.1的第171bp 处。反应体系为：PCR产物5μL，10×buffer2μL，酶1μL，加水补至20μL。37℃酶切1h。酶切产 物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统分析成像结果。

6、结果与分析

该SNP位点位于鸡20号染色体的11310233碱基，此处A/G类型突变会引起DraI酶切 的不同。DraI等位酶切SEQIDNo.1序列后，片段大小为171bp，因此：若PCR-RFLP只检测到 一条带，且分子量大小为342bp，表明该SNP位点的等位基因是GG纯合型；若检测到两条带， 且大小分别为342bp、171bp，表明该位点等位基因是AG杂合型；若只检测到171bp一条带，表 明该位点等位基因是AA隐性纯合型。三种SNP分型的酶切电泳结果见附图2。7、测序对照

将三种基因型的PCR产物回收后进行DNA测序，测序结果见附图3。根据测序峰图与 根据酶切条带的判断结果是一致的。

实施例2东乡绿壳蛋鸡的肤色测交验证试验

1、试验材料与方法

东乡绿壳蛋鸡是原产于江西省的地方乌骨鸡种，群体肤色以黑色或浅黑色为主， 少数个体为白色，表明存在Fm基因的纯合与杂合。试验在东乡绿壳蛋鸡保种群中随机选择 23只公鸡，采集翅静脉血液提取基因组DNA，按照实施例1中的步骤进行检测。根据测定结 果，选择三种基因型的东乡公鸡共计12只，以1:6的配种比例与72只兴安麻鸡(广西省地方 鸡种，白肤、黑胫)进行测交，种蛋孵化出雏后，观察并记录子代肤色。

2、结果与分析

东乡绿壳蛋鸡的SNP检测结果表明：23只公鸡中，判断为GG基因型的有6只，表明其 Fm基因纯合；判断为AG基因型的有14只，表明其Fm基因杂合；判断为AA基因型的有3只，表明 其Fm基因隐性纯合。这一检测结果基本与东乡群体的肤色现状相符。

测交公鸡的酶切电泳图参见图2，其SNP位点基因型与子代肤色统计如表2所示。12 只东乡公鸡中，判为GG基因型的有3只，其81只测交子代的肤色均为黑色；判为AG基因型的 有7只，其209只测交子代的黑肤和白肤比例分别为56.0％和44.0％，经卡方检验二者差异 不显著；判为AA基因型的有2只，其52只测交子代均为白色肤。三种基因型的肤色测交验证 结果与理论结果保持一致。

表2测交试验数据

实施例3SNP标记检测方法在不同鸡种中的应用

1、实验材料与方法

分别选择江山乌骨鸡、伊莎B系蛋鸡、伊莎D系蛋鸡、“东乡×伊莎B”杂交组合鸡、 “东乡×兴安”杂交组合鸡若干只，采集翅静脉血液提取基因组DNA，按照实施例1中的步骤 进行检测。根据酶切电泳结果判断样本的SNP基因型，并采用卡方检验进行相关分析。

2、结果与分析

各鸡种的SNP标记检测结果见表3。

表3不同鸡种的SNP分型结果

江山乌骨鸡原产于浙江省江山市，片状白羽，乌皮、乌肉、乌骨，为Fm基因纯合型的 乌骨鸡参考鸡种，检测发现群体中的基因型以GG为主；伊莎B系、伊莎D系蛋鸡为国外引进鸡 种，白色皮肤，为Fm隐性纯合的参考鸡种，检测发现均为AA基因型；试验中“东乡×伊莎B”、 “东乡×兴安”杂交组合的父本都选用东乡Fm纯合型公鸡，子代为Fm杂合的参考鸡种，检测 到的基因型基本为AG型。这些检测结果经卡方检验均与理论结果相符，表明该标记检测方 法可用于育种实践。

<110>杭州市农业科学研究院

<120>一种乌骨鸡肤色性状相关的SNP分子标记及应用

<130>

<160>3

<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

<213>黑色素主效基因Fm

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

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